Name: ligand nano-cluster arrays in a supported lipid bilayer
Uploaded: 2017-04-23T14:00:00
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Wir danken Laurent Limozin, Pierre Dillard und Astrid Wahl für fruchtbare Diskussionen über zelluläre Anwendungen fort. Wir danken auch Frederic Bedu von PLANETE Reinraum für seine Hilfe bei SEM Beobachtungen. Diese Arbeit wurde teilweise durch den Europäischen Forschungsrat über Zuschuss Nr 307104 FP / 2007-2013 / ERC finanziert.

1. Reinigung Glasdeckel-Dias und Beobachtungskammern <ol><li> Ordnet die Glasabdeckung Schlitten auf einem mehr Diamagazin aus einem inerten Material wie Polytetrafluorethylen (PTFE). </li><li> Taucht das Fach mit Rutschen und die Beobachtungskammer in einer Tensidlösung (jedes Produkt zu empfehlen für die Reinigung von Quarzküvetten ist geeignet). </li><li> Unter Verwendung eines Ultraschallbades, ultra-beschallen in der Tensidlösung für 30 min bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C). </li><li> Spülen Sie ...

<ol>
	<li>Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2002).</li><li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+Receptor-Proximal+Signals+Are+Sustained+in+Peripheral+Microclusters+and+Terminated+in+the+Central+Supramolecular+Activation+Cluster.">T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster.</a> Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).</li><li>Kaizuka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+for+segregating+T+cell+receptor+and+adhesion+molecules+during+immunological+synapse+formation+in+Jurkat+T+cells.">Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).</li><li>Dustin, M. L., Groves, J. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+tuning+and+efficient+T+cell+activation+with+stimulatory+aCD3+nanoarrays.">Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays.</a> Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).</li><li>Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-clustering+of+ligands+on+surrogate+antigen+presenting+cells+modulates+T+cell+membrane+adhesion+and+organization.">Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization.</a> Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).</li><li>Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometric+protein-patch+arrays+on+glass+and+polydimethylsiloxane+for+cell+adhesion+studies.">Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies.</a> Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).</li><li>Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+and+intermembrane+distance:+case+study+of+avidin+and+E-cadherin+mediated+adhesion.">Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion.</a> Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).</li><li>Sengupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+tissue+surfaces+by+supported+membrane+coupled+ultra-thin+layer+of+hyaluronic+acid.">Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid.</a> Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).</li><li>Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independently+controlling+protein+dot+size+and+spacing+in+particle+lithography.">Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography.</a> Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).</li><li>Massou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+ordered+topographical+and+chemical+nano-features+from+anodic+alumina+templates.">Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates.</a> Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).</li><li>Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperativity+in+adhesion+cluster+formation+during+initial+cell+adhesion.">Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion.</a> Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).</li><li>Arnold, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cell+polarization+and+migration+by+a+gradient+of+nanoscale+variations+in+adhesive+ligand+spacing.">Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing.</a> Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+spreading+and+focal+adhesion+dynamics+are+regulated+by+spacing+of+integrin+ligands.">Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands.</a> Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Schvartzman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanolithographic+Control+of+the+Spatial+Organization+of+Cellular+Adhesion+Receptors+at+the+Single-Molecule+Level.">Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level.</a> Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).</li><li>Mossman, K., Groves, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+supported+membranes+as+tools+for+quantitative+studies+of+the+immunological+synapse.">Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse.</a> Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).</li><li>Furlan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+CD45+both+positively+and+negatively+regulates+T+cell+receptor+phosphorylation+in+reconstituted+membrane+protein+clusters.">Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters.</a> J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).</li><li>Hsu, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+mobility+modulates+immunological+synapse+formation+and+T+cell+activation.">Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation.</a> PloS One. 7 (2), e32398 (2012).</li><li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+integrin+binding+to+Arg-Gly-Asp+peptide+activates+actin+polymerization+and+contractile+movement+that+stimulates+outward+translocation.">Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).</li></ol>

Die kritischen Schritte in dem oben beschriebenen Protokoll werden zur Bildung der Nano dots Protein verwandt oder der Hinterfüllen des Raumes um die Punkte, die durch einen unterstützten Lipiddoppelschicht. Der erste kritische Schritt in Bezug auf Protein-Nanopunkten ist die Herstellung der Wulstes-Maske. Die Reinigung des Deckelschlitten ist kritisch. Die Folien müssen entweder mit einer Reinigungslösung gereinigt werden, die für die Reinigung von Quarzküvetten, oder mit einem Sauerstoffplasma wird empfohlen. An...

<html> Zelladhäsion erfolgt durch spezialisierte Zelladhäsionsmoleküle (CAMs), Proteine, die auf der Zellmembran, die zu ihrem Gegenstück der Bindung auf der extrazellulären Matrix oder auf einem anderen Zelle fähig sind. Auf adhärierten Zellen, die meisten Adhäsionsmoleküle , einschließlich der allgegenwärtigen Integrin und Cadherin, werden in Form von Clustern 1 gefunden. Die Wechselwirkung von T-Lymphozyten (T-Zellen) mit Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) stellt ein besonders treffendes Beispiel für die Bedeutung des Rezeptor-Cluster an der Grenzfläche zwischen den beiden Zellen gebildet - oft eine immunologischen Synapse bezeichnet. Bei der Bildung die erste Berührung mit dem APC, T - Zell - Rezeptoren (TCRs) auf der Oberfläche der T - Zellen - Form micron Skala Cluster , die dazu dienen , als Signalisierungsplattformen 2, 3, 4, und werden schließlich zentralisieren einen größeren zentralen supramolekularen Cluster zu bilden (cSMAC )lass = &quot;Xref&quot;&gt; 5, 6, 7. Vor kurzem wurde es , dass auf der APC Seite gezeigt, die Liganden des TCR sind auch 8 gebündelt. Im Zusammenhang mit der T - Zell-APC - Interaktion, die Bereitstellung von Hybrid - Systemen, wo der APC durch eine künstliche Oberfläche funktionalisierte mit relevanten Proteinen nachgeahmt wird, vorgerückt ist unser Verständnis der synaptischen Schnittstelle 2, 3, 4, 5, 6, 7 . In diesem Zusammenhang ist es höchst relevant APC-Mimetikum Oberflächen zu gestalten, dass ein oder mehr Aspekte der Zielzelle erfassen. Wenn beispielsweise Liganden auf unterstützte Lipiddoppelschichten aufgepfropft werden, können sie in der Ebene der Doppelschicht diffundieren, ahmen die Situation auf der APC Oberfläche und zur gleichen Zeit der Bildung des erlaubencSMAC 6, 7. Ähnlich haben die Cluster auf der APC nachgeahmt von 14 Inseln von Liganden in einem Meer von Polymeren , 9, 10, 11, 12, 13, zu schaffen. Allerdings haben diese beiden Merkmale bisher nicht kombiniert. Hier beschreiben wir eine neuartige Technik Nano-Dots von Anti-CD3 zu erzeugen (ein Antikörper, der den TCR-Komplexes Targets) von einer Lipiddoppelschicht mit diffundierenden Lipiden umgeben. Die Bilayer wird unter Verwendung von Langmuir-Blodgett / Langmuir-Schäfer - Technik abgeschieden 7, 15, 16 und , falls gewünscht, könnte mit einem bestimmten Protein funktionalisiert werden - beispielsweise der Ligand der T - Zell - Integrin (genannt ICAM1). Darüber hinaus cou die anti-CD3-Protein dotsld mit einem anderen Antikörper oder CAM ersetzt werden. Während wir die Proteine, die für die zukünftige Nutzung als Plattform für die T-Zell-Adhäsion Studien gewählt haben, detailliert die Strategie hier kann für jedes Protein und sogar DNA angepasst werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Assistent, Karl Hecht KG&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observation chamber</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex)</td>
			<td>Hella Analytics</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-sonicator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Labbox</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallizer&#160;</td>
			<td>Shott</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidine</td>
			<td>Thermo Fischer Scientifique</td>
			<td>84607</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P3813</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water MQ&#160;</td>
			<td>ELGA, Veolia France</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica beads</td>
			<td>Corpuscular Inc</td>
			<td>147114-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A3648</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A8549</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dansyl-PE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810330C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>650471</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe&#160;</td>
			<td>Dominique Dustcher , France</td>
			<td>74453</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film balance</td>
			<td>NIMA</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>TIRF-III system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium Target&#160;</td>
			<td>Kurt J. Lesker Compagny, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radio Frequency Magnetron sputtering Syst&#232;me&#160;</td>
			<td>modified SMC 600 tool by ALCATEL , France</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ligand nano-cluster arrays in a supported lipid bilayer

Derzeit gibt es ein beträchtliches Interesse an in einem Meer von passivierten Oberfläche geordnete Anordnungen von Adhäsionsprotein Inseln zu schaffen für zellbiologische Untersuchungen. In den letzten Jahren hat es immer deutlicher, dass lebende Zellen reagieren, nicht nur auf die biochemische Natur der Moleküle ihnen vorgestellt, sondern auch auf die Art, wie diese Moleküle präsentiert werden. Erstellen von Protein Mikromuster wird deshalb jetzt Standard in vielen biologischen Laboratorien; Nanostrukturen sind auch zugänglich. Doch im Zusammenhang mit den Zell-Zell-Interaktionen, besteht ein Bedarf an Mustern nicht nur Proteine, sondern auch Lipid-Doppelschichten. Solche Dual proteo-lipidic Musterung ist bisher nicht leicht zugänglich. Wir bieten eine einfache Technik Protein Nanopunkte auf Glas und schlagen ein Verfahren zu schaffen unterstützten den Zwischenpunktraum mit einer unterstützten Lipiddoppelschicht (SLB) verfüllen. Vom Fotobleichen des Tracers enthalten fluoreszierende Lipide im SLB, zeigen wir, dass die Doppelschicht in-pl erhebliche aufweistane Fluidität. Funktionalisierung der Proteinpunkte mit fluoreszierenden Gruppen ermöglicht es uns, Bild sie und zu zeigen, dass sie in einem regelmäßigen hexagonalen Gitter geordnet. Die typische Punktgröße beträgt etwa 800 nm und der Abstand hier gezeigt, ist 2 um. Diese Substrate werden erwartet als nützliche Plattformen für die Zelladhäsion, Migration und mechano-Sensing-Studien dienen.

Die Fluoreszenzbilder wurden analysiert, um den Abstand und die Größe der Punkte zu messen. Typische Abstände wurden gefunden 1.900 ± 80 nm und typischer Punktgrßenauswahlmittel sein betrug 600 ± 100 nm (Figur 1g). Der Abstand wird durch die Größe der Perlen für die Maske verwendet, eingestellt. Die Punktgröße wird durch die sickenGröße sowie Abscheidebedingungen eingestellt. Der SLB ist eindeutig um die Protein - Punkte und nicht auf sie (Figur 2),<...

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Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Wir stellen ein Protokoll Glas mit nanometrischer Proteinflecken von einem Fluid Lipiddoppelschicht umgeben funktionalisieren. Diese Substrate sind kompatibel mit den fortschrittlichen optischen Mikroskopie und sollen als Plattform für die Zelladhäsion und Migration Studien dienen.

Ligand Nano-Cluster-Arrays in einem unterstützten Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Cellular Lipidextraktion für Targeted Stable Isotope Dilution Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Analyse

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Forschung

Biotechnik

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipiddoppelschicht Vesicle Erzeugung anhand Mikrofluidik Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Herstellung von Mica Unterstützte Lipiddoppelschichten für Hochauflösende Optische Mikroskopie Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biomembran Fabrication durch das Lösungsmittel-unterstützten Lipiddoppelschicht (SALB) Methode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Einfache und genaue Mechanotherapie Profilierung Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

Automatisierte Lipid Bilayer Membrane Formation eines Polydimethylsiloxans Dünnschicht unter Verwendung

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer

Temperaturgesteuerte Montage und Charakterisierung eines Droplet Interface Bilayers

The droplet interface bilayer (DIB) method for assembling lipid bilayers (i.e., DIBs) between lipid-coated aqueous droplets in oil offers key benefits ...