Name: dextran enhances the lentiviral transduction efficiency of murine and human primary nk cells
Uploaded: 2018-01-15T12:30:00
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ルチア着きましたと彼女のルルのレモネード スタンド、インスピレーション、動機、サポートに感謝しますこの作品は、NIH R01 AI102893 と NCI R01 CA179363 (スウェン); によって一部で支持されました。NHLBI HL087951 (レジスタ)。NIH-CA151893-K08 (M.J.R.);NCI 1R01CA164225 (L.W);アレックスのレモネード スタンド財団 (スウェン);MACC 基金 (スウェン; の HRHM プログラムレジスタ;M.S.T);ニコラス ・ ファミリー基金 (スウェン);Gardetto 家族 (スウェン);現代学者はプログラム (M.S.T.);現代車輪 (レジスタ); 希望MACC の資金 (M.S.T. ・ スウェン);子どもの研究所、MCW (レジスタ)。キャシー ダフェイ ・ フォガティ賞 (M.J.R.)。

動物のすべてのプロトコルは、動物の人道的・倫理的扱いに従い、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、ウィスコンシン医科大学 (MCW)、ミルウォーキー、ウィスコンシンの医学研究センター (BRC) 内で承認されました。ひと末梢血単核球 (Pbmc) の使用は、ウィスコンシン州ミルウォーキー、ウィスコンシンの血液センターの血液研究所の制度的レビュー委員会 (IRB) によってを承認されました?...

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	<li>Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+natural+killer+cells.">Functions of natural killer cells.</a> Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).</li><li>Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+despite+immunosurveillance:+immunoselection+and+immunosubversion.">Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion.</a> Nat. Rev. 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Immunol. 14, 1127-1136 (2013).</li><li>Regunathan, J., Chen, Y., Wang, D., Malarkannan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+receptor-mediated+NK+cell+function+is+regulated+by+inhibitory+Ly49+receptors.">NKG2D receptor-mediated NK cell function is regulated by inhibitory Ly49 receptors.</a> Blood. 105, 233-240 (2005).</li><li>Awasthi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1b+facilitates+NK+cell+functions+via+IQGAP1-mediated+signalosomes.">Rap1b facilitates NK cell functions via IQGAP1-mediated signalosomes.</a> J. Exp. Med. 207, 1923-1938 (2010).</li><li>Rajasekaran, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+Growth+Factor-{beta}-activated+Kinase+1+Regulates+Natural+Killer+Cell-mediated+Cytotoxicity+and+Cytokine+Production.">Transforming Growth Factor-{beta}-activated Kinase 1 Regulates Natural Killer Cell-mediated Cytotoxicity and Cytokine Production.</a> J Biol. Chem. 286, 31213-31224 (2011).</li><li>Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+for+the+delivery+of+DNA+into+mammalian+cells.">Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells.</a> Methods Mol. Biol. 246, 391-411 (2004).</li><li>Sutlu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+intracellular+antiviral+defense+mechanisms+augments+lentiviral+transduction+of+human+natural+killer+cells:+implications+for+gene+therapy.">Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 23, 1090-1100 (2012).</li><li>Cornetta, K., Anderson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protamine+sulfate+as+an+effective+alternative+to+polybrene+in+retroviral-mediated+gene-transfer:+implications+for+human+gene+therapy.">Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy.</a> J. Virol. 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本研究は、カチオン性ポリマー剤はマウスとヒト NK 細胞のレンチ ウイルスの伝達効率を向上、デキストランの使用を示します。また、Pb や PS などの他のカチオン性エージェントあるウイルスのベクトルの配信で目に見える効果ヒト NK 細胞に以前は、Pb が人間の T 細胞17の遺伝子伝達を強化できます実証されています。これらの結果はしかし、Pb も PS ひと NK 細胞に似たよ?...

ナチュラル キラー (NK) 細胞は、生得の免疫組織の1の主要なリンパ球人口です。NK 細胞は、腫瘍や感染症の2,3,4に対する宿主の免疫応答の最初の行の擁護者として機能します。NK 細胞はまた強力なサイトカインとケモカイン5の分泌を通じて耐性の開発で中心的な役割を再生します。ターゲットし、腫瘍細胞を排除する強力な能力、がん6、7の養子免疫療法としてドナー由来ヒト NK 細胞を評価する複数の臨床試験を行っています。T 細胞と対照をなして NK 細胞の発生生物学を特徴8となりますが。知識のこの欠乏は部分的にマウスやヒト NK 細胞に興味の遺伝子を提供する効率的な技術の不在のため。これらの理由から、NK 細胞研究のほとんどは、初代培養細胞ではなく細胞株で行われています。したがって、信頼性と効率的なプロトコルへと興味の遺伝子を持つ NK 細胞を変換するための必要性は重要です。
本研究の全体的な目標は、人間またはマウス NK 細胞でした遺伝子導入やレトロ ウイルスで導入する一貫性のある、信頼性の高い方法を策定します。
主として NK 細胞の一時的な変換を使用して、この問題に対処しようとした以前の研究が行われています。これはプラスミッド トランスフェクション9,10、エプスタインバー ウイルス (EBV) が含まれています/レトロ ハイブリッド ベクトル11, ワクシニア ベクトル12,13、および Ad5/F35 キメラ アデノ14。これらのテクニックのささやかな効率にもかかわらず、伝達の過渡的な性質に、遺伝子組み換えの NK 細胞の長期的な利用には不向きになります。いくつかの最近の研究は、NK 細胞、遺伝子発現11,15の許容可能なレベルを達成するために感染症の複数のサイクルを必要とする変換にレトロウイルスベクターを使用しています。レンチウイルスベクターは retroviral ベクトルと対照をなして宿主細胞核輸入機械を使用して、ウイルスの事前統合複合体を核に若しできます。これは、NK 細胞を含む非分裂細胞にウイルスの複製の主要な制限要因です。
異なった細胞表面受容体とウイルス粒子の相互作用は、セルにウイルスの取り込みを許可します。ウイルスのエンベロープタンパク質と同種のホスト受容体の初期の契約は、既存の 2 つの潜在的な負電荷のために限ることができます。多くの伝達技術の背後にある理論的根拠は, デキストラン投与やプロタミン硫酸塩 (PS)、polybrene (Pb) などのカチオン性ポリマー添加が細胞表面の受容体に正電荷を与えるでき、それによりウイルスの封筒の結合を強化蛋白質。これはセル16融合効率とウイルス粒子の吸収を高めます。Pb や PS が T 細胞17遺伝子伝達を改善できることは報告されて、応用は NK 細胞の伝達効率で任意の効果を持っていなかった。また、NK 細胞を使用してこれらの試薬の比較分析は実行されていません。この研究では、3 つのカチオン性ポリマーの伝達効率を比較しました。結果は、これら 3 つのカチオン性ポリマーの中でのみデキストラン大幅に向上マウスとヒト NK 細胞の両方に効率的なウイルス伝達を示します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90-64-91-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene (Pb)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protamine sulfate (PS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p3369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATALANTA</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-001-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25000CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma (IFN-&#947; )</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-7311-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium lodding staining solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>51-66211E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>PHOENIX</td>
			<td>NDC 57319-559-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK cell negative selection kit</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>19855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yac-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K562</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Jakson</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Cornnig</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody-based negative selection kits</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>19055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>51Chromium (Cr)-release assays</td>
			<td>perkin elmer&#39;s</td>
			<td>NEZ030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA kits</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>00-4201-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5887-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear polyethylenimine</td>
			<td>polysciences</td>
			<td>23966-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Life Science</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dextran enhances the lentiviral transduction efficiency of murine and human primary nk cells

ナチュラル キラー (NK) 細胞に特定の遺伝子の効率的な伝達は、主要な挑戦をされています。成功した伝達は、分化と NK 細胞の機能に関する研究の興味の遺伝子の役割を定義するのに重要です。がん免疫療法におけるキメラ抗原受容体 (自動車) に関連する最近の進歩は、エフェクター細胞に遺伝子を提供する効率的な方法の必要性を強調します。主な人間またはマウスの NK 細胞にレンチ ウイルス媒介性遺伝子伝達の効率は、主要な制限要因である大幅低いまま。Polybrene などのカチオン性ポリマーによる最近の進歩は、T 細胞で改善された遺伝子伝達効率を表示します。ただし、これらの製品は、NK 細胞の情報伝達効率を改善するために失敗しました。人間の伝達効率とマウスの NK 細胞が大幅に向上作業、デキストラン、分岐グルカンの多糖を示しています。この再現性の高い情報伝達方法臨床遺伝子配信アプリケーションとこのように NK 細胞を用いたがん免疫療法.を大幅に改善することができます人間プライマリ NK 細胞の伝達の有能なツールを提供します。

デキストラン誘導レンチウイルスベクター主の人間およびマウスの NK 細胞の効率的な遺伝子導入
ヒト NK 細胞分離 PBMC (純度 85% 以上) の精製し、リライアンス 2 300 U/mL で夜通し孵化します。これら NK 細胞が、感染症の様々 な多重度で GFP レンチ増殖型 (MOI; 3、10、およびセルあたり 20 の IU) 8 μ G/ml Pb や PS、デキストランの存?...

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Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

本研究の目的は、自然なキラー (NK) 細胞の正常な遺伝子伝達を可能にする技術を策定することでした。人間のデキストランを介したレンチ ウイルス伝達や遺伝子発現効率の向上でマウスの主な NK 細胞実験結果。遺伝子伝達のこのメソッドは、NK 細胞の遺伝的操作を大幅に向上させます。

デキストランは、マウスとヒト NK 細胞のレンチ ウイルスの伝達効率を向上します。

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

拡大、精製、及びヒト末梢血NK細胞の機能的評価

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

初代ヒトナイーブおよびメモリーT細胞から誘導した調節性T細胞の生成

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

単離とマウス骨髄由来の単球の静脈注射

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

腎、免疫細胞の信頼性と高効率抽出

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

遺伝的分化を制御するメカニズムを研究するためのアプローチと機能などのヘルパーT細胞のレトロウイルス形質導入

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

ヒト NK 細胞活性の評価の流れのフローサイトメトリーを用いた細胞毒性の試金

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

末梢血およびリンパ組織から主な人間の T 細胞のシナプスのインタ フェースの評価

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

Cas9 Ribonucleoproteins を使用してノックアウト プライマリおよび拡張された人間の NK 細胞の生成

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

哺乳類細胞における効率を再封止膜の高スループット測定

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

デキストランは、マウスとヒト NK 細胞のレンチ ウイルスの伝達効率を向上します。

デキストランは、マウスとヒト NK 細胞のレンチウイルスの伝達効率を向上します。