Name: use of a monocyte monolayer assay to evaluate fc&#947; receptor-mediated phagocytosis
Uploaded: 2017-01-02T13:00:00
Duration: 6 min 27 s
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The authors thank the Canadian Blood Services for a Graduate Fellowship Program Award to T.N.T. This research received financial support from the Canadian Blood Services' Centre for Innovation, funded by the federal government (Health Canada) and the provincial and territorial ministries of health. The views herein do not reflect the views of the federal, provincial, or territorial governments in Canada.

Obtenir l&#39;approbation pour l&#39;utilisation d&#39;échantillons humains par l&#39;éthique de la recherche conseil / comité d&#39;examen institutionnel, et obtenir le consentement signé de tous les donneurs humains. Le MMA peut également être effectuée en utilisant des PBMC de souris d&#39;une manière similaire à l&#39;essai humain, après l&#39;approbation utilisation des animaux d&#39;éthique. MMA utilise des techniques de culture tissulaire aseptiques. NOTE: Voir Figure 1. NOTE: Bien que nous recommandons l&#39;utilisation d&#39;un bioconfinement armoire de niveau 2 au cours de l&#39;essai pour maintenir une technique aseptique, la méthode est seulement un &quot;court terme&quot; méthode de culture, il n&#39;y a pas vraiment assez de temps pour les bactéries de contaminer le dosage. Par conséquent, si un bioconfinement armoire de niveau 2 n&#39;existe pas, plutôt que d&#39;acheter un juste pour ce test, le test pourrait être effectué en dehors d&#39;une armoire bioconfinement, sur un banc ouvert. L&#39;utilisation d&#39;un incubateur à 37 ° avec 5% de CO 2, cependant, ne sont pas une option et doit être utilisé pourdes résultats optimaux. 1. mononucléaires du sang périphérique de cellules d&#39;isolement <ol><li> Obtenir du sang entier humain provenant d&#39;un donneur sain ou d&#39;un patient par l&#39;intermédiaire d&#39;une ponction veineuse en utilisant des tubes Vacutainer contenant de l&#39;acide citrate dextrose (ACD), un anticoagulant (jaune-tubes supérieurs). REMARQUE: Le sang entier peut être stocké dans l&#39; ACD à la température ambiante (18-22 ° C) pendant jusqu&#39;à 36 heures avant de procéder à l&#39;étape suivante 11. Normalement, 1-2 10 mL vacutainer tubes de sang total sont suffisants pour le dosage. </li><li> On dilue le sang entier 1: 1 v / v dans un milieu RPMI complet chaud (RPMI-1640 supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, 20 mM d&#39;HEPES, et 0,01 mg / ml de gentamicine). </li><li> Isoler les cellules mononucléées du sang (PBMC) à partir du sang total dilué en utilisant la centrifugation en gradient de densité, tel que recommandé par le fabricant (voir la liste des matériaux). Couche du sang dilué très lentement sur le gradient de densité (réchauffé à la température ambiante, 18-22 ° C). REMARQUE: Réduire la quantité de mixing à l&#39;interface pour la séparation optimale du sang en superposant soigneusement le mélange de sang dans un goutte à goutte ou à l&#39;aide d&#39;une pipette. <ol><li> Laisser le mélange de sang à la couche lentement sur la partie supérieure du gradient de densité en plaçant la pointe de la pipette proche du gradient de densité et en permettant le mélange de sang à couler sur le côté du tube très lentement. </li><li> En fonction de l&#39;échelle de l&#39;expérience, la couche 10 ml de mélange de sang au-dessus de 3 ml de gradient de densité (dans un tube de 15 ml) ou de la couche 35 ml de mélange de sang au-dessus de 15 ml de gradient de densité (dans 50 ml tube). Typiquement, 10 ml de sang entier on obtient 10 millions de PBMC, avec une certaine variation donneur de donneur. Remarque: il est important qu&#39;il n&#39;y ait pas de mélange du mélange du sang avec le gradient de densité. Le mélange de sang devrait couche sur le gradient de densité et augmenter lentement jusqu&#39;à ce que tout le sang est au-dessus du gradient de densité. </li><li> Centrifuger le mélange en couches à 700 g pendant 30 min sans freins. Le centrmélange ifuged devrait se séparer en 5 couches (de haut en bas): plasma, buffy coat (contenant CMSP), matériau de gradient de densité, granulocytes et hématies. </li><li> Retirer et jeter la majorité du plasma et de récupérer soigneusement le contenu buffy coat (CMSP) dans un nouveau tube de 15 ml à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur et une ampoule d&#39;aspiration. REMARQUE: Le retrait de la couche leuco-plaquettaire est effectivement fait en appliquant une aspiration sur la pipette Pasteur tout en effectuant un mouvement circulaire autour de l&#39;extérieur de la couche, avec la pointe de la pipette contre le tube. </li></ol></li><li> On lave les PBMC isolées à trois reprises pH 7,3 tampon phosphate salin (PBS) par centrifugation à 350 g pendant 10 minutes (avec des freins pleins) entre les lavages. Reconstituer le culot PBMC dans un milieu complet RPMI. En fonction de la taille de la pastille, 3-7 ml de milieu est suffisante. </li><li> Comptez le PBMC en utilisant du bleu trypan et un hémocytomètre. compter Seules les cellules qui ne sont pas colorées par le bleu trypan. Reconstitute PBMC à 1.750.000 cellules / ml dans un milieu RPMI complet. </li><li> Seed 400 pi (700.000 cellules) dans chaque puits d&#39;une lame de 8 chambre. Incuber la lame dans un 37 ° C, entièrement humidifiée incubateur de culture tissulaire (supplémenté avec 5% de CO2) pendant 1 heure pour permettre aux monocytes / macrophages adhèrent. </li></ol> 2. Pré-traitement des monocytes adhérées REMARQUE: Cette étape est nécessaire uniquement si la recherche de moyens pour inhiber ou améliorer la phagocytose. <ol><li> Pré-traitement adhéré monocytes avec tout médicament (s) ou le composé (s) d&#39;intérêt. Reconstituer le médicament (s) ou d&#39;un autre matériau d&#39;essai à la concentration souhaitée en utilisant un milieu RPMI complet. REMARQUE: par exemple, 200 pg / ml d&#39;IgIV est généralement utilisé pour produire une inhibition de 95-100% de la phagocytose lors de l&#39;utilisation des monocytes humains. </li><li> Aspirer et éliminer le surnageant contenant toutes les cellules non adhérentes de la glissière 8-chambre après 1 heure d&#39;incubation (après l&#39;étape 1.6). Remplacez-le par 400ul d&#39;un médicament ou d&#39;un autre traitement et incuber pendant 1 h à 37 ° C. <ol><li> Lors de l&#39;aspiration et le remplacement de solutions dans la glissière 8-chambre, assurez-vous de contrôler l&#39;écoulement des fluides de sorte que les cellules faiblement adhérentes ne décollent. En outre, travailler avec seulement 2-3 puits vides à la fois et éviter le dessèchement des puits. NOTE: En règle générale, chaque traitement est réalisé en triple exemplaire technique. </li></ol></li></ol> 3. Opsonisation de R 2 R 2 globules rouges NOTE: Le R 2 R 2 utilisé ici sont obtenus à partir de la collection Blood Center (Société canadienne du sang), mais ils sont également disponibles dans le commerce. Opsonisé R 2 R 2 globules rouges sont utilisés en tant que témoin positif pour la phagocytose à médiation par FcyR. Naïf R 2 R 2 doit être stocké dans une solution de Alsever (pour prolonger la durée de vie) à 4 ° C pendant 1 mois. La solution de Alsever est fait maison et composé de 0,8% P / v de citrate trisodique (dihydraté), 1,9% p / v de dextrose, 0,42% en poids / chlorure de sodium v ​​et 0,05% p / v d&#39;acide citrique (monohydraté). Si R 2 R 2 cellules ne sont pas disponibles, d&#39; autres cellules phénotypées Rh, tels que R 1 R 2, R 1 R 1, R 1 r, r ou R 2, peuvent être utilisés. <ol><li> Lavage R 2 R 2 (CDE / CDE) de globules rouges dans du PBS d&#39; un montant total de trois fois en utilisant une centrifugation à 350 g pendant 5 min à chaque fois . NOTE: La quantité de globules rouges nécessaires dépend de la taille expérimentale et peut être rétro-calculé. Lavez-vous toujours une quantité excessive de globules rouges, car les globules rouges sont perdus lors de chaque lavage due à la lyse ou pendant l&#39;élimination du surnageant. Par exemple, dans une expérience de 5 traitements et 2 contrôles, toutes les conduites en triple techniques, il y a un total de 21 puits. 21 puits avec 400 pl / puits de 1,25% mélange RBC indique que 105 pi de emballés, opsonisé RBC sont nécessaires. 200 pi de RBC doit être d&#39;abord lavé et 150 &amp; #181, L doit être opsonisé pour s&#39;assurer qu&#39;il y ait une quantité suffisante de globules rouges pour l&#39;étape de phagocytose. </li><li> Opsoniser le lave R 2 R 2 culot avec 1: 1 v / v anticorps polyclonaux anti-D à partir de sérum humain et on incube pendant 1 h à 37 ° C, sous agitation intermittente. Remarque: si des anticorps polyclonaux anti-D ne sont pas disponibles, il est possible d&#39;utiliser des anticorps monoclonaux anti-D, qui sont disponibles dans le commerce ou anti-D qui est normalement utilisé pour la prophylaxie immunitaire Rh, qui peuvent être obtenus à partir des banques ou des transfusions sanguines prestations de service. les tests d&#39;optimisation doit être effectuée au début, lors de la mise en place du test, et chaque fois que la commutation beaucoup d&#39;anticorps polyclonaux un-titré ou le passage à un anticorps monoclonal. Cela permet d&#39;identifier la concentration ou le volume de l&#39;anti-D optimale requise pour un test de Coombs (IAT) Résultat entre 3+ et 4+ et un résultat de phagocytose de 70 à 90 entre les globules rouges phagocytés par 100 monocytes comptées. </li><li> Laver le opsonisentd R 2 R 2 un total de trois fois en PBS par centrifugation à 350 g pendant 5 min à chaque fois . REMARQUE: opsonisation avec succès R 2 R 2 peut être confirmée en effectuant une TMI indirecte. En bref, les anticorps anti-humains polyclonaux secondaires sont ajoutés pour lier des anticorps opsonisation primaires sur les surfaces de RBC, et le signal amplifié peut être observé sous la forme d&#39;hémagglutination. Un protocole du fabricant détaillée peut être trouvée dans le fichier des matériaux supplémentaires. </li><li> Reconstituer le lave R 2 R 2 pastille à 1,25% v / v en utilisant du milieu RPMI complet. REMARQUE: L&#39; excès opsonisé R 2 R 2 peut être stocké dans une solution de Alsever à 4 ° C pendant jusqu&#39;à une semaine. </li></ol> 4. La phagocytose à médiation par le récepteur Fc <ol><li> Aspirer le médicament ou le surnageant du milieu de la glissière 8-chambre et ajouter 400 ul de 1,25% v / v R 2 R 2 du mélange. Incuber à 37 ° C pendant 2 h. </li><li> à l&#39;arrièreer 2 h d&#39;incubation, retirez les chambres en utilisant les adaptateurs du fabricant. Tamponnez l&#39;excès de R 2 R 2 sur une serviette en papier. Assurez-vous que la lame ne se dessèche pas. </li><li> Remplir un bécher de 100 ml avec du PBS. Immerger et laver la lame en déplaçant lentement la lame avant et en arrière (environ 30-40 coups) pour éliminer la majorité des non-phagocyté R 2 R 2. </li><li> Retirer la lame du PBS. Tamponnez l&#39;excès de PBS en utilisant une serviette ou un tissu et de papier sécher à l&#39;air de la diapositive. </li><li> Fixer la lame séchée à l&#39;air dans 100% de methanol pendant 45 s. Ensuite, l&#39;air sec la lame fixe. NOTE: Les diapositives peuvent être fixés en utilisant une autre méthode qui est plus compatible pour la coloration aval, tels que la tache Grünwald-Giemsa 21 ou la tache Wright-Giemsa 22. </li><li> Monter la diapositive en utilisant un couvre-à-fait maison moyenne de Elvanol de montage (ou un autre support de montage disponible dans le commerce) et ajouter. NOTE: Elvanol milieu de montage est composé de 15% p / v polyvinyl résine d&#39;alcool et 30% v / v de glycerol dans du PBS. Le mélange est chauffé jusqu&#39;à ce que toute la résine soit dissoute et la glycérine est mélangé de façon homogène. Cela peut être remplacé par un autre support de montage dans le commerce. </li><li> Laisser le support sécher pendant la nuit avant la quantification. </li></ol> 5. Quantification de la phagocytose <ol><li> En utilisant un microscope à contraste de phase et un objectif 40X, quantifier manuellement la quantité d&#39;événements phagocytaires en comptant au moins 200 monocytes et le nombre de phagocyté R 2 R 2 au sein de ces monocytes. Avoir un compteur dans chaque main pour quantifier simultanément le nombre de monocytes et le nombre de R phagocyté 2 R 2. </li><li> Obtenir l&#39;indice phagocytaire moyenne en divisant le nombre de phagocyté R 2 R 2 par le nombre de monocytes et en multipliant par 100. exprimer les données sous forme de moyenne (indice de phagocytose) moyenne ± l&#39;erreur standard de la moyenne (SEM). </li&gt; </ol>

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The authors have nothing to disclose.

Le MMA est une technique laborieuse qui exige une expertise à la fois dans la culture de tissus et la microscopie. Il y a plusieurs étapes essentielles pour assurer le succès: 1) la génération de la monocouche monocytes; 2) opsonisation des globules rouges, et 3) la quantification manuelle. La monocouche monocyte ne colle pas très fortement à la lame de la chambre, de sorte que le pH physiologique doit être maintenue tout au long de l&#39;essai 11 et un nombre suffisant de PBMC doit être semée. pipetage Vigoureuse, ce qui pourrait perturber les cellules adhérentes, devrait être évitée. Une approche est de toujours supprimer et ajouter des solutions du même coin de la chambre et de veiller à ce que le mouvement est lent et régulier. De même, lors de la dernière étape de lavage pour éliminer l&#39;excès de globules rouges, le mouvement devrait être lente et régulière. Cela garantit une perturbation minimale à la monocouche, tout en supprimant la majorité des hématies un-phagocyté. lavage inadéquat conduira à un fond élevé de globules rouges contaminants, ce qui rend qua manuelntification difficile. D&#39; autre part, les groupes R 2 R 2 , les globules rouges doivent être suffisamment opsonisées afin d&#39; obtenir un indice phagocytaire moyenne de 80 à 120 pour le contrôle de la phagocytose. Cette gamme de phagocytaire souhaité un équilibre entre la facilité de comptage (par exemple, monocytes avec plus de 5 phagocytées hématies sont difficiles à quantifier avec précision) et le maintien d&#39; une quantité adéquate de la phagocytose pour l&#39; analyse statistique. Le degré de opsonisation peut être confirmé par un IAT, et une lecture entre 3+ à 4+ est nécessaire. Le R 2 R 2 hématies doivent être jetés quand il y a excès de lyse pendant le lavage, lorsque le surnageant devient rouge foncé, ou quand une diminution significative de la phagocytose est observée dans des expériences en raison du vieillissement des cellules de stockage. Enfin, la quantification manuelle à l&#39;aide du microscope peut être difficile, surtout lorsque l&#39;on compare les chiffres entre le personnel de laboratoire et entre les expériences. En examinant le même domaine sur chaque puits, ou simplement en comptant plus de cellulesUn nombre plus uniforme peut être obtenue. formation Side-by-side avec un technicien expérimenté et l&#39;utilisation d&#39;un ensemble désigné de diapositives de formation est recommandé. Une critique majeure de la MMA est la subjectivité de l&#39;étape manuelle de quantification. Cependant, avec une formation adéquate, la cohérence peut être obtenue à travers différents compteurs. Une autre limitation est les différences donateurs à-donateurs intrinsèques monocytes capacités phagocytaires et en R 2 R 2 surface niveaux d&#39;expression de l&#39; antigène, ce qui est une source de variation de données lorsqu&#39;ils traitent avec des échantillons humains. D&#39;autres techniques alternatives sont disponibles pour l&#39;examen de la phagocytose FcyR médiée. La majorité des kits commerciaux utilisent la sortie fluorescente pour surveiller la phagocytose (par exemple, bioparticules, la protéine de fluorescence sensible au pH, ou des billes de latex fluorescentes IgG marqués). L&#39;utilisation de la sortie fluorescente n&#39;offre une quantification plus objective, mais on doit aussi conexaminer le disponibilité, le coût et la formation associée à l&#39;utilisation d&#39;un microscope à fluorescence ou d&#39;un cytomètre de flux, ainsi que la dépendance qui s&#39;ensuit sur des kits disponibles dans le commerce. Enfin, cet essai peut être modifié en fonction de la question de recherche. Par exemple, lors du test de l&#39; inhibition médicamenteuse de la phagocytose, les monocytes peuvent soit être pré-traitées ou co-incubées avec les médicaments et les globules rouges opsonisés ( par exemple, un test de compétition). La signalisation en aval des anticorps de sous-types différents, des anticorps chimères ou des constructions recombinantes peuvent également être testés. Avec les récentes percées dans le développement d&#39;un antigène nul universel de sang 24, le MMA pourrait être utilisé dans les écrans initiaux de ces hématies antigène nul avec divers anticorps pour déterminer s&#39;il est en effet une efficacité réduit dans le déclenchement de la phagocytose.

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay originally developed to better predict blood transfusion outcomes in patients with auto- or alloantibodies to red blood cells (RBCs)1-5. By assessing the effect of anti-RBC antibodies in mediating Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis using this in vitro assay, it is possible to predict the clinical outcome in vivo. Indeed, the MMA has been used successfully to avoid immune destruction of antibody-bound RBCs, despite the transfusion of serologically incompatible blood5. The typical pre-transfusion procedure for compatibility testing, also termed crossmatching, involves serological methods that include typing the patient's blood for ABO and Rh antigens and screening for the presence of anti-RBC antibodies in the patient6. Blood matched for ABO/Rh is selected, and if antibodies are present, an attempt to identify them is made so that blood for transfusion can be further selected to avoid these antigens. An ideal crossmatch result occurs when all donor blood is serologically compatible with the patient's blood, which reduces the risk of post-transfusion hemolysis7. However, this system falls short for the small group of patients who have become alloimmunized upon repeated transfusion or pregnancy. These patients produce alloantibodies against specific RBC antigens. Some produce antibodies to antigens of very high frequency in the general population, and thus become progressively more difficult to crossmatch8,9. Adding to the complexity, not all alloantibodies are clinically significant; in other words, the binding of an alloantibody to RBCs detected by a serology test does not necessarily result in hemolysis when antigen-positive, incompatible blood is transfused. The MMA was originally developed to assess the potential clinical significance of serologically incompatible blood in a transfusion setting1-5.
Since extravascular hemolysis of antibody-bound RBCs is known to be mediated by the mononuclear phagocyte system, primary monocytes/macrophages are utilized in the development of diagnostic assays. The first assay to study the interaction of monocytes, RBCs, and antibodies was published in 1975, but the sub-optimal conditions used led only to rosette formation (the binding of RBCs to the periphery of the monocyte), and no phagocytosis was observed10. Significant modifications to the assay were made by several groups, leading to an assay for which the level of phagocytosis of alloantibody-bound RBCs could be correlated to the clinical outcome of hemolysis1-5. Recently, the optimal storage conditions of clinical samples and further optimization of assay conditions were examined to enhance the utility of a clinical MMA crossmatch using autologous patient samples11.
Three other diagnostic techniques have been employed in addition to the MMA in predicting transfusion outcomes: the 51Cr release test, the rosette test, and the chemiluminescence test (CLT). In the 51Cr release test, the patient is injected with 51Cr-labeled donor RBCs, and the half-life of the labeled RBCs is monitored and is predictive of post-transfusion survival or clearance12,13. As this method uses radioactive materials, it is rarely performed anymore. The rosette test involves mixing and incubating monocytes with RBCs and quantifying the level of rosette formation (with no phagocytosis)14. The clinical significance of antibodies in vivo involves active phagocytosis by macrophages found in the spleen and/or the liver; thus, this method does not provide a relevant readout of phagocytosis. The CLT uses luminol to monitor the oxidative burst during monocyte phagocytosis of RBC, since luminol fluoresces blue when oxidized in the phagosome15. This method is good, but contamination by neutrophils can confound the readout. Parallel comparisons have been made to evaluate the sensitivity, practicality, and reproducibility of the four available methods, and both the CLT and MMA were ranked superior16. However, the CLT has been mainly utilized in assessing hemolytic disease of the fetus and newborn (HDFN), and the assay's optimal pH of 8.0 might compromise the level of phagocytosis11.
In addition to its diagnostic and clinical utility, the MMA has been modified for other research purposes. Indeed, the MMA can not only serve as a functional assay to address discrepancies between serology and biology, it has also been used to retrospectively investigate the cause of hemolysis after intravenous immunoglobulin (IVIG) therapy17. It has also been used to examine the structure-function of chemical inhibitors of Fc&#947;R-mediated phagocytosis18-20 and to study the downstream signaling of Fc&#947;R-mediated phagocytosis21. In our laboratory, in addition to using a human MMA, we are developing a murine MMA using primary mouse peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and autologous RBCs. The rationale is to screen antibodies that can induce Fc&#947;R-mediated phagocytosis as an intermediate to developing an in vivo autoimmune hemolytic anemia (AIHA) mouse model (unpublished data). The various modifications focus on different aspects of the IgG antibody and Fc&#947;R interaction that induce phagocytosis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1148">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Acid citrate dextrose (ACD) vacutainers</td>
			<td style="width:213px;">BD</td>
			<td style="width:136px;">REF364606</td>
			<td style="width:405px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:213px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">HEPES</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>HEP003.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:213px;">Multicell&#160;</td>
			<td style="width:136px;">080150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:395px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td style="width:213px;">GE</td>
			<td style="width:136px;">17-1440-03</td>
			<td><a href="https://www.gelifesciences.com/">https://www.gelifesciences.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:213px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">8-chamber slides</td>
			<td style="width:213px;">Lab-Tek-ll</td>
			<td style="width:136px;">154534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:395px;">R2R2 (cDE/cDE) red blood cells&#160;</td>
			<td style="width:213px;">Canadian Blood Services</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>Commercially available (e.g. http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:395px;">Polyclonal anti-D from human serum</td>
			<td>Gamma Biologics</td>
			<td>DIN 02247724</td>
			<td>Can be substituted with commercially available monoclonal anti-D or with Rh immune globulin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">100% methanol</td>
			<td style="width:213px;">Caledon</td>
			<td style="width:136px;">6700-1-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Polyvinyl alcohol resin</td>
			<td style="width:213px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">P8136</td>
			<td>Can be substituted with commercially available mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">UltraPure glycerine</td>
			<td style="width:213px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">15514-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Cover slips</td>
			<td style="width:213px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">48366 067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Novaclone anti-IgG</td>
			<td style="width:213px;">Immucorgamma</td>
			<td style="width:136px;">5461023</td>
			<td>Optional for IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/.../ucm081743.pdf)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of a monocyte monolayer assay to evaluate fc&#947; receptor-mediated phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

En suivant les étapes cruciales dans la figure 1 et la procédure décrite ci - dessus, le MMA peut être réalisée de façon reproductible. IVIG a été utilisé comme exemple pour l&#39;inhibition de la phagocytose dans la figure 2. IVIG est connue pour se lier et bloquer les récepteurs Fc, inhibant ainsi le résultat en aval de la phagocytose. En dosant la quantité de IVIG utilisée, une inhibition dépendante de la dose est observée, dans lequel des concentrations supérieures à 200 ug / ml a donné lieu à près de 100% d&#39; inhibition et des concentrations inférieures à 0,5 pg / ml n&#39;a pas inhibé tout (figure 2A). Lorsque les indices de phagocytaires sont transformées et normalisées par rapport à R 2 R 2 en tant que contrôle positif 0% d&#39; inhibition, une courbe d&#39;inhibition avec une CI50 de 3 pg / ml peut être déterminée (figure 2B). En plus d&#39;effectuer le test régulièrement, Quantification de l&#39;essai peut parfois être difficile. Figure 3 est une collection de contraste de phase des images de microscopie de différentes diapositives MMA. Avec l&#39; expérience de la microscopie, on peut distinguer un monocytes d&#39;un RBC contaminant (Figure 3D), ou une vacuole d&#39;une RBC phagocyté (figure 3B). Grappes denses de cellules et / ou les débris doivent être évités pendant la quantification (figures 3E et F). En outre, il faut éviter de trop-opsonisation R 2 R 2 RBC, ce qui conduirait à une phagocytose accrue qui overcrowds l&#39;intérieur des monocytes et interfère avec une quantification précise (figure 3C). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma de la MMA. Une description étape par étape des étapes cruciales dans le MMA: isoler PBMC à partir de sang entier, alimentant le monocyt adhérées avec opsonisé R 2 R 2, et le lavage des lames de chambre. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig2.jpg" /> Figure 2. intraveineux IgG (IVIG) inhibe la phagocytose in vitro en utilisant le MMA. IgIV est connu pour inhiber la phagocytose et est utilisé comme contrôle d&#39;inhibition dans le MMA humain. (A) Titrage de IVIG a entraîné une inhibition dose-dépendante de la phagocytose par rapport à la non traité R 2 R 2 commande. Les résultats montrent la moyenne ± l&#39;erreur standard de la moyenne (SEM) n = 3 expériences. L&#39;analyse statistique a été effectuée à l&#39; aide des étudiants t -test: ** p≤0.01 et *** p ≤ 0,001. (B) de la courbe d&#39;inhibition de l&#39; IVIG avec un IC 50 of 3 pg / mL (ligne pointillée). Les résultats montrent des données normalisées à R non traitées 2 R 2 (0% d&#39;inhibition); moyenne ± SEM de n = 3 expériences. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig3.jpg" /> Figure 3. Phase contraste des images de microscopie de diapositives de l&#39; échantillon sous un grossissement de 40X. (A) Le coulisseau parfait dans lequel les monocytes phagocytées 1-2 R 2 R 2 en moyenne (flèches noires avec un halo lueur distinctive), avec très peu de contamination, non phagocytés R 2 R 2 en arrière - plan (flèches blanches). Vacuoles (B) Comme le montre cette diapositive, monocytes ont parfois agrandies (flèches blanches), qui peuvent être confondus avec des phagocyté R 2 R 2. (C &lt;/ strong&gt;) Lorsque R 2 R 2 ont été sur-opsonisées, plus de 4-5 phagocyté R 2 R 2 par monocytes (flèches noires) rendent le comptage exact difficile, puisque le R 2 R 2 sont entassés dans le monocytes et de cellules distinctes les frontières ne peuvent être distingués. (D) de lavage inadéquate de la lame conduit à abondante R 2 R 2 contamination (flèches blanches), qui pourrait être confondu avec hématies adhéré. (E) Parfois, les monocytes et les globules rouges contaminants peuvent former des amas. Clusters indiquent également la contamination bactérienne, qui devrait être évité. (F) monocytes peut former des agrégats plus gros, qui doivent être évités pendant la quantification. Utilisation de la sélection aléatoire des champs pour voir, le panneau A est ce qui est habituellement observé si le MMA a été effectué correctement. La barre d&#39;échelle est de 20 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici s&#39;il vous plait</a>pour voir une version plus grande de cette figure.

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Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

Utilisation d&#39;un monocytes monocouche Assay pour évaluer phagocytose Fcy Receptor médiée

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