Name: use of the soft-agar overlay technique to screen for bacterially produced inhibitory compounds
Uploaded: 2017-01-14T14:00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds at JoVE.com

This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.

1. إعداد طاف لفحصها لآخر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 0.5 ملغ / مل محلول المخزون من ميتوميسين C عن طريق إذابة كمية مناسبة إلى العقيمة 0.1 M MgSO 4 عازلة (على سبيل المثال 1 ملغ ميتوميسين C / 2 مل العازلة). الأسهم تخزين عند 4 درجات مئوية في ضوء حاوية المحمية (ميتوميسين C خفيف الحساسة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلقيح مستعمرة واحدة من P. syringae إلى 3 مل من الملك B المتوسط (KB) مرق 14. احتضان أكثر من ليلة مع اهتزاز (200 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة (21-25 درجة مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح اليوم التالي، يخفف من ثقافة مرق 1/100 إلى 3 مل من مرق KB جديدة. احتضان لمدة 3-4 ساعة مع اهتزاز عند درجة حرارة الغرفة. إضافة ميتوميسين C (0.5 ميكروغرام / مل، وتركيز النهائي). احتضان الثقافة خلال الليل مع اهتزاز عند درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: ميتوميسين C يسبب مزدوجة فواصل الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل، وبالتالي تحفيز استجابة SOS الخلية، مما يؤدي إلى إنتاج كل من الجراثيم وbacteriocins. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه 1-2 مل ميتوميسين C الناجم عن الثقافات عن طريق الطرد المركزي في 20000 x ج لمدة 5 دقائق في مقعد كبار microcentrifuge ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وتعقيم supernatants ثقافة إما عن طريق تمرير طاف من خلال 0.22 ميكرون مرشح حجم المسام أو عن طريق معالجة طاف مع الكلوروفورم (100 الكلوروفورم ميكرولتر لكل 1 مل طاف). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة استخدام الكلوروفورم، ودوامة الخليط لمدة 15 ثانية، والسماح يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. بعد الحضانة، وأجهزة الطرد المركزي الخليط في 20000 x ج لمدة 5 دقائق. ملاحظة: الكلوروفورم يقتل خلايا بكفاءة عن طريق الانحلال أغشيتها. الاستفادة من استخدام الكلوروفورم على مرشح التعقيم هو أنه أرخص وأسهل لتوسيع نطاق حتى إذا تجهيز العديد من (&gt; 20) عينات في وقت واحد. قد يكون هناك احتمال أن يكون النشاط القتل نظرا فقدت بعد العلاج الكلوروفورم نتيجة للتجزؤ إلى المرحلة العضوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة، المرحلة المائية العليا باستخدام الماصة 1 مل إلى الطازجة والمعقمة 1.5 أو 2.0 ملmicrofuge أنبوب. يجب الحرص على عدم نقل أي من طبقة الكلوروفورم الدنيا (فمن الأفضل لإزالة أقل من المرحلة المائية لتجنب المرحل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان طاف نقل لم يسبق لهم اللعب في غطاء الدخان للسماح للالكلوروفورم المتبقية لتتبخر (عدة ساعات). متجر supernatants في 4 درجات مئوية. </li></ol></li></ol> 2. فصل وتركيز عالية الوزن الجزيئي للجراثيم المركبات التي البولي ايثيلين جلايكول (PEG) الهطول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لطاف معقم، إضافة كلوريد الصوديوم وPEG 8000 لتركيزات النهائي 1 م و 10٪ على التوالي. عكس مرارا العينة حتى يتم حل كل من كلوريد الصوديوم وPEG تماما. احتضان العينات في حمام الثلج لمدة 1 ساعة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. ينبغي أن تشكل بيليه في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي. صب وطاف و resuspend بيليه في حجم المطلوب (مثل 1/10 أو 1/100 من المجلد طاف الأصليأوميا) من العازلة (10 ملي تريس، 10 ملي MgSO 4، ودرجة الحموضة 7.0) من قبل pipetting المتكررة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PEG المتبقية من قبل اثنين من قلع متتابعة مع حجم مساو من كلوروفورم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين الكلوروفورم مع بيليه معلق ودوامة لمدة 10 إلى 15 ثانية، ثم الطرد المركزي الخليط في 20000 x ج لمدة 5 دقائق. نقل، المرحلة المائية العليا لأنبوب microfuge جديدة. كرر هذا الاستخلاص حتى بدون واجهة بيضاء بين المرحلة المائية والعضوية مرئيا (مجموع عادة 2 الاستخراج). السماح الكلوروفورم المتبقية لتتبخر من supernatants المستخرج في غطاء الدخان. </li></ol></li></ol> 3. إعداد تراكب واختبار Supernatants لآخر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلقيح مستعمرة واحدة من سلالة P. syringae لفحصها للحساسية إلى 3 مل من كيلوبايت، احتضان أكثر من ليلة مع اهتزاز عند درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح اليوم التالي، والعودة إلى إضعاف ثقافة 1/100 إلى KB جديدة. احتضان 3-4 ساعة مع اهتزاز عند من درجات الحرارة الغرفةإعادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تعقيم أجار المياه من خلال التعقيم تعليق ،35-،7٪ (ث / ت) أجار في الماء عالى النقاء. ملاحظة: مخزون أجار المياه الغازية يمكن ذابت في الميكروويف وإعادة استخدامها مرارا وتكرارا، لا يحتاج إلى أن تكون مستعدة لكل تجربة تراكب جديدة. إذا تم استخدامها أجار المياه، فمن الأهمية بمكان لضمان ذاب تماما بعد الفرن. إذا لم يحدث ذلك فإن التراكب على نسيج محبب على ترسيخ شأنها أن تجعل التفسير صعبا. إذا حدث هذا، تذوب أجار لعدة دقائق وقتا أطول في الميكروويف من القيام به سابقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على أجار لينة المنصهر في 60 ° C حمام الماء قبل استخدامها. باستخدام الماصة المصلية العقيمة، ونقل 3 مل من أجار لينة لأنبوب الثقافة العقيمة. إعادة أنبوب الثقافة لحمام الماء للحفاظ على في حالة منصهرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب تراكب، لأول مرة السماح للأجار المنصهر لتبرد (يجب أن يشعر دافئ وليس ساخنا للمس)، ولكن لا تسمح لترسيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غطاء العقيمة، تطعيم 100 ميكرولتر منثقافة اختبار الإجهاد في أجار لينة ودوامة لخلط. تدوير الثقافة باليد لمدة 10-15 ثانية، ثم صب على قاع أجار (KB أجار). إمالة لوحة في كل الاتجاهات لضمان أجار لينة يغطي بالتساوي آغار أسفل. ملاحظة: أجار أسفل يمكن أن يكون أي عزز (1.5٪ أجار) المتوسطة التي سلالة اختبار ينمو بقوة. ل100 مم طبق بيتري القياسية، استخدم ~ 20 مل ذابت المتوسطة. آغار أسفل يمكن إعداد عدة أسابيع قبل الموعد المحدد (إذا حافظت على 4 درجات مئوية دون تجفيف) أو يمكن أن تكون على استعداد في نفس اليوم. إذا أعدت في نفس يوم إجراء تراكب، فمن الأفضل أن تفعل قبل ذلك إلى الخطوة 3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية لوحة والسماح لها 20-30 دقيقة ليصلب. يجب الحرص على عدم تعكير صفو لوحة في حين ترسيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة عزز، بقعة 2-5 ميكرولتر من طاف (ولدت في المادتين 1 و 2 أعلاه) على التراكب. السماح لوحات لاحتضان أكثر من ليلة في درجة حرارة الغرفة. مراقبة ونتائج قياسية في صباح اليوم التالي. ملاحظة: إنهقد تكون مفيدة لأداء وبقعة من التخفيف المتسلسل من طاف. هذا وسوف تسمح للباحثين للتمييز بين الجراثيم والنشاط المقاصة مبيد جرثومي. في هذه الحالة، فمن المستحسن لأداء 1: 5 أو 1:10 التخفيفات. </li></ol>

<ol>
	<li>Cavera, V. L., Arthur, T. D., Kashtanov, D., Chikindas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriocins+and+their+position+in+the+next+wave+of+conventional+antibiotics.">Bacteriocins and their position in the next wave of conventional antibiotics.</a> Int J of Antimicrob Agents. 46 (5), 494-501 (2015).</li><li>Blaser, M. J., Cardon, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+Predictive+Understanding+of+Earth's+Microbiomes+to+Address+21st+Century+Challenges.">Toward a Predictive Understanding of Earth's Microbiomes to Address 21st Century Challenges.</a> MBio. 7 (3), e00714-e00716 (2016).</li><li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+competition:+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle.">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (1), 15-25 (2010).</li><li>Michel-Briand, Y., Baysse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pyocins+of+Pseudomonas+aeruginosa.">The pyocins of Pseudomonas aeruginosa.</a> Biochimie. 84 (5-6), 499-510 (2002).</li><li>Ghequire, M. G. K., De Mot, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomally+encoded+antibacterial+proteins+and+peptides+from+Pseudomonas.">Ribosomally encoded antibacterial proteins and peptides from Pseudomonas.</a> FEMS Microbiol Rev. 38 (4), 523-568 (2014).</li><li>Cascales, E., Buchanan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colicin+Biology.">Colicin Biology.</a> Microbiol and Mol Biol Rev. 71 (1), 158-229 (2007).</li><li>Brown, S. P., Le Chat, L., De Paepe, M., Taddei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecology+of+Microbial+Invasions:+Amplification+Allows+Virus+Carriers+to+Invade+More+Rapidly+When+Rare.">Ecology of Microbial Invasions: Amplification Allows Virus Carriers to Invade More Rapidly When Rare.</a> Curr Biol. 16 (20), 2048-2052 (2006).</li><li>Grinter, R., Roszak, A. W., Cogdell, R. J., Milner, J. J., Walker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crystal+Structure+of+the+Lipid+II-degrading+Bacteriocin+Syringacin+M+Suggests+Unexpected+Evolutionary+Relationships+between+Colicin+M-like+Bacteriocins.">The Crystal Structure of the Lipid II-degrading Bacteriocin Syringacin M Suggests Unexpected Evolutionary Relationships between Colicin M-like Bacteriocins.</a> J Biol Chem. 287 (46), 38876-38888 (2012).</li><li>Hockett, K. L., Renner, T., Baltrus, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+Co-Option+of+a+Tailed+Bacteriophage+into+a+Killing+Complex+in+Pseudomonas.">Independent Co-Option of a Tailed Bacteriophage into a Killing Complex in Pseudomonas.</a> MBio. 6 (4), (2015).</li><li>Iacobellis, N. S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M., Ballio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytotoxic+properties+of+Pseudomonas+syringae+pv.+syringae+toxins.">Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins.</a> Physiol Mol Plant Pathol. 40 (2), 107-116 (1992).</li><li>Baltrus, D. A., Hendry, T. A., Hockett, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+Genomics+of+Pseudomonas+syringae.">Ecological Genomics of Pseudomonas syringae.</a> Genomics of Plant-Associated Bacteria. , 59-77 (2014).</li><li>Gratia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+Relationships+between+Lysogenic+Bacteria+and+Particles+of+Bacteriophage.">Numerical Relationships between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage.</a> Ann Inst Pasteur. 57, 652 (1936).</li><li>King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+simple+media+for+the+demonstration+of+pyocyanin+and+fluorescin.">Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin.</a> J Lab Clin Med. 44, 301-307 (1954).</li><li>Heng, N. C. K., Wescombe, P. A., Burton, J. P., Jack, R. W., Tagg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Diversity+of+Bacteriocins+in+Gram-Positive+Bacteria+.">The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria .</a> Bacteriocins. (Chapter 4), 45-92 (2007).</li><li>Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+Method+for+Bacteriocin+and+Distribution+of+Bacteriocin-producing+Strains+in+Lactobacillus+acidophilusGroup+Lactic+Acid+Bacteria+Isolated+from+Human+Feces.">Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

تقنية تراكب لينة أجار هو موضح هنا تم تطبيق على نطاق واسع لعقود عديدة من قبل الباحثين المهتمين في البكتيريا أو bacteriocins. الفوائد الرئيسية لهذا النهج هي أنه بسيط ورخيص وسهل نسبيا لتفسير. من خلال الجمع بين تراكب لينة أجار مع PEG هطول الأمطار والتخفيف المتسلسل، العوامل المضادة للجراثيم يمكن فصلها إلى ارتفاع مقابل انخفاض كلاء الوزن الجزيئي، وتنسخي مقابل غير تنسخي وكلاء (أي الجراثيم مقابل tailocin، على التوالي). وأخيرا، دمج التلاعب الجيني المستهدفة (الحذف وتكامل) من مبيد جرثومي المفترضة أو مواضع طليعة العاثية يمكن ترسيخ هوية مركب معاد معين. وقد استخدمنا هذه الطريقة مؤخرا لوصف جديد الجراثيم المستمدة من مبيد جرثومي واسع الإنتشار بين الزائفة syringae سلالات 9. وسائل الإعلام نمو والشروط المشار إليها في هذا العمل بروتوكول جيدا لالزائفة سيسوف ringae ومن المرجح تكفي لالجراثيم سلبية الغرام الأخرى التي تنمو بقوة في ظل هذه الظروف. ومع ذلك، فإن الباحثين باستخدام هذا الأسلوب يريدون تحقيق أفضل توقيت، مستنبت، طريقة الاستقراء، ودرجة حرارة الحضانة لنظامهم. وتشمل المعلمات الحرجة حمل الثقافة المنتجة بينما في مرحلة النمو لوغاريتمي، وكذلك بذر تراكب لينة أجار مع ما يكفي من ثقافة مرحلة لوغاريتمي لضمان توزيع البكتيرية موحد، ولكن ليس ثقافة المفرطة، والتي سوف تحجب مناطق المقاصة المحتملة. هناك العديد من bacteriocins التي لا يسببها كجزء من استجابة SOS، بل وبفعل من خلال أنظمة الاستشعار عن النصاب القائم على الببتيد (خاصة bacteriocins إيجابية الجرام 15)، وبالتالي، الباحث قد ترغب في فحص عدة طرق تحريض مختلفة (مثل تعديل المحتوى الغذائي للحمل المتوسطة، أو السماح للحضانة طويلة من سلالة إنتاج). عند استخدامهذه التقنية، وتراكب لينة أجار يجب أن ذابت تماما والحفاظ على 55-60 درجة مئوية قبل إضافة سلالة البذر. لقد كان لدينا العديد من التجارب حيث لم يكن ذابت أجار لينة تماما (على الرغم بصريا يبدو أن يكون) وأسفرت عن تراكب مع ظهور محبب. النتائج من تراكب محببة يمكن أن تكون للتفسير عموما، ولكن هذا يعتمد على قوة تثبيط (تثبيط الأضعف سيكون من الصعب مراقبة). A، يتيه متغير النهائي في الاعتبار عند استخدام هذه التقنية هو أن يسمح للحرارة أجار المنصهر الوقت الكافي لتبرد قبل التلقيح مع سلالة البذر، وذلك لتجنب قتل سلالة البذر. لتجنب هذه المشكلة، ونحن ضمان أجار لينة دافئة، ولكن ليست ساخنة، للمس. على طول هذه الخطوط، لاحظنا أيضا أنه إذا نعطي وقتا كافيا للثقافة البذر ليتأقلم مع أجار المنصهر، وذلك قبل صب تراكب، نستعيد الفقراء عموما ز البكتيريةrowth، مما يجعل تفسير تثبيط محددة من الصعب أو من المستحيل تفسير. هذا هو السبب في أننا نسمح 10-15 ثانية إضافية من الحضانة بين vortexing لوسكب التراكب. المفاضلة بين الحفاظ على أجار في حالة منصهرة تماما (سخونة أفضل) ولكن غير مميتة للسلالة البذر (سخونة ليست أفضل) هي واحدة من شأنها أن تحتاج المرجح أن يحددها الباحث من خلال التجربة والخطأ. إذا تم استخدام خطوة هطول PEG، سيكون من المفيد لتشمل مراقبة سلبية حيث تتم معالجتها وسيلة مرق عقيم مماثل لطاف الثقافة. وسوف يضمن هذا مما أسفر عن مقتل النشاط ليس نتيجة PEG المتبقية أو الكلوروفورم داخل طاف العينة. كما تميل كل من البكتيريا وbacteriocins أن تكون محددة للغاية، فإنه ليس من غير المألوف لمواجهة أي نشاط قتل على ما يبدو مع مجموعة معينة من السلالات. هذا يمكن أن تنجم عن مجموعة متنوعة من سلالة محددة إعادةآليات مقاومة لأ، واحد هو أن سلالة اختبار إما يفتقر أو لديه نسخة غير المعترف بها من مستقبلات اللازمة لاستهداف من قبل مبيد جرثومي معين أو الجراثيم. طريقة بديلة، وقد وصفت طريقة الفرز مبيد جرثومي بواسطة كاواي وآخرون. ، لكنها تعاني من عيوب ولم يعتمد على نطاق واسع (16). على وجه التحديد، وهذا الأسلوب يتطلب مراقبة عينات مرق في فترات زمنية يمكن أن تكون مرهقة، ولا تسمح للتمييز بين الأنشطة قتل عاثية المشتقة ومبيد جرثومي المشتقة. القيود الرئيسية لهذا الأسلوب هو أنه ليس مناسبة تماما للكائنات التي لا تنمو بقوة (وبالتالي سوف تفتقر مناطق المقاصة ملحوظ بسهولة) أو أن prophages الميناء أو bacteriocins التي لا تنتج بقوة تحت ظروف المختبر. التكيف هذه التقنية للكشف عن bacteriocins المنتجة في عينات بيئية من شأنه أن كلا توسيع الأداة المساعدةمن هذه التقنية وتسهيل مزيد من التبصر في دور bacteriocins داخل البيئات الطبيعية.

في الآونة الأخيرة، كان هناك اهتمام كبير في تعميق فهمنا لعلم البيئة الميكروبية (وخاصة microbiomes من بيئات مختلفة)، وكذلك المركبات المضادة للبكتيريا جديدة لاستخدامها في مكافحة الجراثيم المقاومة للمضادات الحيوية 1،2. وموضوع الربط بين هذه المصالح هو فهم التفاعلات العدائية بين السلالات البكتيرية في بيئتها الطبيعية. هناك العديد من الطرق التي البكتيريا تقلد المنافسين 3. Bacteriocins، مجموعة متنوعة من البروتينية، ومركبات مضادة للجراثيم، منذ فترة طويلة ودرس لدورهم في التوسط العداء interbacterial، مع اثنين من الأنواع الأكثر درس يجري الزائفة الزنجارية 4،5 والقولونية 6، مسببات الأمراض البشرية الهامة. بالإضافة إلى bacteriocins، يمكن prophages يسببها أيضا بمثابة وكلاء anticompetitor، والسماح لسلالة لغزو إلى مكانة التي استعمرت بالفعل 7. الزائفة الصورةyringae هو الممرض النباتات المعروفة لإنتاج مجموعة من العوامل المضادة للجراثيم، بما في ذلك bacteriocins واحدة بروتين 8، عاثية bacteriocins المستمدة ذيل 9 (tailocins تسميته)، وكذلك المركبات الثانوية غير البروتينية 10. في الآونة الأخيرة كان هناك اهتمام في فهم كيفية تأثير هذه مضادات الميكروبات في البيئة من هذا الكائن الحي، وكذلك الكيفية التي يمكن تسخيرها للسيطرة على الأمراض النباتية 11. وهناك طريقة تستخدم على نطاق واسع لدراسة كل من bacteriocins والجراثيم هو الأسلوب تراكب الناعمة أجار. وقد وصفت هذه الطريقة لأول مرة على سبيل الهبة في عام 1936 للمساعدة في تعداد عاثية 12،13. نحن هنا وصف تطبيق طريقة تراكب لينة أجار، بالاشتراك مع التلاعب الجيني المستهدف والبولي ايثيلين جلايكول (PEG) هطول الأمطار، في التمييز بين ثلاثة مضادات حيوية مختلفة (أ الجراثيم، عالية الوزن الجزيئي جرثومةeriocin، وانخفاض الوزن الجزيئي مبيد جرثومي) التي تنتجها السلالة البكتيرية واحد. الاستفادة من هذا النهج هو أنه بسيط نسبيا ورخيصة، وهذا هو السبب، على الرغم من كونها بالتأكيد &quot;التكنولوجيا المنخفضة، لا تزال تستخدم على نطاق واسع.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="717">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Mitomycin C</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:140px;">sc-3514</td>
			<td style="width:167px;">Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34854</td>
			<td>Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene Glycol (PEG)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacteriological grade agar</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-274</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the soft-agar overlay technique to screen for bacterially produced inhibitory compounds

وقد تم تطوير تقنية تراكب لينة أجار أصلا منذ أكثر من 70 عاما، واستخدمت على نطاق واسع في العديد من المجالات البحثية الميكروبيولوجي، بما في ذلك العمل مع البكتيريا وbacteriocins، وكلاء المضادة للبكتيريا البروتينية. هذا النهج غير مكلفة نسبيا، مع الحد الأدنى من الاحتياجات من الموارد. وتتكون هذه التقنية من اكتشاف طاف من سلالة المانحة (يحتمل أن تأوي مركب سام (ق)) على تراكب أجار لينة طدت التي بذرت مع سلالة بكتيرية اختبار (يحتمل أن تكون حساسة لمركب سام (ق)). نحن تستخدم هذه التقنية لفحص مكتبة الزائفة syringae سلالات عن مقتل ضمن النوع. من خلال الجمع بين هذا النهج مع خطوة هطول الأمطار والحذف الجينات المستهدفة، المركبات السامة المتعددة التي تنتجها نفس السلالة يمكن أن تكون متباينة. وكلاء عدائية اثنين تعافى عادة باستخدام هذه التقنية والبكتيريا وbacteriocins. يمكن التفرقة بين هذه العميلين باستخداماختبارين إضافية بسيطة. سوف يؤدون التخفيف المتسلسل على طاف تحتوي على الجراثيم يؤدي في لويحات الفردية أصبحت أقل في عدد بمزيد من التخفيف، في حين التخفيف المتسلسل من طاف تحتوي على مبيد جرثومي سيؤدي منطقة المقاصة أن يصبح موحد أكثر عكر بمزيد من التخفيف. بالإضافة إلى ذلك، فإن الجراثيم تنتج منطقة المقاصة عندما رصدت على تراكب أجار لينة جديدة المصنف مع نفس السلالة، في حين سوف مبيد جرثومي لا تنتج منطقة المقاصة عند نقلها إلى الحديقة أجار لينة جديدة، نظرا لتخفيف من مبيد جرثومي.

مزيج من تراكب أجار لينة وPEG هطول الأمطار يمكن استخدامها لتحديد وتوصيف العوامل المضادة للجراثيم مختلفة التي تنتجها نفس السلالة. ويبين الشكل 1 سلالتين من P. syringae (A و B) التي تحول دون سلالة الثالث من نفس النوع. سلالتين، ومع ذلك، يتم تثبيط من قبل bacteriocins مختلفة. منطقة المقاصة على سلالة والمعارض حافة حادة، في حين أن منطقة المقاصة على سلالة B أكبر، ويسلك الحدود غير حاد. التلاعب الجيني داخل السلالة المنتجة للأن تعطيل تحديدا إما tailocin (tailocin ناقص) أو منخفضة الوزن الجزيئي مبيد جرثومي (ناقص مبيد جرثومي) تؤكد أن سلالات ألف وباء حساسة لbacteriocins متميزة. ويبين الشكل 2 أن قتل بوساطة الجراثيم يمكن تمييزها عن مضادات الميكروبات الأخرى غير تنسخي بمقارنة سلسلة التخفيف. لأن كلا bacteriocins وطليعة العاثية يمكن الناجم عن ميتوميسين العلاج C، يمكن أن أنشطة هذه العميلين تشبه بعضها البعض (وخاصة إذا كان فج تنشيط وفيرة). في حالة تبادل المعلومات بوساطة الجراثيم، والتخفيف من طاف حل لويحات الفردية (مناطق المقاصة) في حين أن المقاصة مبيد جرثومي بوساطة لن تحل في مثل هذه اللوحات. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig1.jpg" /> الشكل 1: تمييز المظهري من العوامل المضادة للجراثيم متعددة تنتجها نفس السلالة. سلالة A غير حساس لارتفاع مبيد جرثومي الوزن الجزيئي (tailocin) ولكن ليس بديلا منخفض الوزن الجزيئي مبيد جرثومي، كما يتضح من عدم وجود تطهير في سلالة نقص tailocin، ولكن ليس سلالة نقص مبيد جرثومي. وفي المقابل، سلالة B غير حساس للtailocin، ولكن حساسية لانخفاض الوزن الجزيئي مبيد جرثومي. وtailocin هو efficتعافى iently التالية PEG هطول الأمطار، في حين انخفضت bacteriocins الوزن الجزيئي ليست كذلك. WT = النوع البري. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig2.jpg" /> الشكل 2: التمييز بين مضادات الميكروبات غير تنسخي والبكتيريا. (أ) التخفيف من عيار عال من النتائج البكتيريا في لوحات الفردية التي تصبح أقل عددا (ارتفاع عيار أعلى، وانخفاض عيار أسفل). (ب) التخفيف من النتائج bacteriocins في أقل موحد المقاصة أن لا حل في لويحات الفردية. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds at JoVE.com

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

استخدام تقنية تراكب لينة أجار للكشف عن المركبات المثبطة إنتاج البكتريا

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

استخدام<em&gt; غاليريا mellonella</em&gt; كما كائن نموذج لدراسة<em&gt; البكتيريا المستروحة</em&gt; عدوى

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

استخدام<em&gt; الشيجلا الفلكسنرية</em&gt; لدراسة التفاعلات الالتهام الذاتي الهيكل الخلوي

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

تحليل الأضرار الظهارية التي تنتجها<em&gt; المتحولة الحالة للنسج</em&gt; عدوى

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

باستخدام تراكب الفحص لقياس نوعيا الإنتاج الجرثومي من والحساسية للالرئوية Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

تحديد تركيز الفيروسي من خلال البلاك فحوصات: نظم تراكب عن طريق التقليدية والرواية

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

الفيروسية في وقت مبكر فحوصات دخول لتحديد وتقييم المركبات المضادة للفيروسات

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

استخدام التدفق الخلوي لتقييم حالة لونين في خلايا T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

أوفيركسريسيون وتنقية الإنسان<em&gt; رابطة الدول المستقلة</em&gt; -prenyltransferase في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

نظام تغذية خالية رواية للإنتاج الضخم للخلايا القاتلة الطبيعية مورين في المختبر

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

استخدام اللافقاريات جاليريا ميلونيلا كنموذج للعدوى لدراسة مجمع السل الميكوباكتيريوم

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...