Name: mapping the binding site of an aptamer on atp using microscale thermophoresis
Uploaded: 2017-01-07T18:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis at JoVE.com

Författarna har inga bekräftelser.

1. Beredning av aptamer Working Stock <ol><li> Följ tillverkarens instruktioner och lös oligonukleotid (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, sekvens från 18 referens) i vatten, och nådde en 100-iM slutkoncentration. </li><li> Förbered aptamer arbetslösning genom spädning av oligonukleotiden lager till 200 nM med bindningsbuffert (20 mM Tris, pH 7,6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0,01% Tween 20). </li><li> Inkubera blandningen under 2 min vid 90 ° C, låt provet kallna omedelbart ned på is, och...

Kvalitetskontroller: Ospecifik klibbning / adsorption av provmaterial till ytor, liksom aggregering effekter, har en dramatisk inverkan på kvaliteten av de affinitetsdata. Men bara några state-of-the-art teknik erbjuder noggranna och snabba möjligheter att övervaka och undvika dessa effekter. MST erbjuder integrerade kvalitetskontroller som upptäcker och bidrar till att övervinna dessa frågor, gör det möjligt att stegvis optimering av den tekniska installationen. Viktig information om ...

Interaktion mellan molekyler utgör grunden för naturen. Därför forskare inom många områden av grundforskning och tillämpad forskning försöker förstå de grundläggande principerna för molekylära interaktioner av olika slag. Micro Thermophoresis (MST) gör det möjligt för forskare att utföra snabba, exakta och kostnadseffektiva, och kvalitetskontrollerad karakterisering av molekylära interaktioner i lösning, med ett fritt val av buffertar. Det finns redan mer än 1.000 publikationer med hjälp av MST, från 2016 ensam, som beskriver olika typer av analyser, inklusive biblioteks filmvisningar, bindande händelse valideringar, konkurrensanalyser och experiment med flera bindningspartner 1-8. I allmänhet, MST tillåter studiet av de klassiska bindningsparametrar, såsom bindningsaffinitet (pM till mM), stökiometri, och termodynamik, av något slag av molekylär interaktion. En stor fördel med MST är förmågan att studera bindningshändelser oberoende av storleken av interaktionspartners. även chalnande interaktioner mellan små nukleinsyra aptamers (15-30 nt) och mål såsom små molekyler, läkemedel, antibiotika, eller metaboliter kan kvantifieras. Nuvarande state-of-the-art teknik för att karakterisera aptamer-mål interaktioner är antingen lab-intensiv och mycket komplexa eller misslyckas med att kvantifiera aptamer-småmolekylära interaktioner 9,10. Surface Plasmon Resonance (SPR) -baserad analyser 11,12 och verkligen etikettfria kalorimetriska metoder, såsom Isotermiska Titrering Calorimetry (ITC) 13-15, isokratisk eluering 16, jämvikts fi ltration 17,18, in-line sondering 19, gel- skift analyser stopped- fl öde fl uorescence spektroskopi 20,21, fluorescensanisotropi (FA) 22,23, enda molekyl fl uorescence avbildning 24,25, och Bio-skikt interferometri (BLI) 26 är också antingen oprecisa eller oförenlig med aptamer-liten molekyl interaktioner. andra huvl frågor dessa metoder är låg känslighet, hög prov konsumtion, immobilisering, begränsningar masstransport på ytor, och / eller begränsningar buffert. Endast ett fåtal av dessa tekniker ger integrerade kontroller för aggregering och adsorption effekter. MST utgör ett kraftfullt verktyg för forskare att övervinna denna begränsning för att studera samspelet mellan aptamers och små molekyler 27-29, liksom andra mål såsom proteiner 30-33. Tekniken bygger på förflyttning av molekyler genom temperaturgradienter. Detta riktad rörelse, kallad &quot;thermophoresis&quot; beror på storlek, laddning, och hydrering skal av molekylen 34,35. Bindningen av en ligand till molekylen kommer att direkt förändra åtminstone en av dessa parametrar, vilket resulterar i ett förändrat thermophoretic rörlighet. Ligander med små storlekar kan inte ha en betydande inverkan i termer av storlek förändring från den obundna till det bundna tillståndet, men de kan ha dr<html> amatic effekter på vätske skal och / eller laddning. Förändringarna i thermophoretic rörelse av molekyler efter växelverkan med bindningspartnern möjliggör kvantifiering av grundläggande bindningsparametrar 2,7,34,36,37. Såsom avbildas i figur 1 A, MST Anordningen består av en infraröd laser fokuseras på provet inom de glaskapillärer med användning av samma optik som för fluorescensdetektion. Den thermophoretic rörelsen av proteiner via den inre fl uorescence av tryptofaner 6 eller av en fluorescensmärkt interaktionspartner 3,8 kan övervakas medan lasern upprättas en temperaturgradient (AT för 2-6 ° C). Den resulterande temperaturskillnaden i rymden, AT, leder till utarmning eller ackumulering av molekyler i området för förhöjd temperatur, som kan kvantifieras genom det Soret koef fi räcklig (S T): g &quot;/&gt; c hett representerar koncentrationen i det uppvärmda området, och c kallt är koncentrationen i det inledande kall regionen. Såsom visas i figur 1B, en typisk MST experimentresultat i en MST rörelseprofil (tidskurva), som består av olika faser, vilka kan separeras med deras respektive tidsskalor. Den initiala fluorescens mäts i de första 5 si frånvaro av temperaturgradienten att definiera exakt börjar fluorescens och för att kontrollera fotoblekning eller photoenhancement. Temperatur Jump (T-Jump) representerar fas där fluorescens ändringarna innan thermophoretic rörelse. Denna inledande minskning i fluorescens beror på värmeberoende förändringar av fl uorophore kvantutbyte. Den thermophoresis fas följer, i vilken fluorescens minskar (eller ökar) på grund av den thermophoretic rörelsen av molekylerna tills steady-state distributions uppnås.Kan observeras omvända TJump och samtidig tillbaka diffusion av fl uorescent molekyler som visas i figur 1B efter lasern är avstängd. För att få tillgång grundläggande bindningsparametrar används olika molära förhållanden av interaktionspartners analyseras och jämföras. Normalt är 16 olika förhållanden studerats i en MST experiment, medan den optiska synlig molekylen hålls konstant och matas med en ökande mängd av omärkt ligand. Samspelet mellan de två bindningspartners framkallar förändringar i thermophoresis, och därmed i den normaliserade fl uorescence, F norm, som beräknas enligt följande: <img alt="Ekvation" src="/files/ftp_upload/55070/55070eq2.jpg" /> F varm och F kall representerar genomsnitt fl uorescence intensiteter vid de fi nierade punkter i MST spåren gång. Bindningsaffiniteter (K d eller EC 50-värden) kan beräknas genom curve montering (Figur 1C). Totalt sett är MST ett kraftfullt verktyg för att studera molekylära interaktioner av något slag. Detta manuskript ger ett protokoll för att karakterisera utmanande samverkan mellan den lilla molekylen adenosintrifosfat (ATP, 0,5 kDa) och 25-nt kort ssDNA aptamer DH25.42 (7,9 kDa). Under loppet av manuskriptet, är bindningsstället för aptameren på ATP-molekylen mappas ner till adenin grupp av ATP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Aptamer binding buffer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >20 mM Tris pH7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01%Tween-20</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescently labeled ATP aptamer</td>
			<td>IDT, Leuven, Belgium</td>
			<td ></td>
			<td>sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-ATTGCGGAGGAAGG-3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ATP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A2383</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ADP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A2754</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AMP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A2252</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adenine</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A8626</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SAM</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A7007</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dATP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td >11934511001</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CTP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>C1506</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GTP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td >G8877</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monolith NT.115&#160;</td>
			<td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td>
			<td >MO-G008</td>
			<td>Blue/Red Channel MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monolith NT.115 capillaries Standard</td>
			<td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td>
			<td >MO-K002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf PCR tubes</td>
			<td >Eppendorf, Germany</td>
			<td >30124537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device</td>
			<td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MO.affinity analysis v2.1.1</td>
			<td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kaleidagraph 4.5.2</td>
			<td >Synergy Software</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping the binding site of an aptamer on atp using microscale thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

I denna studie var MST tillämpas för att karakterisera bindningsstället av DH25.42 DNA aptamer 18 på ATP. I motsats till andra studier som kännetecknar interaktionen av ATP eller ATP-mimicking små molekyler med proteiner slumpvis märkta med en eller flera fluoroforer 38-40, innefattar denna studie en märkt version av 7,9 kDa ssDNA aptamer med en Cy5 molekyl på 5&#39;-änden . Olika ATP-derivat och besläktade molekyler, som alla skiljer sig från ATP i olik...

Watch this Scientific Journal Video about Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis at JoVE.com

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Kartläggning av bindningsstället för en aptamer på ATP Använda Micro Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantifiering av Bacterial Histidin Kinase-autofosforylering med hjälp av en Nitrocellulosabindningsanalys

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analys av proteinkinasaktivitet med radiomärkt ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Fastställande av hög affinitet antikropp-antigenbindning Kinetics med fyra Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering detektion av LRRK2 aktivitet med SDS-PAGE med en fosfat-bindande tagg

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metod för hög genomströmning kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Upptäckt av små GTPase Prenylation och GTP bindande använder membran fraktionering och GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Definiera Hsp33's Redox-reglerade förkläde aktivitet och mappning konfirmerande ändringar på Hsp33 med hjälp av väte-deuterium Exchange masspektrometri

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Mäta interaktion av klotformig och fintrådiga proteiner av kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR) och hur provtagningsutrustningen skall Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Utvärdering av protein-proteininteraktioner med hjälp av en on-membran rötnings teknik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...