Name: dextran enhances the lentiviral transduction efficiency of murine and human primary nk cells
Uploaded: 2018-01-15T12:30:00
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Agradecemos a Lucia Sammarco e Lemonade Stand do seu Lulu para inspiração, motivação e apoio. Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH R01 AI102893 e ICN R01 CA179363 (S.M.); NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); o Alex Lemonade Stand Foundation (S.M.); o programa HRHM do fundo MACC (S.M.; S.R.; MAGALHAES); Fundação da família de Nicholas (S.M.); a família de Gardetto (S.M.); os estudiosos de Hyundai Program (M.S.T.); Hyundai esperança sobre rodas (S.R.); o fundo do MACC (M.S.T. e S.M.); Instituto das crianças de pesquisa, MCW (S.R.); e o prêmio de Kathy Duffey Fogerty (M.J.R.).

Todos os protocolos de animais seguiram o tratamento humanizado e ético de animais e foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) dentro o centro de pesquisa biomédica (BRC) da faculdade médica de Wisconsin (MCW), Milwaukee, WI. O uso de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foi aprovado por institucional Review Board (IRB), do Instituto de pesquisa de sangue do centro de sangue de Wisconsin, Milwaukee, WI.
1. ratos, linhas celulares e vetores
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	<li>Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+natural+killer+cells.">Functions of natural killer cells.</a> Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).</li><li>Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+despite+immunosurveillance:+immunoselection+and+immunosubversion.">Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion.</a> Nat. Rev. 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Methods. 296, 115-123 (2005).</li><li>Jiang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syk+regulation+of+phosphoinositide+3-kinase-dependent+NK+cell+function.">Syk regulation of phosphoinositide 3-kinase-dependent NK cell function.</a> J. Immunol. 168, 3155-3164 (2002).</li><li>Burshtyn, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+residues+amino-terminal+of+cytoplasmic+tyrosines+contribute+to+the+SHP-1-mediated+inhibitory+function+of+killer+cell+Ig-like+receptors.">Conserved residues amino-terminal of cytoplasmic tyrosines contribute to the SHP-1-mediated inhibitory function of killer cell Ig-like receptors.</a> J. Immunol. 162, 897-902 (1999).</li><li>Schroers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+human+T+lymphocytes+and+natural+killer+cells+by+Ad5/F35+chimeric+adenoviral+vectors.">Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35 chimeric adenoviral vectors.</a> Exp. Hematol. 32, 536-546 (2004).</li><li>Imai, C., Iwamoto, S., Campana, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modification+of+primary+natural+killer+cells+overcomes+inhibitory+signals+and+induces+specific+killing+of+leukemic+cells.">Genetic modification of primary natural killer cells overcomes inhibitory signals and induces specific killing of leukemic cells.</a> Blood. 106, 376-383 (2005).</li><li>Denning, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+transductional+efficiency+of+lentiviral+vectors:+effect+of+sera+and+polycations.">Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: effect of sera and polycations.</a> Mol. Biotechnol. 53, 308-314 (2013).</li><li>Lamers, C. H., Willemsen, R. A., Luider, B. A., Debets, R., Bolhuis, R. 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M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+protocol+for+lentiviral+vector+mass+production.">New protocol for lentiviral vector mass production.</a> Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).</li><li>Rajasekaran, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+by+Fyn-ADAP+via+the+Carma1-Bcl-10-MAP3K7+signalosome+exclusively+regulates+inflammatory+cytokine+production+in+NK+cells.">Signaling by Fyn-ADAP via the Carma1-Bcl-10-MAP3K7 signalosome exclusively regulates inflammatory cytokine production in NK cells.</a> Nat. Immunol. 14, 1127-1136 (2013).</li><li>Regunathan, J., Chen, Y., Wang, D., Malarkannan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+receptor-mediated+NK+cell+function+is+regulated+by+inhibitory+Ly49+receptors.">NKG2D receptor-mediated NK cell function is regulated by inhibitory Ly49 receptors.</a> Blood. 105, 233-240 (2005).</li><li>Awasthi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1b+facilitates+NK+cell+functions+via+IQGAP1-mediated+signalosomes.">Rap1b facilitates NK cell functions via IQGAP1-mediated signalosomes.</a> J. Exp. Med. 207, 1923-1938 (2010).</li><li>Rajasekaran, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+Growth+Factor-{beta}-activated+Kinase+1+Regulates+Natural+Killer+Cell-mediated+Cytotoxicity+and+Cytokine+Production.">Transforming Growth Factor-{beta}-activated Kinase 1 Regulates Natural Killer Cell-mediated Cytotoxicity and Cytokine Production.</a> J Biol. Chem. 286, 31213-31224 (2011).</li><li>Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+for+the+delivery+of+DNA+into+mammalian+cells.">Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells.</a> Methods Mol. Biol. 246, 391-411 (2004).</li><li>Sutlu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+intracellular+antiviral+defense+mechanisms+augments+lentiviral+transduction+of+human+natural+killer+cells:+implications+for+gene+therapy.">Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 23, 1090-1100 (2012).</li><li>Cornetta, K., Anderson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protamine+sulfate+as+an+effective+alternative+to+polybrene+in+retroviral-mediated+gene-transfer:+implications+for+human+gene+therapy.">Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy.</a> J. Virol. Methods. 23, 187-194 (1989).</li><li>Toyoshima, K., Vogt, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+and+inhibition+of+avian+sarcoma+viruses+by+polycations+and+polyanions.">Enhancement and inhibition of avian sarcoma viruses by polycations and polyanions.</a> Virology. 38, 414-426 (1969).</li><li>Jensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bi-specific+CD3+x+NCAM+antibody:+a+model+to+preactivate+T+cells+prior+to+tumour+cell+lysis.">The bi-specific CD3 x NCAM antibody: a model to preactivate T cells prior to tumour cell lysis.</a> Clin. Exp. Immunol. 134, 253-263 (2003).</li></ol>

Este estudo demonstra que o uso de dextran como um agente de polímero catiônico aprimora a eficiência de Lentivirus transdução de murino e humanas primária as células NK. Além disso, outros agentes catiônicos, como Pb ou PS, não tem nenhum efeito discernível sobre a entrega de vetores virais em células primárias humanas de NK. Anteriormente, foi demonstrado que o Pb pode aumentar transdução de gene humano de células T17. Estes resultados, no entanto, sugerem que Pb nem PS têm uma ...

Assassino naturais (NK) células são a população linfocitária principal do sistema imune inato1. Células NK funcionam como os defensores da primeira linha da resposta imune do hospedeiro contra infecções e tumores de3,2,4. Células NK também desempenham um papel central no desenvolvimento da tolerância através da secreção de potentes citocinas e quimiocinas5. Devido à sua potente capacidade para atacar e eliminar as células do tumor, vários ensaios clínicos estão sendo realizados para avaliar derivados de doador humanas células NK como uma adotivos imunoterapia para o câncer6,7. Em contraste com as células T, a biologia do desenvolvimento das células NK ainda tem que ser bem caracterizadas8. Esta falta de conhecimento é parcialmente devido à ausência de técnicas eficientes que entregam os genes de interesse para mouse ou células NK primárias humanas. Por estas razões, a maioria das células NK estudos foram conduzidos em linhas de células, em vez de células primárias. Portanto, a necessidade de um protocolo confiável e eficiente para transduce primárias células NK com genes de interesse é crucial.
O objetivo geral deste estudo foi a formulação de um método consistente e confiável, pelo qual células NK primárias de humano ou murino poderiam ser transfectadas com lenti - ou retrovírus.
Foram efectuados estudos anteriores que tentou resolver este problema, em grande parte, usando a transformação transitória das principais células NK. Isso inclui o plasmídeo transfeccao9,10, vírus de Epstein - Barr (EBV) /11de vetor retroviral híbrido, vaccinia vectores12,13e de quimérico vetores adenovírus Ad5/F3514. Apesar da modesta eficiência destas técnicas, a natureza transitória de transdução torna inadequados para a utilização a longo prazo das células NK geneticamente modificadas. Alguns estudos recentes têm utilizado vetores retrovirais para transduce células NK, que requerem vários ciclos de infecção para alcançar um nível aceitável de gene expressão11,15. Em contraste com vetores retrovirais, vetores de Lentivirus podem usar maquinaria de importação nuclear da célula hospedeira para translocar o complexo pré-integração viral para o núcleo. Este é um importante fator limitante na replicação do vírus em células não-divisão, que incluem primárias células NK.
Interações entre diferentes receptores de superfície e partículas virais permitam absorção viral dentro da célula. Os compromissos iniciais entre as proteínas do envelope viral e seus receptores cognatos anfitrião podem ser limitados devido as cargas negativas potenciais existentes entre estes dois. A lógica por trás de muitas técnicas de transdução é que a adição de polímeros catiônicos, como polybrene (Pb), sulfato de protamina (PS) ou dextrano, poderia dar uma carga positiva para os receptores de superfície e, assim, aumentar a ligação do envelope viral proteínas. Isto aumentará a eficiência de fusão e a absorção de partículas virais em células16. Embora tem sido relatado que Pb ou PS pode melhorar a transferência de genes em células de T17, sua aplicação não teve qualquer efeito na eficiência transdução da primárias células NK. Além disso, uma análise comparativa entre estes reagentes usando primárias células NK não foi realizada. Neste estudo, foram comparadas as eficiências de transdução dos três Polímeros Catiônicos. Os resultados mostram que, entre estes três polímeros catiônicos, apenas dextran aumenta significativamente eficiente transdução viral em rato e em células NK primárias humanas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90-64-91-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene (Pb)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protamine sulfate (PS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p3369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATALANTA</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-001-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25000CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma (IFN-&#947; )</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-7311-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium lodding staining solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>51-66211E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>PHOENIX</td>
			<td>NDC 57319-559-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK cell negative selection kit</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>19855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yac-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K562</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Jakson</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Cornnig</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody-based negative selection kits</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>19055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>51Chromium (Cr)-release assays</td>
			<td>perkin elmer&#39;s</td>
			<td>NEZ030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA kits</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>00-4201-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5887-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear polyethylenimine</td>
			<td>polysciences</td>
			<td>23966-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Life Science</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dextran enhances the lentiviral transduction efficiency of murine and human primary nk cells

A transdução eficiente de genes específicos nas células de (NK) assassinos naturais tem sido um grande desafio. Transductions sucesso são fundamentais para definir o papel do gene de interesse no desenvolvimento, diferenciação e função das células NK. Avanços recentes relacionados com os receptores de antígeno Quimérico (carros) em imunoterapia acentuam a necessidade de um método eficiente entregar genes exógenos para linfócitos efetores. As eficiências de transductions gene Lentivirus mediada em humanos primários ou rato NK células permanecem significativamente mais baixas, que é dos principais fatores limitante. Avanços recentes usando polímeros catiônicos, tais como polybrene, mostram uma eficiência de transdução melhorada de gene em células T. No entanto, estes produtos não conseguiram melhorar as eficiências de transdução das células NK. Este trabalho mostra o dextrano, um polissacárido ramificado glucan, melhora significativamente a eficiência de transdução de humanos e células NK primárias de rato. Esta metodologia de transdução altamente reprodutível fornece uma ferramenta competente para transducing humana primária as células NK, que podem melhorar muito clínico gene entrega aplicativos e, portanto, NK baseada em célula imunoterapia.

Dextrano induz a transferência do gene eficiente do vetor de Lentivirus em células NK primárias de murino e humanas
Células NK humanas foram isoladas e purificadas de PBMC (com uma pureza superior a 85%) e incubadas durante a noite com rIL-2 300 U/mL. Estas células NK primárias então foram transfectadas com lentivirus GFP em variadas multiplicidades de infecção (MOI; 3, 10 e 20 IU por célula) em placas de 24 poços na pre...

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Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

O objetivo deste estudo foi a formulação de tecnologias que permitem a transdução de gene bem sucedido na primária natural killer (NK) as células. O dextran-mediada Lentivirus transdução de humanos ou rato primário NK células os resultados, em maior eficiência de expressão do gene. Este método de transdução gene vastamente irá melhorar a manipulação genética de células NK.

Dextran aumenta a eficiência de Lentivirus transdução das células NK primário murino e humano

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansão, Purificação e Avaliação Funcional de Células NK do sangue periférico

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Imunologia e Infecção

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Geração de Células T reguladoras induzidas a partir de células T humanas primárias Naïve e Memória

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac modificação do sistema Transposon de células T primárias Humanos

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolamento e injecção intravenosa de Murino de Medula Óssea Derivado monócitos

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Extração Eficiência confiável e alta de rim células imunes

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Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Transdução retroviral de células T helper como uma abordagem genética para estudar mecanismos que controlam a sua diferenciação e função

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Um ensaio de citotoxicidade baseados em citometria de fluxo para a avaliação da atividade das células NK humana

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Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Avaliação da Interface sináptica de células T humano primário do sangue periférico e tecido linfoide

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Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

Geração de células NK humana primárias e expandida de Knock-out usando ribonucleoproteínas Cas9

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Medição de alto rendimento da membrana plasmática, efectuou a eficiência em células de mamíferos

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...