Name: dextran enhances the lentiviral transduction efficiency of murine and human primary nk cells
Uploaded: 2018-01-15T12:30:00
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Wir danken Lucia Sammarco und ihr Lulus Lemonade Stand für Inspiration, Motivation und Unterstützung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch NIH R01 AI102893 und NCI R01 CA179363 (S.M) unterstützt; NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI-1R01CA164225 (L.W); der Alex Lemonade Stand Foundation (S.M.); Das HRHM-Programm des MACC Fonds (S.M.; S.R.; M.S.T); die Nikolaus-Familienstiftung (S.M.); Gardetto Familie (S.M.); die Hyundai-Gelehrten Programm (M.S.T.); Hyundai Hoffnung auf Rädern (S.R.); die MACC-Fonds (M.S.T. und S.M.); die Kinder-Forschungsinstitut, MCW (S.R.); und Kathy Duffey Fogerty Award (M.J.R.).

Alle tierischen Protokolle folgten die humane und ethische Behandlung der Tiere und durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) in Biomedical Research Center (BRC) des Medical College of Wisconsin (MCW), Milwaukee, WI angenommen wurden. Die Verwendung von menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) wurde durch die institutionelle Review Board (IRB) des Blut-Forschungsinstituts der Blut von Wisconsin, Milwaukee, WI genehmigt.
(1) Mäuse, Zell-Linien und Vekto...

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	<li>Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+natural+killer+cells.">Functions of natural killer cells.</a> Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).</li><li>Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+despite+immunosurveillance:+immunoselection+and+immunosubversion.">Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion.</a> Nat. Rev. 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Immunol. 14, 1127-1136 (2013).</li><li>Regunathan, J., Chen, Y., Wang, D., Malarkannan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+receptor-mediated+NK+cell+function+is+regulated+by+inhibitory+Ly49+receptors.">NKG2D receptor-mediated NK cell function is regulated by inhibitory Ly49 receptors.</a> Blood. 105, 233-240 (2005).</li><li>Awasthi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1b+facilitates+NK+cell+functions+via+IQGAP1-mediated+signalosomes.">Rap1b facilitates NK cell functions via IQGAP1-mediated signalosomes.</a> J. Exp. Med. 207, 1923-1938 (2010).</li><li>Rajasekaran, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+Growth+Factor-{beta}-activated+Kinase+1+Regulates+Natural+Killer+Cell-mediated+Cytotoxicity+and+Cytokine+Production.">Transforming Growth Factor-{beta}-activated Kinase 1 Regulates Natural Killer Cell-mediated Cytotoxicity and Cytokine Production.</a> J Biol. Chem. 286, 31213-31224 (2011).</li><li>Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+for+the+delivery+of+DNA+into+mammalian+cells.">Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells.</a> Methods Mol. Biol. 246, 391-411 (2004).</li><li>Sutlu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+intracellular+antiviral+defense+mechanisms+augments+lentiviral+transduction+of+human+natural+killer+cells:+implications+for+gene+therapy.">Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 23, 1090-1100 (2012).</li><li>Cornetta, K., Anderson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protamine+sulfate+as+an+effective+alternative+to+polybrene+in+retroviral-mediated+gene-transfer:+implications+for+human+gene+therapy.">Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy.</a> J. Virol. Methods. 23, 187-194 (1989).</li><li>Toyoshima, K., Vogt, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+and+inhibition+of+avian+sarcoma+viruses+by+polycations+and+polyanions.">Enhancement and inhibition of avian sarcoma viruses by polycations and polyanions.</a> Virology. 38, 414-426 (1969).</li><li>Jensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bi-specific+CD3+x+NCAM+antibody:+a+model+to+preactivate+T+cells+prior+to+tumour+cell+lysis.">The bi-specific CD3 x NCAM antibody: a model to preactivate T cells prior to tumour cell lysis.</a> Clin. Exp. Immunol. 134, 253-263 (2003).</li></ol>

Diese Studie zeigt, dass die Verwendung von Dextran als ein kationisches Polymer-Agent die Lentivirale Transduktion Effizienz der murinen und menschliche primäre NK-Zellen verbessert. Darüber hinaus haben andere kationische Mittel, wie Pb oder PS, keinen erkennbaren Einfluss auf die Lieferung von viralen Vektoren in menschliche primäre NK-Zellen. Zuvor wurde nachgewiesen, dass Pb gen Transduktion in menschlichen T-Zellen-17ergänzen kann. Diese Ergebnisse zeigen jedoch, dass weder Pb noch PS ei...

Natürliche killer (NK)-Zellen sind die großen lymphatischer Bevölkerung des angeborenen Immunsystems1. NK-Zellen fungieren als Erstlinien Verteidiger der Host Immunantwort gegen Tumoren und Infektionen2,3,4. NK-Zellen spielen auch eine zentrale Rolle bei der Entwicklung der Toleranz durch die Sekretion von potenten Zytokine und Chemokine5. Aufgrund ihrer starken Fähigkeit, gezielt zu beseitigen Tumorzellen werden mehrere klinische Studien durchgeführt, um Spender-abgeleitete menschliche NK-Zellen als eine Adoptive Immuntherapie bei Krebs6,7zu bewerten. Im Gegensatz zu T-Zellen muss der Entwicklungsbiologie von NK-Zellen noch gut charakterisierten8. Diese Unkenntnis ist teilweise wegen fehlender effizienter Techniken, die Gene von Interesse an Maus oder menschliche primäre NK-Zellen zu liefern. Aus diesen Gründen haben die meisten NK-Zell in Zell-Linien, anstatt in Primärzellen Studien. Daher ist die Notwendigkeit für ein zuverlässiges und effizientes Protokoll zum primären NK-Zellen mit Genen von Interesse transduzieren entscheidend.
Das übergeordnete Ziel dieser Studie war es, eine konsistente und zuverlässige Methode zu formulieren, mit der primären menschlichen oder murine NK-Zellen mit Lenti oder Retroviren ausgestrahlt werden könnte.
Frühere Studien, die versuchten, dieses Problem zu beheben wurden durchgeführt, weitgehend über die vorübergehende Umwandlung von primären NK-Zellen. Dazu gehören Plasmid Transfektion9,10, Epstein - Barr-Virus (EBV) / retrovirale Hybrid Vektor11, "Vaccinia" Vektoren12,13und Ad5/F35 Chimären adenovirale Vektoren14. Trotz der bescheidenen Wirkungsgrad dieser Techniken macht die vergängliche Natur der Transduktion sie ungeeignet für die langfristige Nutzung von gentechnisch veränderten NK-Zellen. Einige neuere Studien haben retrovirale Vektoren verwendet, um transduzieren NK-Zellen, erfordern mehrere Zyklen der Infektion auf ein akzeptables Niveau der gen-Expression-11,-15zu erreichen. Im Gegensatz zur retroviralen Vektoren können Lentivirale Vektoren Wirtszelle nuclear Import Maschinen die virale Vorintegration Komplex translozieren in den Zellkern. Dies ist ein großer limitierender Faktor bei der Replikation des Virus in nicht-teilenden Zellen, die primäre NK-Zellen enthalten.
Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Rezeptoren der Zelloberfläche und virale Partikel erlauben virale Aufnahme in die Zelle. Die ersten Kämpfe zwischen der Virushülle Proteine und ihre Verwandten Host-Rezeptoren könnte wegen der potenziellen negativen Ladungen zwischen diesen beiden bestehenden beschränkt werden. Das Grundprinzip hinter vielen Transduktion Techniken ist, dass die Zugabe von kationischen polymeren, z. B. Polybrene (Pb), Protamin Sulfat (PS) oder Dextran, könnte eine positive Ladung an die Rezeptoren der Zelloberfläche und damit die Bindung der Virushülle ergänzen Proteine. Dies erhöht die Fusion-Effizienz und die Aufnahme der viralen Partikel von den Zellen16. Obwohl es berichtet wurde, dass Pb oder PS Gentransfer in T Zellen17verbessern kann, ihre Anwendung nicht in die Transduktion Effizienz der primären NK-Zellen auswirken. Darüber hinaus wurde eine vergleichende Analyse zwischen dieser Reagenzien mit primären NK-Zellen nicht durchgeführt. In dieser Studie wurden die Transduktion Wirkungsgrade der drei kationische Polymere verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass unter diesen drei kationischen polymeren nur Dextran effiziente virale Transduktion in Maus und menschliche primäre NK-Zellen deutlich erhöht.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90-64-91-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene (Pb)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protamine sulfate (PS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p3369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATALANTA</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-001-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25000CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma (IFN-&#947; )</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-7311-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium lodding staining solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>51-66211E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>PHOENIX</td>
			<td>NDC 57319-559-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK cell negative selection kit</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>19855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yac-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K562</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Jakson</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Cornnig</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody-based negative selection kits</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>19055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>51Chromium (Cr)-release assays</td>
			<td>perkin elmer&#39;s</td>
			<td>NEZ030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA kits</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>00-4201-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5887-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear polyethylenimine</td>
			<td>polysciences</td>
			<td>23966-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Life Science</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dextran enhances the lentiviral transduction efficiency of murine and human primary nk cells

Die effizienteste Transduktion bestimmter Gene in natürlichen killer (NK)-Zellen ist eine große Herausforderung gewesen. Erfolgreiche Transductions sind entscheidend für die Bestimmung der Rolle des Gens von Interesse in der Entwicklung, Differenzierung und Funktion von NK-Zellen. Die jüngsten Fortschritte im Zusammenhang mit Chimären Antigen-Rezeptoren (Autos) im Krebsimmuntherapie betonen die Notwendigkeit für eine effiziente Methode zu exogenen Gene Effektor Lymphozyten liefern. Die Wirkungsgrade von Lentivirale vermittelte gen Transductions in primären Mensch oder Maus-NK-Zellen bleiben deutlich niedriger, was ein wichtiger begrenzender Faktor. Die jüngsten Fortschritte mit kationischen polymeren, z. B. Polybrene, zeigen eine verbesserte gen Transduktion Effizienz in T-Zellen. Doch scheiterte dieser Produkte, die Transduktion Wirkungsgrade von NK-Zellen zu verbessern. Diese Arbeit zeigt, dass Dextran, verzweigte Glucan Polysaccharid, verbessert erheblich die Transduktion Effizienz von Mensch und Maus primären NK-Zellen. Dieser hoch reproduzierbare Transduktion Methodik bietet ein kompetenter Werkzeug für transducing menschliche primäre NK-Zellen, die klinischen gen Lieferung Anwendungen und somit NK-Zell-basierte Krebs-Immuntherapie. erheblich verbessern können

Dextran induziert die effiziente Gentransfer Lentivirale Vektor in primären menschlichen und murinen NK-Zellen
Menschlichen NK-Zellen wurden isoliert und gereinigt von PBMC (mit einer Reinheit von mehr als 85 %) und über Nacht mit rIL-2 300 U/mL inkubiert. Diese primäre NK-Zellen wurden dann mit GFP Lentivirus am abwechslungsreichen Mannigfaltigkeiten der Infektion ausgestrahlt (MOI; 3, 10 und 20 IU pro Zelle) in 24-Well-Platten...

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Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Das Ziel dieser Studie war es, Technologien zu formulieren, die für erfolgreiche gen Transduktion in primären natürlichen killer (NK) Zellen ermöglichen. Die Dextran-vermittelten Lentivirale Transduktion von Mensch oder Maus primären NK Zellen führt zu höheren Wirkungsgraden der gen-Expression. Diese Methode des Gens Transduktion wird NK Zelle genetischen Manipulation erheblich verbessern.

Dextran erhöht die Effizienz der Lentivirale Transduktion von murinen und menschliche primäre NK-Zellen

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansion, Reinigung und Functional Assessment of Human peripheren Blut NK-Zellen

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolierung und intravenöse Injektion von Maus-Knochenmark stammenden Monozyten

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Zuverlässig und High Efficiency Extraktion von Nieren-Immunzellen

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Retrovirale Transduktion von T-Helferzellen als genetischer Ansatz zur Untersuchung Mechanismen der Kontrolle ihrer Differenzierung und Funktion

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Ein Flow Cytometry-basierte Zytotoxizität Assay für die Beurteilung der menschlichen NK-Zell-Aktivität

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Bewertung der synaptischen Schnittstelle der primären menschlichen T-Zellen aus peripherem Blut und Lymphgewebe

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

Generation von Knock-out-Grund- und erweiterten menschlichen NK-Zellen mit Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Hochdurchsatz-Messung der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz in Säugerzellen

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...