Name: preparation and culture of myogenic precursor cells/primary myoblasts from skeletal muscle of adult and aged humans
Uploaded: 2017-02-16T13:00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans at JoVE.com

This work is supported by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC; BB/L021668/1), the MRC and Arthritis Research UK as part of the MRC - Arthritis Research UK Centre for Integrated Research into Musculoskeletal Ageing (CIMA) and the Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (097826/Z/11/A). The authors would like to thank Dr Dada Pisconti (University of Liverpool) for her expertise and advice in the isolation of muscle progenitor cells.

Alle eksperimenter med menneskelig vev beskrevet her ble godkjent på forhånd av University of Liverpool, universitetssykehus Aintree sykehus og South West Wales forskningsetiske komité (Godkjenning No: 13 / WA / 0374) og eksperimenter ble utført i henhold til god praksis veiledning. The University of Liverpool fungerte som etikk sponse for denne studien. Alle givere har gitt informert samtykke for innmelding av denne studien. Musklene ble isolert fra mennesker (BMI &lt;25): voksen: 30 ± 2,8 år gammel og alderen: 69 ± 5 år gammel. 1. Forberedelse for kultur <ol><li> Coating av kultur flater med laminin <ol><li> Fremstille en arbeidsløsning av 10 ug / ml laminin i 1x DPBS (Dulbeccos fosfatbufret saltvann). </li><li> Pipetter en minimal mengde av laminin løsning for fullstendig å dekke den overflate hvorpå cellene skal bli belagt (tabell 1). Inkuber than dyrkningsskål på minst 30 minutter i en fuktet 37 ° C, 5% CO2 inkubator før utplating av cellene. Håndtak laminin forsiktig, unngå bruk av virvelen. Arbeids oppløsning av 10 ug / ml laminin fortynnet i DPBS kan lagres ved 4 ° C og gjenbrukes flere ganger. </li><li> Bruke en 60 mm (20 cm2) petriskål eller 2 brønner i en 6-brønns plate (2 x 10 cm 2) per ~ 18 - 19 mg av skjelettmuskulatur til platen celler (5,50 x 10 4 celler totalt). Utfør celletelling til enhver tid ved plating celler for funksjonelle studier. MERK: Prøver ble opprinnelig hentet fra fot operasjoner (extensor digitorum brevis, tibialis anterior eller bortfører halluces muskler) av kvinnelige pasienter (voksne: 30 ± 2,8 år gammel, i alderen: 69 ± 5 år gammel, BMI &lt;25). </li></ol></li><li> Utarbeidelse av enzymatisk løsning <ol><li> Forbered 250 mM CaCl 2 fungerende løsning: 277 mg på lager CaCl 2 i 10 ml 1x DPBS. Filtrer såning med et 0,2 mikrometer filter membran og oppbevares ved 4 ° C. </li><li> Fremstille en arbeidsløsning av 1,5 U / ml kollagenase D, 2,4 U / mL av Dispase II og 2,5 mM CaCl2 i serumfritt DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagles medium) (tabell 2). </li><li> Bland godt og filtrerer den enzymatiske løsningen gjennom et 0,2 um membranfilter for sterilisering. Fremstille den enzymatiske oppløsning på forhånd og fryse ned (-20 ° C) på alikvoter for fremtidig bruk. </li></ol></li></ol> 2. Tissue Fordøyelse: Mekanisk og Enzymatisk Dissosiasjon <ol><li> Etter prøvetaking, holde muskelen ved 4 ° C i DPBS til fordøyelsen. Fremstille et minimum volum av 2 ml kollagenase-dispase-CaCl2-oppløsning pr 18 - 19 mg av muskelvev og varme den til 37 ° C før vev dissosiasjon. </li><li> Dypp muskelbiopsi kort i 70% etanol, vask med friske DPBS og plassere vevet på en ny petriskål med 1 ml enzymatiskløsning. </li><li> Kast så mye fibrotisk og fettvev som mulig og rive muskler raskt, men forsiktig i små, men skjelnes biter (ca.&gt; 0,5 mm 2) med steril saks eller en kirurgisk skalpell (blad nr 10). </li><li> Overføre prøven til et 50 ml rør med de resterende 1 ml av kollagenase-dispase-CaCl2. </li><li> Inkuber vevet ved 37 ° C opp til 30 - 40 min. Beveg muskelvev ved forsiktig omrøring av røret hvert 5. - 10 min. </li><li> Smør pipetter med media for å unngå vedheft av de frigitte cellene til plast veggene av pipetter. Tilsett 2 volumdeler sterilt vekstmedium, f.eks, 4 ml DMEM 20% FBS (føtalt bovint serum), 1% L-glutamin og 1% P / S (Penicillin-Streptomycin), for å stoppe fordøyelse. </li><li> Pipet opp og ned flere ganger med en 5 ml pipette for å hjelpe utgivelsen av cellene fra muskelfibrene. MERK: Prøven er vanligvis helt dissosiert på grunn av sin lille størrelse. However, hvis fragmenter av muskler fortsatt, bruke en andre inkubasjon med de resterende delene av muskler og med frisk enzymatisk løsning. </li><li> Filtrer muskelen løsningen gjennom et 70 mikrometer celle sil over et 50 ml konisk rør. Vask de gjenværende celler med flere medier og filter gjennom silen. </li><li> Sentrifuger ved 443 xg i 5 minutter ved romtemperatur for å pelletere cellene. Kast supernatanten forsiktig. </li><li> Oppløs pelleten til F-12 media (Hams F-12 Nutrient Mix), 20% FBS, 10% HS (hesteserum), 1% P / S, 1% α-glutamin og 2,5 ng / ml FGF-b ( rekombinant human basic fibroblast Growth Factor). Her bruker 4 ml av media per 60 mm petriskål. </li></ol> 3. Seeding Celler <ol><li> Samle kulturen fartøyet tidligere belagt med 10 ug / ml laminin fra inkubatoren (avsnitt 1.1). </li><li> Fjern forsiktig overskudd av laminin fra kulturen fatet, og unngå å berøre overflaten (eller det vil forstyrre proteinstruktur). vaskkultur fatet med DPBS (valgfritt). </li><li> Plate cellene direkte på laminin belagte fartøyet og inkuberes i 24 timer i en fuktet 37 ° C, 5% CO2 inkubator. </li><li> Visual cellene under lyse-feltet mikroskop (100X total forstørrelse) dagen etter. Runde små celler festet til overflaten, og den gjenværende rester kan sees i kulturmediet. </li><li> Endre medie til friske F-12 media supplert med 20% FBS, 10% HS, 1% P / S, 1% α-glutamin og 2,5 ng / ml FGF-b. </li></ol> 4. Kultur og aging av celler <ol><li> Endre media hver 2 - 3 d og splitte cellene så snart grupper av celler som er synlige under mikroskop (100X total forstørrelse, eksempelvis i figur 2, celler fra eldre mennesker, passasje 0, etter 7 d) for å unngå spontan differensiering. </li><li> Ved første passering (P1), endre medie til høy glukose DMEM supplert med 20% FBS, 10% HS, 1%P / S, 1% α-glutamin. Unngå bruk av FGF-b fra dette punkt, som FGF er et potent mitogen og viktig faktor ved begynnelsen av kulturen, men det kan fremme fibroblast overvekst hvis det brukes lengre tid i kultur. </li><li> For celle aging: <ol><li> Fjern media og vaske cellene to ganger med DPBS. </li><li> Legge til et minimalt volum 0,25% EDTA-trypsin for å dekke overflaten av cellene. Rock forsiktig for å sikre at alle cellene er dekket av løsrivelse løsning, inkuberes i 10 sekunder ved romtemperatur, og fjerne det. </li><li> Cellene inkuberes i en fuktet 37 ° C, 5% CO2 inkubator i 3 - 5 min. Trykk forsiktig og sjekk under sterkt lys mikroskop (100X total forstørrelse) at cellene er avrundet, men ikke helt løsrevet fra overflaten. Hvis ingen endring er observert i cellene inkuberes i 5 flere min. </li><li> Tilsett 5 ml vekstmedium (høy-glucose DMEM supplert med 20% FBS, 10% HS, 1% P / S, 1% α-glutamin) for å samle cellene, blandesgodt og overføre celler med nye medier i en T75 kolbe. Vask de gjenværende cellene gjentatte dette trinnet med en annen 5 ml vekstmedium (10 ml totalt for en T75-kolbe). </li><li> For å preplate (fortrinnsvis ved den første passasje), inkuberes cellene i en fuktet 37 ° C, 5% CO2 inkubator i 40 min. Samle supernatanten med cellene som ikke fester og inkuber dem i en ny T75 kolbe. Dette bør berike kulturen i myoblaster, som de fleste av fibroblaster skulle ha festet i den første kolbe. </li></ol></li><li> Skift media hver 2 - 3 d og splitte cellene 1 til 4, så snart de når 70% konfluens i maksimalt utbytte. </li><li> For differensiering, når cellene nådde 70 - 80% konfluens, endre kulturen medium til Differensiering Medium (DM): høy glukose DMEM supplert med 2% HS, 1% P / S, 1% α-glutamin. Cellene bør differensieres innen 5 - 7 d avhengig av kvaliteten og renheten av myoblast cruk. </li></ol> 5. trans Protocol <ol><li> Seed 50.000 celler / brønn i en 12-brønns plate for MF 20, senescence og levedyktighet analyser. Kultur cellene på dekkglass eller i en skål belagt med laminin. For Ki67 farging, frø 25.000 celler / brønn i en 12-brønns plate. </li><li> For transfections, følger produsentens prosedyren med 5 mL av transfeksjon reagens, 100 nM av kontroll mikroRNA ligne eller hemmer, 100 nM av mikroRNA ligne eller 100 nM av mikroRNA inhibitor per brønn, med et samlet volum på 1 ml. </li><li> Bytt til Differensiering Medium seks timer etter transfeksjon (høy glukose DMEM supplert med 2% HS, 1% P / S, 1% α-glutamin). For spredning eksperimenter, beis cellene 2 d etter transfeksjon; for senescence, 7 dager etter transfeksjon; og for MF20 flekker, sju dager etter transfeksjon. </li></ol> 6. Farging av cellene <ol><li> Ki67, myod og MF 20 farging <ol><li> Forbered blokk 1 (10% HS og 0,1% Triton-X i PBS) og blokk 2 (10% HS og 0,05% Triton-X i PBS) løsninger. Bruk 500 ul av reagens per brønn til en 12-brønns plate. MERK: Utfør følgende trinn ved hjelp av en shaker for ruge trinn. </li><li> Fjern materialet fra cellene. </li><li> Skyll cellene med PBS. </li><li> Fest cellene med kald metanol i 10 min på en rocker. </li><li> Fjerne metanolen fra cellene og skylles 3 ganger med PBS i 5 min hver gang. </li><li> Legg til en blokk 1 løsning og inkuberes cellene på en vippe ved RT i 1 time. </li><li> Legg primær antistoff løsning: for Ki67 flekker, bruker Rabbit mAb til Ki67 (1: 1000 fortynning i blokk 2); for myod bruke MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb (1: 100 fortynning i blokk 2); for MF 20 flekker, bruk MYH1E (MF 20) primært antistoff (DSHB, 1: 1000 fortynning i blokk 2). </li><li> Cellene inkuberes med det primære antistoff i 1 time (RT) til O / N (4 ° C) på et vippe. </li><li> Samle det primære AB (det kan brukes om igjen flere ganger hvis storød ved 4 ° C). </li><li> Skyll cellene 3x med PBS, 5 minutter hver gang. </li><li> Legg den aktuelle sekundære antistoff: for Ki67 eller myod flekker, geit anti-kanin IgG (H + L) sekundært antistoff, Alexa Fluor 488 konjugert (1: 1000 fortynning i PBS); for MF 20 farging, geit-anti-mus IgG (H + L), sekundært antistoff, Alexa Fluor 488 konjugat (1: 1000 fortynning i PBS). </li><li> Pakk platen inneholdende cellene og inkuberes sekundært antistoff i 2 timer i mørke på en vippe ved RT. </li><li> Rens cellene 3x med PBS i 5 min hver gang. </li><li> Legg DAPI-løsning (1: 1000 fortynning i PBS) inn i cellene og inkuberes på vippe ved RT i 5 - 10 min. </li><li> Rens cellene 3x med PBS i 5 min hver gang. </li><li> Tilsett 1 ml frisk PBS. </li><li> Montere cellene på dekkglass på monteringsløsning eller tette platen inneholdende cellene i PBS med Parafilm for å forhindre fordampning. </li><li> Oppbevar ved 4 ° C. </li><li> Visual cellene medfluorescens mikroskop så snart som mulig (senest 2 uker). </li></ol></li><li> Livskraftig assay <ol><li> Fjern materialet fra cellene. </li><li> Rens cellene i PBS. </li><li> Tilsett 1: 1000 etidiumbromid og 1: 1000 akridinorange fortynnet i PBS. Advarsel: Vær forsiktig og arbeide innenfor helse- og sikkerhetsforskrifter - etidiumbromid er kreftfremkallende. </li><li> Pakk platen inneholdende cellene i fargeløsning og inkuber ved romtemperatur på vippe i 5 min. </li><li> Ta bilder av celler med fluorescens-mikroskop: grønn kanal for akridinorange; røde kanalen for etidiumbromid. </li></ol></li></ol>

There is nothing to disclose.

Her presenterer vi en enkel, robust, billig, reproduserbar og effektiv metode for å isolere muskelstamceller / primær myoblasts fra voksne og eldre mennesker fra extensor digitorium brevis, tibialis anterior eller bortfører halluces muskler. Denne protokollen har som mål å tillate studier med humane primære myoblaster fra voksne og eldre mennesker, særlig når mer sofistikerte metoder, slik som FACS- eller MACS-sortering, er ikke mulig eller praktisk. Isoleringsfremgangsmåten presentert i dette manuskriptet tar omtrent 2 timer. Under muskel isolering, ble muskelen vasket i 70% etanol for å unngå forurensning. Forut for enzymatisk dissosiasjon av muskelen, er det viktig å skjære muskelen i små, men synlige biter, og unngå celleskader fra for mye hakking. Fordøyelsen resultater i dissosiasjon av myofibers og utgivelsen av satellittceller og myogeniske forløper celler. I vårt tilfelle for ~ 20 mg av skjelettmuskulatur, en 60 mm20 cm (2) Petriskål var den mest hensiktsmessige overflateareal for innhøsting av cellene. Celler belagt på en større flate viste redusert spredning, mens cellene sådd ut på en mindre flate viste økt celledød og agglutinasjon. Etter isolering, ble cellene dyrket og ekspandert på laminin-dekket platene. Bruken av ikke-belagte overflater tendens til å redusere suksess for isolasjon. Av denne grunn kan cellene bli høstet fortrinnsvis på et forhåndsbelagt overflate direkte etter isolering. Fibroblaster-anrikede kulturer vil dominere i stedet for myoblaster-avledede celler hvis cellene høstes på en ikke-belagt overflate direkte etter isolering. Bortsett fra laminin, kan bruk av andre cellefesting løsninger som Matrigel og kollagenbaserte reagenser anvendes. Belegningsløsninger kan omfatte vekstfaktorer og andre forbindelser som vil fremme cellevekst, men disse kan forandre cellens oppførsel, og derfor de eksperimentelle resultatene. IVår erfaring er 10 mikrogram / ml laminin optimal konsentrasjon og riktig belegg reagens for satellittceller og myoblast vedlegg og spredning som det mangler noen vekstfaktor eller andre utfyller. Videre er laminin naturlig tilstede i basal lamina, direkte knyttet til sarcolemma, som spiller en nøkkelfunksjon i satellitt-celle vedlegg og migrasjon gjennom skjelettmuskelfiber. De tilskudd av kulturmedier kan også ha en negativ innvirkning på oppførselen til den primære myoblast. For eksempel vekstfaktorgrupper, slik som FGF eller IGF, har pleiotropiske virkninger på primærkulturer myoblast, med FGF-2 kontrollere både mitogen og programmert celledød respons 31. Det er derfor nødvendig å nøye kontrollere dyrkingsbetingelsene, særlig fordi forskjellene i oppførselen av primære myoblaster isolert fra muskel av voksne og eldre mennesker er svært sannsynlig å være på grunn av renheten of kulturer og sannsynligheten for fibroblaster overfyller myoblasts i kultur under langsiktig kulturer 35. Vi har benyttet en time pre-plating av cellene i løpet av den første splitte på en ikke-belagt overflate for å minske forurensning av kulturene med fibroblaster. Metoden beskriver vi er egnet for å isolere myogeniske progenitorceller fra musklene i både voksne og eldre mennesker. Det isolerte celle består av en representant myogenisk populasjon av celler som vist med en høy prosentandel av myogeniske celler (myod uttrykk og myogeniske egenskaper visualisert ved MF20 immunfarging i figur 1 og 2) og kan bli brukt som en in vitro modell for funksjonelle studier av fremgangsmåter forbundet med muskel homeostase. Tidligere studier har preget isolasjon og forskjeller i egenskaper, eller mangel på sådan, av humane primære myoblasts fravoksne og eldre mennesker 6, 20, 27, 28, 29, 30, 31, 35, 3 6, 37, 38. Eksistensen av geriatrisk og / eller ikke-fungerende humane MPCS er blitt demonstrert 6, 20, 22. Imidlertid har ingen forskjell i oppførselen til nylig isolerte humane MPCS også blitt vist 27. Vår protokollen tillater for isolering av primære myoblaster som i det minste delvis beholder sin fenotype, for eksempel redusert proliferativ potensial eller senescens av primære myoblaster isolert fra muskel av eldre mennesker og tillater anvendelse av disseceller for funksjonelle studier av molekylære mekanismer for muskel homeostase under aldring 22. Den primære myoblasts isolert ved hjelp av metoden beskrevet her kan brukes ikke bare for myogeniske differensiering studier, men også for å undersøke intracellulære endringer, for eksempel endringer i genuttrykk som forekommer i menneske myogeniske forløper celler under aldring. Men endringene som skjer i cellene under langvarig ex vivo kultur må vurderes når analysere fenotypiske og genotypiske endringer som skjer under aldring. Vi anbefaler at du bruker nylig isolerte celler for dette formålet. Videre er det primære myoblast dyrkningsmetode som er beskrevet her gjør det mulig for ekspansjon og relativt langvarig kultur av humane primære myoblaster, slik at for robuste funksjonelle studier in vitro. Vi har tidligere vist at myogeniske stamceller isolert ved hjelp av vår metode kan brukes til både uttrykk profilering og fulione studier av prosesser knyttet til muskel aldring 22. Denne fremgangsmåte er også anvendelig til musklene i voksen og gamle gnagere og gir mulighet for isolering av en anriket kultur av myoblaster som kan benyttes for profilering genetiske og epigenetiske endringer under aldring og funksjonelle studier 22. Begrensningene ved denne metoden omfatter bruken av, til en viss grad, blandet populasjon av celler i stedet for en ren populasjon av satellitten celler, noe som kan oppnås ved bruk av mer sofistikerte publiserte metoder 6, 28, 29, 39, 40, 41, 42, 43. Vi presenterer en forenklet, rimelig og reproduserbar protokoll for isolering av primære myoblasts celler fra voksne og eldremennesker. Vår erfaring er tilgjengelige, mer sofistikerte metoder for isolering og kultur av humane primære myoblasts (som MACS- eller FACS-sortert satellittceller) er ideelle for noen typer studier, for eksempel profilering transcriptomic eller proteomikk forandringer i cellene. Men disse fremgangsmåter er kostbare, krever i det minste noen grad av ekspertise, og kan vise seg å være vanskelig på grunn av den lave proliferative hastighet av rene primære myoblast kulturer og fibroblaster voksningen myoblaster. Vi presenterer en reproduserbar protokoll som tillater enkel isolering og kultur av humane primære myoblaster for anvendelse ved funksjonelle studier. I tillegg foreslår vi bruk av laminin 42 og begrenset bruk av bFGF som nøkkelfaktorer for en vellykket kultur 44. Vi foreslår også å unngå stress generert ved sentrifugering når splitte cellene og en pre-plating trinnet ved første passering 45. For å oppsummere, vi haroptimalisert en effektiv protokoll for isolering og kultur av primære myoblaster / MPCS fra muskler av voksne og eldre mennesker, som er også anvendelig til musklene i gnagere og muliggjør ekspresjon og funksjonelle studier av muskel homeostase.

Sykdoms- og aldersrelatert progressivt tap av skjelettmuskelmasse og funksjon resultater i skrøpelighet, nedgang i styrke og reduksjon i livskvaliteten for eldre mennesker. Skjelettmuskulatur står for omtrent 40% body mass 1. Under aldring og sykdom, progressiv atrofi av individuelle myofibers og reduksjon av muskel kvalitet på grunn av infiltrasjon av fett og fibrose forekommer 1, 2, 3, 4, 5, 6. Nylig er det blitt foreslått at artsspesifikke forskjeller i aldring av skjelettmuskulatur oppstår, nemlig at muskelfibertapet som forekommer i gnagere, ikke kan forekomme hos mennesker 7. Likevel er de gjenværende muskelfibre av alderen pattedyr preget av økt mottakelighet for skade og nedsatt regenerering <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 8. Voksen muskel reparasjon og vedlikehold formidles av satellitten celler 9, 10. Ved muskelskader og andre relevante stikkord, satellitt celler blir aktivert og sprer. En undergruppe av celler som vender tilbake til hviletilstanden og resten utvikler seg inn i myoblaster (myogenisk progenitorceller - MPCS). Disse bidrar til å reparere den eksisterende myofiber 11. Funksjonaliteten av satellitten celler avgjør suksessen til muskel regenerasjon og endringene i satellitt-celle tilgjengelighet med aldring er påvist 12, 13, 14, 15. Videre har satellitt celler fra muskelen av gamle mennesker og gnagere viser en transkripsjonen profil bryter og redusert regenerative potensialet 16, 17, </sup&gt; 18, 19. Satellittceller av muskel fra gamle mus og mennesker har også vist seg å gjennomgå senescence resulterer i deres redusert funksjonalitet 20. Den mest etablert cellelinje som muliggjør studium av muskel homeostase er murine cellelinje C2C12 21. En betydelig mengde studier har også benyttet murine primære myoblaster 22. Disse kulturene har ført til en betydelig forståelse av muse og virveldyr myogenesen samt muskel regenerasjon, myotube / myofiber atrofi, og hypertrofi prosesser som skjer i løpet av muskel sykdom og aldring 23, 24, 25, 26. Mer nylig har flere grupper beskrevet ved hjelp av humane primære myoblasts å studere myogenesen og muskel aldring. Men det er mangel på enighet med regards til forskjellene mellom primær myoblaster isolert fra muskel av voksne og eldre mennesker 27, 28, 29, 30, 31. Til tross for forskjeller karakterisert ved den systemiske og lokale miljø som oppstår under utvikling, aldring og sykdom 6, 32, 33, 34, in vitro myoblast og myotube kulturer forblir de mest tilgjengelige verktøy for å studere molekylære mekanismer forbundet med muskelutvikling, vekst og atrofi. I tillegg er disse studiene gir ikke bare en robust, men også en forholdsvis rask, billig og med høy gjennomstrømning in vitro verktøyet. Videre etiske implikasjoner knyttet til studier av menneskelige muskler betyr at for funksjonelle eksperimenter som involverer manipulering av genekspresjon <em&gt;, In vitro menneskelige myoblast og myotube kulturer forblir det eneste alternativet tilgjengelig for virveldyr modellorganismer. Her viser vi en enkel forsøksprotokoll for robust, billig og reproduserbar isolering av primære myoblasts eller MPCS, fra muskel av voksne og eldre mennesker og beskrive standardiserte betingelser for in vitro kultur (figur 1). Som primærkulturer fra muskel inneholder vanligvis fibroblaster i tillegg til myoblasts, anbefaler vi en forhåndspålegg skritt med sikte på forbedret renhet og kvalitet av primære myoblasts. For å oppsummere, har vi etablert en protokoll som åpner for effektiv og reproduserbar isolasjon, kultur og funksjonelle studier av beriket og funksjonelle MPCS / primær myoblasts fra skjelettmuskulatur av voksne og eldre mennesker.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="916">
	<tbody>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:183px;">60mm Petri dishes</td>
			<td style="width:101px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:151px;">628160</td>
			<td style="width:483px;">Cellstar Cell culture dish, PS, 60/15 MM, VENTS.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Cell culture plates (6 wells)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">CLS3516</td>
			<td style="width:483px;">Corning Costar cell culture plates. 6 well, flat bottom (Individually wrapped) .&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Cell culture plates (12 wells)</td>
			<td style="width:101px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:151px;">657 160</td>
			<td style="width:483px;">Cellstar Cell culture Multiwell Plates.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Culture flasks</td>
			<td style="width:101px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:151px;">&#160;690175 (25cm2); 658175 (75cm2).</td>
			<td style="width:483px;">Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Standard Disposable Scalpel</td>
			<td style="width:101px;">Granton</td>
			<td style="width:151px;">91310</td>
			<td style="width:483px;">Sterile stainless steel blade, pattern: 10.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Pipettes</td>
			<td style="width:101px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:151px;">606 180 (5 ml); 607 180 (10 ml); 760 180 (25 ml)</td>
			<td style="width:483px;">Cellstar Serological Pipettes.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Pasteur plastic pipettes</td>
			<td style="width:101px;">Starlab</td>
			<td style="width:151px;">E1414-0311</td>
			<td style="width:483px;">3.0ml Graduated Pasteur Pipette (Sterile), Ind. Wrapped.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Syringe</td>
			<td style="width:101px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">300613</td>
			<td style="width:483px;">20 mL BD eccentric tip syringe.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">0.2 &#181;m filters</td>
			<td style="width:101px;">Gilson</td>
			<td style="width:151px;">ALG422A</td>
			<td style="width:483px;">Sterile Syringe Filters CA 0.2um 33mm Pk50.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Cell strainers</td>
			<td style="width:101px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">11597522</td>
			<td style="width:483px;">Cell culture strainer sterile individually packed 70&#181;m polypropylene.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:101px;">Roche</td>
			<td style="width:151px;">11088882001</td>
			<td style="width:483px;">Collagenase D; ctivity: &#62;0.15 U/mg&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Dispase II</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">D4693</td>
			<td style="width:483px;">Dispase II Protease from Bacillus polymyx. Activity: &#8805;0.5 units/mg solid.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">CaCl2</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">449709</td>
			<td style="width:483px;">Calcium chloride, anhydrous, beads, &#8722;10 mesh, &#8805;99.9% trace metals basis&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Laminin</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">114956-81-9&#160;</td>
			<td style="width:483px;">Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane. 1mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">DMEM-high glucose</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">D5671</td>
			<td style="width:483px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose. With 4500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine and sodium pyruvate.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">F-12 media</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">21765029</td>
			<td style="width:483px;">Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix. 1x + L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">FGF-b</td>
			<td style="width:101px;">PetroTech</td>
			<td style="width:151px;">100-18B&#160;</td>
			<td style="width:483px;">Recombinant Human Fibroblast Growth Factor-basic.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">10270-106</td>
			<td style="width:483px;">Fetal Bovine Serum.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Horse serum (HS)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">H1270</td>
			<td style="width:483px;">Horse Serum. Donor herd, USA origin, sterile-filtered.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P0781</td>
			<td style="width:483px;">Penicillin-Streptomycin with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, sterile-filtered.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">G7513</td>
			<td style="width:483px;">L-Glutamine solution. 200 mM, solution, sterile-filtered.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">T4049</td>
			<td style="width:483px;">Trypsin-EDTA solution. 0.25%, sterile-filtered.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">TrypLE Express&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">12604-013</td>
			<td style="width:483px;">TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">DPBS (cell culture)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">D8537</td>
			<td style="width:483px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline. Modified, without calcium chloride and magnesium chloride.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">PBS (immunostaining)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P4417-50TAB</td>
			<td style="width:483px;">Phosphate buffered saline tablet. One tablet per 200 mL of deionized water (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Methanol</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:151px;">M/4000/PC17</td>
			<td style="width:483px;">Methanol Analytical Reagent Grade</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">T8787</td>
			<td style="width:483px;">Triton X-100 for molecular biology.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">anti-MF 20 antibody</td>
			<td style="width:101px;">DSHB</td>
			<td style="width:151px;">MF20-c 2ea 211 &#181;g/ml.</td>
			<td style="width:483px;">MYH1E (MF 20) Mouse mAb.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">anti-MyoD antibody</td>
			<td style="width:101px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:151px;">13812P</td>
			<td style="width:483px;">MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">anti-Ki67 antibody</td>
			<td style="width:101px;">Abcam</td>
			<td style="width:151px;">ab16667</td>
			<td style="width:483px;">Rabbit mAb to Ki67 [SP6].</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Anti-mouse 488 secondary antibody&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">A-11029</td>
			<td style="width:483px;">Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Anti-rabbit 488 secondary antibody</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">A-11034</td>
			<td style="width:483px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">DAPI</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:483px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Senescence &#946;-Galactosidase Staining Kit</td>
			<td style="width:101px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:151px;">9860</td>
			<td style="width:483px;">Senescence &#946;-Galactosidase Staining kit.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">DMSO</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">41639</td>
			<td style="width:483px;">Dimethyl sulfoxide. BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.5% (GC).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Acridine Orange</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A8097</td>
			<td style="width:483px;">Acridine Orange hydrochloride solution, 10 mg/mL in H2O.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">E1510</td>
			<td style="width:483px;">Ethidium bromide solution. BioReagent, for molecular biology, 10 mg/mL in H2O.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">11668019</td>
			<td style="width:483px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Scramble control for transfections</td>
			<td style="width:101px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">1027271</td>
			<td style="width:483px;">miScript Inhibitor Neg. Control (5 nmol)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Hsa-miR-378a-3p miScript Primer Assay</td>
			<td style="width:101px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">218300</td>
			<td style="width:483px;">Hs_miR-422b_1 miScript Primer Assay (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5&#39;ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor</td>
			<td style="width:101px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">219300</td>
			<td style="width:483px;">Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5&#39;ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Megafuge 2.0 R Centrifuge</td>
			<td style="width:101px;">Heraeus</td>
			<td style="width:151px;">75003085</td>
			<td style="width:483px;">n/a</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Centrifuge rotor</td>
			<td style="width:101px;">Heraeus</td>
			<td style="width:151px;">3360</td>
			<td style="width:483px;">Heraeus Sepatech Megafuge Centrifuge Rotor BS4402/A. Max. radius: 15.5 cm.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Eclipse Ti-E Inverted Microscope System</td>
			<td style="width:101px;">Nikon</td>
			<td style="width:151px;">n/a</td>
			<td style="width:483px;">Eyepieces: CFI 10x/22; Total magnification: 100x (MF20, Live/dead and Ki67).</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Axiovert 200 inverted microscope</td>
			<td style="width:101px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:151px;">n/a</td>
			<td style="width:483px;">Eyepieces: Carl Zeiss 1016-758 W-PI 10x/25; Total magnification: 100x (Senescence &#946;-Galactosidase Staining).</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Axiovert 25 inverted microscope</td>
			<td style="width:101px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:151px;">n/a</td>
			<td style="width:483px;">Eyepieces: E-PL 10x/20. Total magnification: 100x (bright field).</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Diaphot Inverted Tissue Culture Microscope</td>
			<td style="width:101px;">Nikon</td>
			<td style="width:151px;">n/a</td>
			<td style="width:483px;">Eyepiece: CFWN 10x/20. Total magnification: 100x (bright field).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Hydromount</td>
			<td style="width:101px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:151px;">HS-106</td>
			<td style="width:483px;">Hydromount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and culture of myogenic precursor cells/primary myoblasts from skeletal muscle of adult and aged humans

Skjelettmuskulatur homeostase avhengig av muskelvekst (hypertrofi), atrofi og regenerering. Under aldring og i flere sykdommer oppstår muskelsvinn. Tap av muskelmasse og funksjon er assosiert med muskelfibertype atrofi, fibertype, defekte muskelregenerasjonenen forbundet med dysfunksjon av satellittceller, muskel stamceller og andre patofysiologiske prosesser. Disse endringene er knyttet til endringer i intracellulær samt lokale og systemiske nisjer. I tillegg til de vanlig anvendte gnagermodeller på muskel aldring, er det behov for å studere muskel homeostase og sløse med humane modeller, som på grunn av etiske implikasjoner, består hovedsakelig av in vitro kulturer. Til tross for den utstrakte bruken av menneskelige myogenisk stamceller (MPCS) og primær myoblasts i myogenesen, det er begrensede data på bruk av humane primære myoblast og myotube kulturer for å studere molekylære mekanismer som regulerer ulike sider av aldersrelatert muscle sløse, hjelpe til validering av mekanismer for aldring foreslått i gnager muskel. Bruken av menneskelige MPCS, primær myoblasts og myotubes isolert fra voksne og eldre mennesker, gir en fysiologisk relevant modell av molekylære mekanismer av prosesser knyttet til muskelvekst, atrofi og regenerering. Her beskriver vi i detalj en robust, billig, reproduserbar og effektiv protokoll for isolering og vedlikehold av humane MPCS og deres avkom - myoblaster og myotubes fra menneskelige muskelprøver ved enzymatisk oppslutning. Videre har vi bestemt passasjen nummeret som primær myoblasts fra voksne og eldre mennesker gjennomgå senescence i en in vitro kultur. Til slutt viser vi muligheten til å transfektere disse myoblaster og evnen til å karakterisere deres proliferative og differensiering kapasitet og foreslår at de er egnet for å utføre funksjonelle studier av molekylære mekanismer for myogenese og muskelsvinn in vitro. </p&gt;

MPCS / primær myoblasts skal være synlig 24 timer etter seeding på laminin lakkert overflate (figur 2). Cellene bør vedta en spindel-lignende form og skal uttrykke myod fortsatt i passasjen 4 (Figur 1A, B). Fibroblaster kan være preget av sin stjernelignende morfologi og manglende uttrykk for myod (figur 1B, C). Når cellene er festet på neste dag, bør media byttes ut med friske bFGF media. De kulturmedier bør byttes hver 48. time. De representative resultater er vist her, og publiserte data fra vårt laboratorium 22 formål å støtte vår isolasjon og kultur-protokoll og demonstrere de forskjellige teknikker som kan brukes for funksjonelle studier av humane primære myoblaster. Myoblast spredning kan studeres ved hjelp av Ki67 farging og levedyktighet ved hjelp staining for celleviabilitet analysen (figur 3). For differensiering, bør kulturmediet endres til differensierings media. Myotubes bør danne i 5-7 d og være myosin tung kjede positive (figur 3). Merk at myotube formasjonen kan være mindre effektiv når myoblasts er isolert fra muskel av eldre mennesker (figur 3). Senescens (SA-β-galaktosidase) flekker kan også utføres for å etablere prosentandelen av senescent celler i kultur (figur 3). Vi har observert at med lengre kulturer (figur 3, passasje 4), flere myoblaster isolert fra muskel av eldre mennesker viser begynnende alderdom. For funksjonelle studier, kan genet og mikroRNA ekspresjon bli manipulert ved hjelp av lipofile transfeksjon reagenser-mediert levering av ekspresjonsvektorer, sirnas, mikroRNA etterligner og antimiRs (figur 4). Dette gjør det mulig for 40 -70% transfeksjonseffektivitet med genet / mikroRNA nivå er opp- eller ned-reguleres innenfor et fysiologiske området (figur 4; 22). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> dyrkings-beholderen </td><td> Ca. Area (per brønn) </td><td> Volum på 10 mikrogram / ml laminin </td></tr><tr><td> 35 mm fatet </td><td> 10 cm 2 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 60 mm fatet </td><td> 20 cm 2 </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> 100 mm fatet </td><td> 60 cm 2 </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> 24-brønns plate </td><td> 2 cm 2 </td><td> 200 ul / brønn </td></tr><tr><td> 12-brønns plate </td><td> 4 cm 2 </td><td> 500 ul / brønn </td></tr><tr><td> 6-brønns plate </td><td> 10 cm 2 </td><td> 1 mL / brønn </td></tr><tr><td> T25 </td><td> 25 cm 2 </td><td> 3 mL </td></tr><tr><td> T75 </td><td> 75 cm 2 </td><td> 5 mL </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Anbefalt minimum Volumene av Laminin-DPBS Solution (10 mikrogram / ml) for Coating Kultur Surface. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Spesifikk aktivitet / Molar masse </td><td> endelig Konsentrasjon </td><td> Masse eller volum som er nødvendig for 10 ml løsning </td></tr><tr><td> Collage D </td><td> 0,15 U / mg </td><td> 10 mg / ml (1,5 U / ml) </td><td> 100 mg </td></tr><tr><td> dispase II </td><td> 0,5 U / mg </td><td> 4,8 mg / ml (2,4 U / ml) </td><td> 48 mg </td></tr><tr><td> 250 mM CaCl2 </td><td> 1100,98 g / mol </td><td> 2,5 mm </td><td> 100 mL </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Enzyme Forberedelse for Muscle fordøyelse. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig1.jpg" /> Figur 1. Grafisk Abstract Oppsummering trinnene i protokollen. Dissosiasjon av den menneskelige muskelbiopsi med saks eller med en kirurgisk skalpell (I). Inkubasjon med enzymoppløsningen ved 37 ° C i 30 - 40 min (II). Slutten av fordøyelsen gjennom tilsetning av vekstmedier og filtrering av oppløsningen gjennom et 70 um membranfilter inn i et sentrifugerør (III). Sentrifugering ved 443 xg i 5 min (IV). Kassering av supernatanten og resuspendering i vekstmedier inneholdende 2,5 ng / ml FGF (V). Plating cellene på en tallerken dekket med 1081; g / ml laminin og endring av mediet etter 24 h (VI). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig2.jpg" /> Figur 2. myoblasts Isolerte fra Muscle of Adult og Gamle mennesker på forskjellige deler. A. Bilder representerer myoblasts isolert fra extensor digitorum brevis, tibialis anterior eller bortfører halluces musklene kvinnelige pasienter (voksne: 30 ± 2,8 år gammel, i alderen: 69 ± 5 år, BMI &lt;25). Ved passering 0 og etter 5 dager for å bli belagt, celler er fortsatt rund og liten, men synlig under sterkt lys mikroskop (A). Myoblaster vil da innta en langstrakt form, som vist ved passasje 2 (A). Myod er uttrykt i myoblaster, men ikke i fibroblaster<html> (B). Kvantifisering av myod-positive celler er vist; feilfelt viser standardavvik; n = 3 (B). Representative bilde som viser forskjellene mellom myoblast og fibroblast morfologi (C). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig3.jpg" /> Figur 3. humane primære myoblasts kan karakteriseres ved hjelp av forskjellige fargeteknikker. Levedyktighet av cellene kan bli visualisert ved hjelp av farging for celleviabilitet analyser, kan spredning vurderes ved hjelp av Ki67-immunfarging, kan differensiering vurderes ved hjelp av MF20 (myosin tung kjede) farging og begynnende alderdom kan visualiseres ved hjelp av begynnende alderdom forbundet beta-galaktosidase (SA-β-galaktosidase ) farging.<html> ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig4.jpg" /> Figur 4. humane primære myoblasts kan brukes for funksjonelle studier av Muscle Homeostase In Vitro. A. MF20 (myosin tung kjede) farging av differensierte primære myotubes fra voksne mennesker som viser virkningene av overekspresjon eller inhibering av MIR-378 på myotube størrelse og antall. B. qPCR viser relative uttrykk for MIR-378 og Igf1r, validert Mir-378 mål genet, etter MIR-378 overekspresjon eller hemning i humane primære myoblasts. Ekspresjon i forhold til Rnu-6 og β-2-mikroglobulin, henholdsvis, er vist. Feilsøylene viser SEM; n = 3, * - p &lt;0,05, Student t-test.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans at JoVE.com

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Denne protokollen beskriver en robust, reproduserbar og enkel metode for isolering og kultur av myoblast stamceller fra skjelettmuskulatur av voksne og eldre mennesker. De musklene som brukes her inkluderer fot og leggmusklene. Denne tilnærmingen muliggjør isoleringen av en anriket populasjon av primære myoblaster for funksjonelle studier.

Utarbeidelse og kultur myogenisk forloperceller / Primær myoblasts fra Skeletal Muscle of Adult og Gamle mennesker

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolasjon og Kvantitativ immunocytokjemisk Karakterisering av Primære myogenic celler og fibroblaster fra Menneskelig Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse av Sebrafisk Larver Skeletal Muscle Integrity med Evans blå Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Isolasjon og Culture of Adult Sebrafisk Brain-avledet Neurosfærer

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Induksjon av akutt Skeletal Muscle Regenerering av Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

Isolering av humane myoblaster, vurdering av myogen differensiering og oppbevaringsoperert kalsiummåling

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Anvendelse av kronisk stimulering å studere kontraktile aktivitet-indusert rotte Skjelettmuskel fenotypiske tilpasninger

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identifikasjon av Skjelettmuskel satellitt celler av Immunofluorescence med Pax7 og Laminin antistoffer

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Isolasjon og kultur av primære Epicardial celler avledet fra menneskelige voksne og fosterets hjerte prøver

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Isolasjon, kultur, karakterisering, og differensiering av Human Muscle stamceller fra skjelettmuskelen biopsi prosedyre

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Utføre menneskelige Skjelettmuskel Xenotransplantater i Immunodeficient mus

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...