Name: dextran enhances the lentiviral transduction efficiency of murine and human primary nk cells
Uploaded: 2018-01-15T12:30:00
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Agradecemos a Lucía Sammarco y su Lulu Lemonade Stand de inspiración, motivación y apoyo. Este trabajo fue apoyado en parte por los NIH R01 AI102893 y NCI R01 CA179363 (S.M.); NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); el Alex Lemonade Stand Foundation (S.M.); el programa HRHM del fondo MACC (S.M.; S.R.; [M.S.T); la Fundación de la familia de Nicholas (S.M.); la familia Gardetto (S.M.); Programa de los eruditos de Hyundai (M.S.T.); Hyundai esperanza sobre ruedas (S.R.); el fondo MACC (M.S.T. y S.M.); Instituto de investigación de los niños, MCW (S.R.); y el Premio de Kathy Duffey Fogerty (M.J.R.).

Todos los protocolos de animales siguieron el tratamiento humano y ético de los animales y fueron aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) en el centro de investigación biomédica (BRC) de la Universidad médica de Wisconsin (MCW), Milwaukee, WI. El uso de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) fue aprobado por la Junta de revisión institucional (IRB) del Instituto de investigación de sangre de la sangre centro de Wisconsin, Milwaukee, WI.
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	<li>Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+natural+killer+cells.">Functions of natural killer cells.</a> Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).</li><li>Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+despite+immunosurveillance:+immunoselection+and+immunosubversion.">Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion.</a> Nat. Rev. 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Immunol. 162, 897-902 (1999).</li><li>Schroers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+human+T+lymphocytes+and+natural+killer+cells+by+Ad5/F35+chimeric+adenoviral+vectors.">Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35 chimeric adenoviral vectors.</a> Exp. 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M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+protocol+for+lentiviral+vector+mass+production.">New protocol for lentiviral vector mass production.</a> Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).</li><li>Rajasekaran, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+by+Fyn-ADAP+via+the+Carma1-Bcl-10-MAP3K7+signalosome+exclusively+regulates+inflammatory+cytokine+production+in+NK+cells.">Signaling by Fyn-ADAP via the Carma1-Bcl-10-MAP3K7 signalosome exclusively regulates inflammatory cytokine production in NK cells.</a> Nat. Immunol. 14, 1127-1136 (2013).</li><li>Regunathan, J., Chen, Y., Wang, D., Malarkannan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+receptor-mediated+NK+cell+function+is+regulated+by+inhibitory+Ly49+receptors.">NKG2D receptor-mediated NK cell function is regulated by inhibitory Ly49 receptors.</a> Blood. 105, 233-240 (2005).</li><li>Awasthi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1b+facilitates+NK+cell+functions+via+IQGAP1-mediated+signalosomes.">Rap1b facilitates NK cell functions via IQGAP1-mediated signalosomes.</a> J. Exp. Med. 207, 1923-1938 (2010).</li><li>Rajasekaran, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+Growth+Factor-{beta}-activated+Kinase+1+Regulates+Natural+Killer+Cell-mediated+Cytotoxicity+and+Cytokine+Production.">Transforming Growth Factor-{beta}-activated Kinase 1 Regulates Natural Killer Cell-mediated Cytotoxicity and Cytokine Production.</a> J Biol. Chem. 286, 31213-31224 (2011).</li><li>Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+for+the+delivery+of+DNA+into+mammalian+cells.">Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells.</a> Methods Mol. Biol. 246, 391-411 (2004).</li><li>Sutlu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+intracellular+antiviral+defense+mechanisms+augments+lentiviral+transduction+of+human+natural+killer+cells:+implications+for+gene+therapy.">Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 23, 1090-1100 (2012).</li><li>Cornetta, K., Anderson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protamine+sulfate+as+an+effective+alternative+to+polybrene+in+retroviral-mediated+gene-transfer:+implications+for+human+gene+therapy.">Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy.</a> J. Virol. 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Este estudio demuestra que el uso de dextrano como un polímero catiónico agente aumenta la eficiencia de transducción lentivirales de las células NK primarias murinas y humanas. Además, otros agentes catiónicos, como el Pb o PS, no tienen ningún efecto discernible sobre la entrega de vectores virales en las células NK primarias humanas. Previamente, se ha demostrado que Pb puede aumentar la transducción de genes en el humano de células T17. Sin embargo, estos resultados, sugieren que ni ...

Natural killer (NK) células son la población linfocítica importante del sistema inmune innato1. Las células NK funcionan como los defensores de primera línea de la respuesta inmune del huésped contra tumores e infecciones2,3,4. Las células NK también juegan un papel central en el desarrollo de la tolerancia a través de la secreción de potentes citoquinas y quimiocinas5. Debido a su potente capacidad de apuntar y eliminar las células tumorales, se están realizando varios ensayos clínicos para evaluar células NK humanas derivados de donantes como una inmunoterapia adoptiva para cáncer6,7. En contraste con las células T, la biología del desarrollo de las células NK aún tiene que ser bien caracterizado8. Esta falta de conocimiento es parcialmente debido a la ausencia de técnicas eficientes que entregan los genes de interés a ratón o humano primarias células NK. Por estas razones, se han realizado más estudios de NK-célula en líneas celulares, en lugar de células primarias. Por lo tanto, es crucial la necesidad de un protocolo eficiente y confiable transducir las células primarias de NK con genes de interés.
El objetivo general de este estudio fue elaborar un método consistente y confiable por que podrían ser transduced primaria humanas o murinas de células NK con lenti - o retrovirus.
Se han realizado estudios anteriores que han intentado resolver este problema, utilizando en gran medida la transformación transitoria de las células NK primarias. Esto incluye el plásmido transfección9,10, Virus de Epstein - Barr (EBV) / híbrido retroviral vector11, vaccinia vectores12,13y Ad5/F35 quimérica adenoviral vectores14. A pesar de la modesta eficacia de estas técnicas, la naturaleza transitoria de la transducción de señales les hace inadecuados para la utilización a largo plazo de las células NK modificadas genéticamente. Algunos estudios recientes han utilizado vectores retrovirales para transducir las células NK, que requieren varios ciclos de infección para alcanzar un nivel aceptable de gene expresión11,15. En contraste con vectores retrovirales, vectores lentivirales pueden utilizar maquinaria de importación nuclear de célula huésped para translocan el complejo de la integración viral en el núcleo. Este es un factor limitante en la replicación del virus en las células no se dividen, que incluyen las células NK primarias.
Interacciones entre los diferentes receptores de superficie celular y partículas virales permiten la absorción viral en la célula. Los combates iniciales entre las proteínas de la envoltura vírica y sus receptores cognados host podrían ser limitados debido a las cargas negativas potenciales existentes entre estos dos. El fundamento de muchas técnicas de transducción de señales es que la adición de polímeros catiónicos, como el polibreno (Pb), sulfato de protamina (PS) o dextrán, podría dar una carga positiva de los receptores de superficie celular y aumentar así la Unión de la envoltura vírica proteínas. Esto aumentará la eficacia de la fusión y la absorción de las partículas virales de las células16. Aunque se ha reportado que la Pb o PS puede mejorar la transferencia de genes en las células de T17, su aplicación no tuvo ningún efecto en la eficiencia de la transducción de las células NK primarias. Por otra parte, no se ha realizado un análisis comparativo entre estos reactivos utilizando células NK primarias. En este estudio, se compararon la eficiencia de la transducción de los tres polímeros catiónicos. Los resultados muestran que, entre estos tres polímeros catiónicos, sólo dextrano mejora significativamente eficiente transducción viral en ratón y células NK primarias humanas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90-64-91-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene (Pb)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protamine sulfate (PS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p3369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATALANTA</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-001-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25000CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma (IFN-&#947; )</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-7311-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium lodding staining solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>51-66211E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>PHOENIX</td>
			<td>NDC 57319-559-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK cell negative selection kit</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>19855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yac-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K562</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Jakson</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Cornnig</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody-based negative selection kits</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>19055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>51Chromium (Cr)-release assays</td>
			<td>perkin elmer&#39;s</td>
			<td>NEZ030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA kits</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>00-4201-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5887-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear polyethylenimine</td>
			<td>polysciences</td>
			<td>23966-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Life Science</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dextran enhances the lentiviral transduction efficiency of murine and human primary nk cells

El transduction eficiente de genes específicos en células de naturales del asesinos (NK) ha sido un gran reto. Transducciones éxito son fundamentales para definir el papel del gen de interés en el desarrollo, diferenciación y función de las células NK. Los avances recientes relacionados con receptores de antígeno quimérico (coches) en inmunoterapia del cáncer acentúan la necesidad de un método eficiente entregar genes exógenos a los linfocitos effector. Las eficiencias de transducciones de lentivirales mediada por el gen en humanos primarios o células de NK de ratón siguen siendo considerablemente bajas, que es un factor limitante. Avances recientes usando polímeros catiónicos, como el polibreno, muestran una eficacia de transducción genética mejorada en células de T. Sin embargo, estos productos no pudo mejorar la eficiencia de la transducción de las células NK. Este trabajo muestra dextrano, un polisacárido ramificado glucan, mejora significativamente la eficiencia de la transducción de humano y ratón primaria NK. Esta metodología altamente reproducible de la transducción de señales proporciona una herramienta competente para transducing humano primario las células NK, que pueden mejorar enormemente gene clínica entrega aplicaciones y así inmunoterapia de cáncer basadas en células NK.

Dextrano induce a la transferencia génica eficiente de vectores lentivirales en primaria murinas y humanas de las células NK
Células NK humanas fueron aisladas y purificadas de PBMC (con una pureza de más del 85%) y se incubó toda la noche con U/mL de rIL-2 300. Estas células NK primarias fueron entonces transduced con lentivirus GFP en variados multiplicidades de infección (MOI; 3, 10 y 20 UI por la célula) en placas de 24...

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Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

El objetivo de este estudio fue elaborar tecnologías que permiten la transducción génica exitosa en natural killer (NK) las células primarias. La transducción lentivirales dextrano-mediada de humanos o resultados primarios de las células NK del ratón en una mayor eficiencia de expresión génica. Este método de transducción génica mejorará enormemente la manipulación genética de la célula NK.

Dextrano mejora la eficiencia de transducción lentivirales de las células NK primaria murinas y humanas

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Expansión, purificación y evaluación funcional de la sangre periférica humana células NK

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Investigación

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Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

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