Name: using a gfp-tagged tmem184a construct for confirmation of heparin receptor identity
Uploaded: 2017-02-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity at JoVE.com

Research in the Lowe-Krentz lab is supported by research grant HL54269 from the National Institutes of Health to LLK.

1. Conception d&#39;une construction GFP-protéine <ol><li> Achat, ou de la conception et de la construction, une construction de GFP-tagged basé sur la protéine en question. NOTE: Pour une construction acheté, des vecteurs standards sont disponibles auprès des laboratoires commerciaux qui incluent certaines ou toutes les suggestions suivantes: Pour une protéine membranaire, sélectionner un emplacement de C-terminale de la GFP, car il est moins susceptible d&#39;interférer avec le trafic de protéine mem...

<ol>
	<li>Pugh, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+Protein+184A+Is+a+Receptor+Required+for+Vascular+Smooth+Muscle+Cell+Responses+to+Heparin.">Transmembrane Protein 184A Is a Receptor Required for Vascular Smooth Muscle Cell Responses to Heparin.</a> J Biol Chem. 291, 5326-5341 (2016).</li><li>Daher, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Toxoplasma+TgPH1,+a+pleckstrin+homology+domain-containing+protein+that+binds+to+the+phosphoinositide+PI(3,5)P.">Identification of Toxoplasma TgPH1, a pleckstrin homology domain-containing protein that binds to the phosphoinositide PI(3,5)P.</a> Mol Biochem Parasitol. , (2016).</li><li>Vit, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+identification+of+membrane+proteins+based+on+analysis+of+trypsin-protected+transmembrane+segments.">Large-scale identification of membrane proteins based on analysis of trypsin-protected transmembrane segments.</a> J Proteomics. , (2016).</li><li>Attwood, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topology+based+identification+and+comprehensive+classification+of+four-transmembrane+helix+containing+proteins+(4TMs)+in+the+human+genome.">Topology based identification and comprehensive classification of four-transmembrane helix containing proteins (4TMs) in the human genome.</a> BMC genomics. 17, 268 (2016).</li><li>Zou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Identification+of+Jatropha+curcas+Aquaporin+Genes+and+the+Comparative+Analysis+Provides+Insights+into+the+Gene+Family+Expansion+and+Evolution+in+Hevea+brasiliensis.">Genome-Wide Identification of Jatropha curcas Aquaporin Genes and the Comparative Analysis Provides Insights into the Gene Family Expansion and Evolution in Hevea brasiliensis.</a> Front Plant Sci. 7, 395 (2016).</li><li>Gilotti, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin+responses+in+vascular+smooth+muscle+cells+involve+cGMP-dependent+protein+kinase+(PKG).">Heparin responses in vascular smooth muscle cells involve cGMP-dependent protein kinase (PKG).</a> J Cell Physiol. 229, 2142-2152 (2014).</li><li>Farwell, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin+Decreases+in+Tumor+Necrosis+Factor+alpha+(TNFalpha)-induced+Endothelial+Stress+Responses+Require+Transmembrane+Protein+184A+and+Induction+of+Dual+Specificity+Phosphatase+1.">Heparin Decreases in Tumor Necrosis Factor alpha (TNFalpha)-induced Endothelial Stress Responses Require Transmembrane Protein 184A and Induction of Dual Specificity Phosphatase 1.</a> J Biol Chem. 291, 5342-5354 (2016).</li><li>Xu, D., Esko, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demystifying+heparan+sulfate-protein+interactions.">Demystifying heparan sulfate-protein interactions.</a> Annu Rev Biochem. 83, 129-157 (2014).</li><li>Chiodelli, P., Bugatti, A., Urbinati, C., Rusnati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin/Heparan+sulfate+proteoglycans+glycomic+interactome+in+angiogenesis:+biological+implications+and+therapeutical+use.">Heparin/Heparan sulfate proteoglycans glycomic interactome in angiogenesis: biological implications and therapeutical use.</a> Molecules. 20, 6342-6388 (2015).</li><li>Slee, J. B., Lowe-Krentz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+realignment+and+cofilin+regulation+are+essential+for+barrier+integrity+during+shear+stress.">Actin realignment and cofilin regulation are essential for barrier integrity during shear stress.</a> J Cell Biochem. 114, 782-795 (2013).</li><li>Patton, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+heparin-binding+protein+using+monoclonal+antibodies+that+block+heparin+binding+to+porcine+aortic+endothelial+cells.">Identification of a heparin-binding protein using monoclonal antibodies that block heparin binding to porcine aortic endothelial cells.</a> The Biochemical journal. 311, 461-469 (1995).</li><li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin.">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Skalamera, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+genome+scale+lentiviral+vector+library+for+EF1alpha+promoter-driven+expression+of+human+ORFs+and+identification+of+human+genes+affecting+viral+titer.">Generation of a genome scale lentiviral vector library for EF1alpha promoter-driven expression of human ORFs and identification of human genes affecting viral titer.</a> PloS one. 7, 51733 (2012).</li><li>Castro, M., Nikolaev, V. O., Palm, D., Lohse, M. J., Vilardaga, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turn-on+switch+in+parathyroid+hormone+receptor+by+a+two-step+parathyroid+hormone+binding+mechanism.">Turn-on switch in parathyroid hormone receptor by a two-step parathyroid hormone binding mechanism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 16084-16089 (2005).</li><li>Albertazzi, L., Arosio, D., Marchetti, L., Ricci, F., Beltram, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+FRET+analysis+with+the+EGFP-mCherry+fluorescent+protein+pair.">Quantitative FRET analysis with the EGFP-mCherry fluorescent protein pair.</a> Photochem Photobiol. 85, 287-297 (2009).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+organization+of+the+ATP-sensitive+potassium+channel+complex+examined+by+fluorescence+resonance+energy+transfer.">Domain organization of the ATP-sensitive potassium channel complex examined by fluorescence resonance energy transfer.</a> J Biol Chem. 288, 4378-4388 (2013).</li><li>Christiansen, E., Hudson, B. D., Hansen, A. H., Milligan, G., Ulven, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Characterization+of+a+Potent+Free+Fatty+Acid+Receptor+1+(FFA1)+Fluorescent+Tracer.">Development and Characterization of a Potent Free Fatty Acid Receptor 1 (FFA1) Fluorescent Tracer.</a> J Med Chem. 59, 4849-4858 (2016).</li><li>Chiang, C. F., Okou, D. T., Griffin, T. B., Verret, C. R., Green Williams, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+rendered+susceptible+to+proteolysis:+positions+for+protease-sensitive+insertions.">fluorescent protein rendered susceptible to proteolysis: positions for protease-sensitive insertions.</a> Arch Biochem Biophys. 394, 229-235 (2001).</li></ol>

Les protocoles présentés ici ont été conçus pour fournir une preuve de confirmation pour l&#39;identification de TMEM184A en tant que récepteur de l&#39; héparine dans des cellules vasculaires 1. techniques Knockdown sont couramment utilisés comme un mécanisme permettant de confirmer l&#39;identification de nouvelles protéines. Cependant, une certaine perte fonctionnelle après l&#39;effet de choc est en général pas suffisamment de preuves qu&#39;une protéine candidate est en fait le...

L&#39;identification des protéines candidates pour de nouvelles fonctions dépend souvent des protocoles d&#39;isolement basées sur l&#39;affinité suivie par une détermination de séquence partielle. De récents exemples de protéines nouvellement identifiées comprennent la protéine transmembranaire 184A (TMEM184A), un récepteur d&#39;héparine identifié après les interactions d&#39;affinité d&#39; héparine 1 et TgPH1, une protéine de domaine pleckstrine qui se lie phosphoinositide PI (3,5) P2 2. Autre nouvelle identification des protéines implique une analyse de séquence directe de peptides tel que , par Vit, et al. qui a utilisé des peptides transmembranaires pour identifier les produits de protéines à partir de gènes précédemment non caractérisés 3. De même, l&#39; identification de nouvelles séquences de protéines peut être réalisée en utilisant la bioinformatique à la recherche de familles de protéines précédemment caractérisées telles que l&#39; identification de nouvelles protéines 4TM 4. L&#39;examen des séquences de gènes de la famille des aquaporines a alainsi cédé l&#39;identification de nouveaux membres avec de nouvelles fonctions 5. Après l&#39;identification, l&#39;analyse de la fonction des protéines est typiquement une étape suivante qui peut parfois être examinée à l&#39;aide d&#39;un dosage spécifique de la fonction de la protéine comme dans le cas d&#39;aquaporine. Lorsque cela est possible, la fonction d&#39;une protéine nouvellement identifiée peut être examinée avec enzymatique spécifique ou des tests de fonction similaires in vitro. Étant donné que de nombreuses fonctions nouvelles protéines dépendent des interactions complexes qui se produisent uniquement dans des cellules ou organismes intacts, dans des essais in vitro ne sont pas toujours efficaces. Cependant, les dosages in vivo doivent être conçus de telle sorte qu&#39;ils dépendent de la séquence du gène. Dans la culture cellulaire, et / ou des organismes modèles simples, knockdown peut apporter la preuve pour l&#39;identification de protéines / fonction 6. Avec de nouvelles protéines identifiées comme indiqué ci-dessus, il est souvent insuffisant pour simplement renverser une protéine pour confirmer la fonction, und la conception des tests fonctionnels in vivo qui dépendent de la séquence du gène devient important pour la caractérisation de nouvelles protéines. L&#39;identification récente de TMEM184A comme un récepteur d&#39;héparine (qui module la prolifération dans le muscle lisse vasculaire et des réponses inflammatoires dans les cellules endothéliales) utilisant la chromatographie d&#39;affinité et MALDI MS 1, 7 a été l&#39;occasion de développer une collection d&#39;essais après knockdown a abouti à des résultats cohérents avec l&#39;identification . Une étude récente a confirmé que l&#39; héparine interagit spécifiquement avec plusieurs facteurs de croissance, leurs récepteurs, les composants de la matrice extracellulaire, des récepteurs d&#39;adhésion cellulaire et d&#39; autres protéines 8. Dans le système vasculaire, l&#39; héparine et l&#39; héparane sulfate protéoglycanes (contenant du sulfate d&#39; héparane des chaînes de structure similaire à l&#39; héparine) interagissent avec plusieurs centaines de protéines 9. Pour confirmer fonctionnellement that TMEM184A a été impliqué dans l&#39;absorption d&#39;héparine et de liaison, les techniques qui employaient la construction de gène pour TMEM184A ont été développés. Le présent rapport comprend une collection de tests basés sur une GFP-TMEM184A construire pour une utilisation à confirmer l&#39;identité du TMEM184A comme un récepteur de l&#39;héparine.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="767">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GFP-TMEM184A construct</td>
			<td style="width:71px;">OriGene</td>
			<td style="width:119px;">RG213192</td>
			<td style="width:361px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Rhodamine-Heparin</td>
			<td style="width:71px;">Creative PEGWorks</td>
			<td style="width:119px;">HP-204</td>
			<td style="width:361px;">Light Sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescein-Heparin</td>
			<td style="width:71px;">Creative PEGWorks</td>
			<td style="width:119px;">HP-201</td>
			<td style="width:361px;">Light Sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Mowiol</td>
			<td style="width:71px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">475904-100GM</td>
			<td style="width:361px;"></td>
		</tr>
		<tr height="141">
			<td height="141" style="height:141px;width:216px;">Paraformaldehyde (methanol free)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">PI28908 at Fisher</td>
			<td style="width:361px;">Use in Fume Hood</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:216px;">Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96 well dishes)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">PI15510 at Fisher</td>
			<td style="width:361px;">Pay attention to shelf-life</td>
		</tr>
		<tr height="161">
			<td height="161" style="height:161px;width:216px;">Black 96 well plates</td>
			<td style="width:71px;">Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">064432 at Fisher</td>
			<td style="width:361px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">A7r5 vascular smooth muscle cell line</td>
			<td style="width:71px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL 1444</td>
			<td style="width:361px;">Can be exchanged into MEM medium1</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">BAOEC bovine aortic endothelial cells</td>
			<td style="width:71px;">Cell Applications, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">B304-05</td>
			<td style="width:361px;">Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells</td>
			<td style="width:71px;">Cell Applications, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">B354-05</td>
			<td style="width:361px;">Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">RAOEC rat aortic endothelial cells</td>
			<td style="width:71px;">Cell Applications, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">R304-05a</td>
			<td style="width:361px;">Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:216px;">Biotinylated anti-GFP</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MA5-15256-BTIN</td>
			<td style="width:361px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptavidin-coated beads</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S1638</td>
			<td style="width:361px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">HeBS</td>
			<td style="width:71px;">Available from Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:361px;">Can be prepared in the lab.&#160; The pH is 6.8</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">TMEM184A antibody to the N-terminus</td>
			<td style="width:71px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc292006</td>
			<td style="width:361px;">Only known TMEM184A antibody to N-terminal region.</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:216px;">TMEM184A antibody to the C-terminus</td>
			<td style="width:71px;">Obtained from ProSci Inc, Poway, CA&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Pro Sci 5681</td>
			<td style="width:361px;">ProSci used in figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">GFP antibodies</td>
			<td style="width:71px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc9996</td>
			<td style="width:361px;">Used in figures 5</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3</td>
			<td style="width:71px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC) 
			715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3)</td>
			<td style="width:361px;">Minimal cross-reactivity to minimize any non-specific staining.</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">CHAPS</td>
			<td style="width:71px;">Purchased from Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C5849</td>
			<td style="width:361px;">Note that this specific catalog number has been discontinued.&#160; Supplier will provide information regarding replacement.</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Live imaging 35 mm dishes</td>
			<td style="width:71px;">MatTek (Ashland MA)</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0 &#8211; 20 mm - C</td>
			<td style="width:361px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens</td>
			<td style="width:361px;">Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens</td>
			<td style="width:361px;">Used for images in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens</td>
			<td style="width:361px;">Used for images in Figure 2C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Electroporation equipment</td>
			<td style="width:71px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">Gene Pulser X-Cell System</td>
			<td style="width:361px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:71px;">Available from MidSci</td>
			<td style="width:119px;">EC2L</td>
			<td style="width:361px;">Can also be obtained from equipment supplier</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Plate reader</td>
			<td style="width:71px;">TECAN</td>
			<td style="width:119px;">TECAN Infinite&#174; m200 Pro plate reader</td>
			<td style="width:361px;">Readings in the middle of the wells rather than at the surface.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="101" style="height:101px;width:216px;">Computer program for measuring staining intensity</td>
			<td style="width:71px;">Image J</td>
			<td style="width:119px;">https://imagej.nih.gov/ij/ 
			Program and information available on-line</td>
			<td style="width:361px;">Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell Culture trypsin solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>T4174</td>
			<td style="width:361px;">purchased as a 10X solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a gfp-tagged tmem184a construct for confirmation of heparin receptor identity

Lorsque de nouvelles protéines sont identifiées par l&#39;isolement et l&#39;analyse bioinformatique basée sur l&#39;affinité, ils sont souvent en grande partie non caractérisés. Des anticorps dirigés contre des peptides spécifiques de la séquence prédite permettent des expériences de localisation. Cependant, d&#39;autres interactions possibles avec les anticorps ne peuvent souvent pas être exclus. Cette situation a permis d&#39;élaborer une série de tests qui dépendent de la séquence protéique. Plus précisément, une construction contenant la séquence de gène couplé à la séquence codant pour la GFP à l&#39;extrémité C-terminale de la protéine a été obtenu et utilisé à ces fins. Des expériences pour caractériser la localisation, l&#39; affinité du ligand, et le gain de la fonction ont été initialement conçues et réalisées pour confirmer l&#39;identification des TMEM184A comme un récepteur d&#39;héparine 1. En outre, la construction peut être utilisé pour des études portant sur la membrane des questions de topologie et des interactions protéine-ligand détaillés. Le présent rapport présente arange de protocoles expérimentaux basés sur la construction GFP-TMEM184A exprimé dans les cellules vasculaires qui pourraient facilement être adapté à d&#39;autres nouvelles protéines.

Bien qu&#39;en théorie, la transfection d&#39;une construction d&#39; ADN dans des cellules peut être réalisée avec des réactifs de transfection lipophiles, les rapports précédents indiquent une transfection plus efficace de la GFP dans les cellules endothéliales construit en utilisant une électroporation 12. Le protocole fourni ici typiquement obtenu GFP dans la construction d&#39;expression supérieure à 80% des cellules endothéliales primaires et dé...

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Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

Un TMEM184A codant pour la construction d&#39;une étiquette de la GFP à l&#39;extrémité carboxy-terminale conçu pour l&#39;expression eucaryote, a été utilisé dans des essais visant à confirmer l&#39;identification de TMEM184A comme récepteur d&#39;héparine dans les cellules vasculaires.

L&#39;utilisation d&#39;un TMEM184A GFP-tagged Construct pour Confirmation de Heparin Receptor Identity

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies ...

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The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

PCR de fusion haute résolution pour le complément du récepteur 1 Polymorphisme de longueur Le génotypage: un outil novateur pour l&#39;évaluation de la sensibilité des gènes de la maladie d&#39;Alzheimer

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

Une méthode pour étudier le polymorphisme C924T du gène récepteur Thromboxane A2

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Un commutateur gène du singulier axée sur les récepteurs de l’Ecdysone pour délibérée Expression du transgène avec robustesse, réversibilité et perméabilité négligeable

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

High-throughput Identification des séquences régulatrices du gène à l’aide de prochaine génération séquençage du Chromosome circulaire Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Protéine endogène de marquage dans l’homme induites par les cellules souches pluripotentes à l’aide de CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

qKAT : quantitatif semi-Automated typage des cellules tueuses-gènes de récepteurs immunoglobuline-like

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Basé sur la spectrométrie de masse protéomique des Analyses à l’aide de la base de données OpenProt de dévoiler de nouvelles protéines traduit de cadres ouverts de lecture Non canoniques

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...