Name: generation of integration-free induced pluripotent stem cells from human peripheral blood mononuclear cells using episomal vectors
Uploaded: 2017-01-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors at JoVE.com

This work was supported by the Ministry of Science and Technology of China (2015CB964902, 2013CB966902 and 2012CB966601), the National Natural Science Foundation of China (81500148, 81570164 and 81421002), the Loma Linda University School of Medicine GCAT grant (2015), and Telemedicine and Advanced Technology Research Center (W81XWH-08-1-0697).

כל הדגימות האנושיות PB התקבלו מתורמי מבוגרים אנונימי ללא פרטי זיהוי זמינים Tianjin דם מרכז באישור ועדת אתיקת מחקר המקומית. 1. אנדו ללא הכנה פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ערכה מסחרית פלסמיד טיהור מקסי ל...

<ol>
	<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Trounson, A., McDonald, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Therapies+in+Clinical+Trials:+Progress+and+Challenges.">Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges.</a> Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).</li><li>Hayes, M., Zavazava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+generate+induced+pluripotent+stem+cells.">Strategies to generate induced pluripotent stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1029, 77-92 (2013).</li><li>Zhang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells.">Cellular reprogramming of human peripheral blood cells.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 11, 264-274 (2013).</li><li>Schlaeger, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+non-integrating+reprogramming+methods.">A comparison of non-integrating reprogramming methods.</a> Nat Biotechnol. 33, 58-63 (2015).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+nonviral+method+to+generate+integration-free+human-induced+pluripotent+stem+cells+from+cord+blood+and+peripheral+blood+cells.">An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells.</a> Stem Cells. 31, 458-466 (2013).</li><li>Carey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+factor+stoichiometry+influences+the+epigenetic+state+and+biological+properties+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).</li><li>Dorigo, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+helper-dependent+adenovirus-Epstein-Barr+virus+hybrid+system+for+the+stable+transformation+of+mammalian+cells.">Development of a novel helper-dependent adenovirus-Epstein-Barr virus hybrid system for the stable transformation of mammalian cells.</a> J Virol. 78, 6556-6566 (2004).</li><li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression.">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).</li><li>Harms, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+sequencing+of+Cytokeratin+20-negative+Merkel+cell+carcinoma+reveals+ultraviolet-signature+mutations+and+recurrent+TP53+and+RB1+inactivation.">Next generation sequencing of Cytokeratin 20-negative Merkel cell carcinoma reveals ultraviolet-signature mutations and recurrent TP53 and RB1 inactivation.</a> Mod Pathol. 29, 240-248 (2016).</li><li>Abyzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+copy+number+mosaicism+in+human+skin+revealed+by+induced+pluripotent+stem+cells.">Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 492, 438-442 (2012).</li><li>Martincorena, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution.+High+burden+and+pervasive+positive+selection+of+somatic+mutations+in+normal+human+skin.">Tumor evolution. High burden and pervasive positive selection of somatic mutations in normal human skin.</a> Science. 348, 880-886 (2015).</li><li>Su, R. J., Neises, A., Zhang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+iPS+Cells+from+Human+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+Using+Episomal+Vectors.">Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors.</a> Methods Mol Biol. 1357, 57-69 (2016).</li><li>Seki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells.">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li><li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood.">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li><li>Kishino, Y., Seki, T., Yuasa, S., Fujita, J., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+from+Human+Peripheral+T+Cells+Using+Sendai+Virus+in+Feeder-free+Conditions.">Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions.</a> J Vis Exp. , (2015).</li><li>Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+a+small+amount+of+human+peripheral+blood+using+a+combination+of+activated+T+cells+and+Sendai+virus.">Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus.</a> Nat Protoc. 7, 718-728 (2012).</li><li>Gill, S., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Going+viral:+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+hematological+malignancies.">Going viral: chimeric antigen receptor T-cell therapy for hematological malignancies.</a> Immunological reviews. 263, 68-89 (2015).</li><li>Su, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+integration-free+ips+cells+from+human+adult+peripheral+blood+using+BCL-XL+together+with+Yamanaka+factors.">Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors.</a> PLoS One. 8, e64496 (2013).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p53-PUMA+axis+suppresses+iPSC+generation.">The p53-PUMA axis suppresses iPSC generation.</a> Nat Commun. 4, 2174 (2013).</li><li>Hardwick, J. M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+BCL-2+proteins.">SnapShot: BCL-2 proteins.</a> Cell. 138, 404 (2009).</li><li>Wen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Generation+of+Integration-free+iPSCs+from+Human+Adult+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+with+an+Optimal+Combination+of+Episomal+Vectors.">Enhanced Generation of Integration-free iPSCs from Human Adult Peripheral Blood Mononuclear Cells with an Optimal Combination of Episomal Vectors.</a> Stem Cell Reports. 6, 873-884 (2016).</li><li>Zhang, X. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+ameliorates+the+cryopreservation+of+cord+blood+in+a+preclinical+system+and+increases+the+recovery+of+CFUs,+long-term+culture-initiating+cells,+and+nonobese+diabetic-SCID+repopulating+cells.">Trehalose ameliorates the cryopreservation of cord blood in a preclinical system and increases the recovery of CFUs, long-term culture-initiating cells, and nonobese diabetic-SCID repopulating cells.</a> Transfusion. 43, 265-272 (2003).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Castiel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+associated+with+abnormal+mitosis+observed+by+confocal+imaging+in+live+cancer+cells.">Cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells.</a> J Vis Exp. , e50568 (2013).</li><li>Peterson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teratoma+generation+in+the+testis+capsule.">Teratoma generation in the testis capsule.</a> J Vis Exp. , e3177 (2011).</li><li>Ritner, C., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+of+human+embryonic+stem+cells+by+teratoma+formation.">Fate mapping of human embryonic stem cells by teratoma formation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Wen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Generation+of+Integration-free+iPSCs+from+Human+Adult+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+with+an+Optimal+Combination+of+Episomal+Vectors.">Enhanced Generation of Integration-free iPSCs from Human Adult Peripheral Blood Mononuclear Cells with an Optimal Combination of Episomal Vectors.</a> Stem Cell Reports. , (2016).</li><li>Lo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Protein+Levels+in+Single+Living+Cells.">Quantification of Protein Levels in Single Living Cells.</a> Cell Rep. 13, 2634-2644 (2015).</li><li>Liu, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+generating+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells.">An improved method for generating integration-free human induced pluripotent stem cells.</a> Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 22, 580-587 (2014).</li><li>Luni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+cellular+reprogramming+with+microfluidics.">High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics.</a> Nat Methods. 13, 446-452 (2016).</li><li>Chou, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+facile+method+to+establish+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+adult+blood+cells+under+feeder-free+and+xeno-free+culture+conditions:+a+clinically+compliant+approach.">A facile method to establish human induced pluripotent stem cells from adult blood cells under feeder-free and xeno-free culture conditions: a clinically compliant approach.</a> Stem Cells Transl Med. 4, 320-332 (2015).</li><li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+efficient+feeder-free+culture+system+for+the+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells.</a> Sci Rep. 4, 3594 (2014).</li><li>Howden, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Reprogramming+and+Gene+Correction+of+Patient+Fibroblasts.">Simultaneous Reprogramming and Gene Correction of Patient Fibroblasts.</a> Stem Cell Reports. 5, 1109-1118 (2015).</li><li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+reprogramming+of+human+fetal+and+adult+blood+CD34++cells+into+mesenchymal+stem+cells+with+a+single+factor.">Rapid and efficient reprogramming of human fetal and adult blood CD34+ cells into mesenchymal stem cells with a single factor.</a> Cell research. 23, 658-672 (2013).</li><li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Conversion+of+Cord+Blood+CD34++Cells+Into+Neural+Stem+Cells+by+OCT4.">Direct Conversion of Cord Blood CD34+ Cells Into Neural Stem Cells by OCT4.</a> Stem cells translational medicine. 4, 755-763 (2015).</li></ol>

רכישת דגימות דם מתורמים או מטופלים בריאים נוחה ולא פולשנית, מה שהופך אותו מקור תא אטרקטיבי למחקר בסיסי טיפול בתאים קליני. כאן יש לנו תיאר פרוטוקול עבור הדור היעילה ביותר של iPSCs אינטגרציה נטולת מדגימות דם היקפיים. גישה לשחזור ובמחיר סביר זה אמור להועיל בתחום iPSC. <p class...

<html> לאחר ביטוי בכפייה של גורמי שעתוק כמה (כלומר Oct4, Sox2, MYC ו KLF4), תאים סומטיים ניתן לתכנות מחדש לתאי גזע מושרים (iPSCs), המחזיקות הבטחה גדולה עבור יישומים ברפואה רגנרטיבית והחלפת התא טיפול 1-3. נכון להיום, שיטות מגוונות פותחו כדי להגדיל את שיעור ההצלחה של תכנות מחדש 4-7. וקטורים המושרים ויראלי תכנות מחדש נעשה שימוש נרחב עבור דור יעיל של iPSCs, כי שילוב ויראלי מוביל ברמה גבוהה, ביטוי היציב של גורמי תכנות מחדש. עם זאת, שילוב קבוע של ה- DNA וקטור לתוך הגנום התא עלול לגרום mutagenesis insertional 5. בנוסף, איון מספיק גורמי תכנות מחדש עלול להפריע iPSCs בידול 8. ככזה, השימוש iPSCs ללא שילוב של גורמי תכנות מחדש הוא הכרחי, במיוחד לשימוש ביישומי טיפול בתא. &gt; Episomal וקטורים (EVS) נמצאים בשימוש נרחב דור iPSCs אינטגרציה נטולת. הערך הגלום הנפוץ ביותר הוא פלסמיד המכיל שני אלמנטים, מקורו של שכפול נגיפי (oriP) ו EB גרעיני Antigen 1 (EBNA1), מן אפשטיין-באר (EB) וירוס 9. מרכיב oriP מקדם שכפול פלסמיד בתאי יונקים, בעוד אלמנט EBNA1 רצועות ה- DNA פלסמיד המכיל oriP ל- DNA כרומוזומלי המאפשר החלוק של episome במהלך חלוקת התא המארח. לשם השוואה לגישות אינטגרציה נטולת אחרים, כולל וירוס סנדאי (SV) ו transfection RNA, EVS להחזיק 5,6,10 יתרונות מרובים. כמו DNA פלסמיד, EVS ניתן לייצר בקלות שונה בבית, מה שהופך אותם מאוד יקרים. בנוסף, תכנות מחדש עם EV הוא תהליך שדורש פחות מאז transfection יחיד עם מכוניות חשמליות מספיק עבור דור iPSC, ואילו transfections RNA כמה נחוץ תכנות מחדש מוצלח. Dפיברובלסטים ermal שימשו במחקרים תכנות מחדש רבים. עם זאת, ביופסיה של העור הוא לא רק תהליך פולשני וכואב, אלא גם זמן רב להרחבת תאים בכמות מספקת לתכנות מחדש. דאגה גדולה יותר, תאי עור של תורמים מבוגרים לעתים קרובות נחשפו לקרינת אור UV לטווח ארוכה, דבר שעלול להוביל מוטציות הקשורות גידולים, ובכך להגביל את בקשות iPSCs נגזר fibroblasts עור 11,12. לאחרונה, זה כבר דווח כי תאי עור אדם נורמלים לצבור מוטציות סומטיות וגני סרטן מרובים, כוללים רוב נהגי המפתח של קרצינומה של תאי קשקש עורית, נמצא תחת סלקציה החיובית חזקה 13. בניגוד פיברובלסטים עור, דם היקפי (PB) תאים הם מקור עדיף של תאים לתכנות מחדש כי 1) תאי דם ניתן להשיג בקלות באמצעות תהליך פולשנית, 2) תאי דם היקפיים הם הצאצאים של תאי גזע hematopoieticהמתגורר מח עצם, ולפיכך הוא מוגן מפני קרינה מזיקה. תאי דם היקפיים mononuclear (MNCs PB) ניתן לאסוף תוך שעה מהשכבה מעיל באפי בעקבות צנטריפוגה שיפוע פשוטה באמצעות Ficoll-Hypaque (1.077 גרם / מ&quot;ל). MNCs PB השיג מורכבים של לימפוציטים, מונוציטים וכמה ובתאים Hematopoietic (HPCs) 14. למרות לימפוציטים מסוג T האדם הם אחד מסוגי התאים העיקריים ב PB, בוגרת תאי T המכילים rearrangements של הקולטן של תאי T (TCR) גנים חסרים גנום שלם ובכך להגביל את הפוטנציאל שלהם ליישומים 15,16. עם זאת, התחדשות של תאי T באמצעות הדור iPSC ייתכן יישומים פוטנציאליים Chimeric Antigen קולטן (CAR) T-cell טיפול 17-19. לשם השוואה, יש HPCs גנום שלם הם reprogrammable בקלות. למרות רק 0.01 - 0.1 תאים% במחזור הפריפריה הם HPCs, תאים אלה ניתן להרחיב vivo לשעבר במדיום erythroid שדוגלת ריבוי erythrובתאי OID 14. במחקר הקודם שלנו, השתמשנו גורם BCL-XL בנוסף הגורמים יאמאנאקה (Oct4, Sox2, MYC ו KLF4), אשר הביאה לעלייה 10x ב ויעילות תכנות מחדש PB 20. BCL-XL, הידוע גם בשם BCL2L1, הוא מעכב חזק של מוות של תאים, על ידי עיכוב ההפעלה של caspases 21,22. אבל, BCL-XL יכול גם לשחק תפקיד חשוב בשמירה על pluripotency 21,22. לאחרונה, יש לנו אופטימיזציה נוספת מערכת תכנות מחדש EV שלנו על ידי בנפרד להביע MYC ו KLF4 עם שני וקטורים, מה שמוביל לעלייה כ 100x יעיל תכנות מחדש 23. באמצעות שיטה זו, את יעילות תכנות מחדש, המוגדר על ידי מספר מושבה המחולק החל מספר תא transfection, היא 0.2 - 0.5% מתורמים בריאים. כדלקמן, אנו מתארים את הליך הניסוי המפורט ליצירת iPSCs ללא אינטגרציה מן PB.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1666">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">S0192</td>
			<td style="width:723px;">Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Human stem cell factor (SCF)</td>
			<td style="width:263px;">Peprotech</td>
			<td style="width:136px;">300-07</td>
			<td>Store at -20 or -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td style="width:263px;">Peprotech</td>
			<td style="width:136px;">AF-200-03</td>
			<td>Store at -20 or -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Eryrthropoietin (EPO)</td>
			<td style="width:263px;">Peprotech</td>
			<td style="width:136px;">100-64</td>
			<td>Store at -20 or -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Insulin growth factor-1 (IGF-1)</td>
			<td style="width:263px;">Peprotech</td>
			<td style="width:136px;">100-11</td>
			<td>Store at -20 or -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">D4902</td>
			<td>Store at -20 or -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">1-thioglycerol (MTG)</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">M6145</td>
			<td>Store at -20 or -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:263px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">112660-012</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">L-glutamine (100x)</td>
			<td style="width:263px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">25030-081</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Penicillin/Streptomycin (100x)</td>
			<td style="width:263px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">15140-122</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Non-essential amino acids solution (100x)</td>
			<td style="width:263px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">11140-050</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td>
			<td style="width:263px;">Peprotech</td>
			<td style="width:136px;">100-18B</td>
			<td>Store at -20 or -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">ITS (100x)</td>
			<td style="width:263px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">41400-045</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">49752</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">DMEM (high glucose) medium</td>
			<td style="width:263px;">Thermo</td>
			<td style="width:136px;">SH30243.01B</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">FBS</td>
			<td style="width:263px;">Hyclone</td>
			<td style="width:136px;">SV30087.01</td>
			<td>Store at -40 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Ficoll</td>
			<td style="width:263px;">GE Healthcare, SIGMA</td>
			<td style="width:136px;">17-5442-02</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Trehalose&#160;</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">T9531</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">DMSO</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">D2650</td>
			<td>Store at RT, protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Endofree Plasmid Maxi Kit(10)</td>
			<td style="width:263px;">Qiagen</td>
			<td style="width:136px;">12362</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">IMDM</td>
			<td style="width:263px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">21056-023</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Human CD34+ Cell Nucleofection Kit</td>
			<td style="width:263px;">Lonza</td>
			<td style="width:136px;">VPA-1003</td>
			<td>Store at RT, nucleofection buffer and supplement buffer should be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Sodium butyrate</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">B5887</td>
			<td>Store at -20 or -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">ROCK inhibitor Y27632</td>
			<td style="width:263px;">STEMGENT</td>
			<td style="width:136px;">04-0012-10</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Essential 8 basal medium (E8)</td>
			<td style="width:263px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">A15169-01</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, the supplement should be stored at -20 or -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Matrigel</td>
			<td style="width:263px;">BD</td>
			<td style="width:136px;">354277</td>
			<td>Store at -20 or -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">2x EasyTaq PCR SuperMix(+dye)</td>
			<td style="width:263px;">TransGen Biotech</td>
			<td style="width:136px;">AS111</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Cell detachment solution</td>
			<td style="width:263px;">STEMGENT</td>
			<td style="width:136px;">01-0006</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, Accutase as a cell detachment solution to obtain a single cell suspension</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">DAPI</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">D9542-1MG</td>
			<td>Store at 4 &#176;C or -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Anti-nanog-AF488</td>
			<td style="width:263px;">BD</td>
			<td style="width:136px;">560791</td>
			<td style="width:723px;">Store at 4 &#176;C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Anti-OCT4</td>
			<td style="width:263px;">abcam</td>
			<td style="width:136px;">ab19857</td>
			<td style="width:723px;">Store at 4 &#176;C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">AF488 donkey anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:263px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">A21202</td>
			<td style="width:723px;">Store at 4 &#176;C, secondary antibody used for Immunofluorescence,&#160; dilute 1/500 when use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">PE anti-human TRA-1-60-R Antibody</td>
			<td style="width:263px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">330610</td>
			<td style="width:723px;">Store at 4 &#176;C, antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">eFluor 570-conjugated anti-SSEA4</td>
			<td style="width:263px;">eBioscience</td>
			<td style="width:136px;">41-8843</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Isotype antibody</td>
			<td style="width:263px;">eBioscience</td>
			<td style="width:136px;">11-4011</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Alkaline Phosphatase Detection Kit</td>
			<td style="width:263px;">SiDanSai</td>
			<td style="width:136px;">1102-100</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Genomic DNA Extraction Kit</td>
			<td style="width:263px;">TIANGEN</td>
			<td style="width:136px;">DP304-02</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Trypan Blue solution</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">T8154</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Flow cytometry cell analyzer</td>
			<td style="width:263px;">BD</td>
			<td style="width:136px;">LSRII</td>
			<td>for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Spinning disk confocal microscope (SDC)</td>
			<td style="width:263px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:136px;">UltraVIEW VOX</td>
			<td>for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Nucleofection device</td>
			<td style="width:263px;">Lonza</td>
			<td style="width:136px;">Nucleofector 2b</td>
			<td>for the nucleofection of PB MNC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">ImageQuant LAS-4010</td>
			<td style="width:263px;">GE</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>take photo of AP staining in bulk</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of integration-free induced pluripotent stem cells from human peripheral blood mononuclear cells using episomal vectors

תאי גזע מושרים (iPSCs) מחזיקים הבטחה גדולה עבור מודלי מחלה וטיפולים רגנרטיבית. אנחנו שדווח בעבר השימוש וקטורים Episomal (EV) כדי ליצור iPSCs אינטגרציה נטולת מתאי דם היקפיים mononuclear (MNCs PB). הווקטורים episomal בהם נעשה שימוש הם פלסמידים DNA משולב עם אלמנטים oriP ו EBNA1 מן נגיף אפשטיין-באר (EB), המאפשרים retainment לטווח ארוך שכפול של פלסמידים בתאי יונקים, בהתאמה. עם אופטימיזציה נוספת, אלף מושבות iPSC ניתן להשיג 1 מיליליטר של דם היקפי. שני גורמים קריטיים להשגת יעילות תכנות מחדש גבוה הם: 1) השימוש של 2A &quot;עצמי מחשוף&quot; פפטיד לקשר Oct4 ו Sox2, ובכך להשיג ביטוי equimolar של שני הגורמים; 2) שימוש שני וקטורים להביע MYC ו KLF4 בנפרד. כאן אנו מתארים צעד-אחר-צעד פרוטוקול להפקת ה- IP אינטגרציה נטולתגיל מדגים דם היקפי מבוגר. IPSCs שנוצר הם אינטגרציה נטולת כמו פלסמידים episomal שיורית הם לגילוי לאחר חמישה קטעים. למרות היעילות תכנות מחדש דומה לזו של וירוס סנדאי (SV) וקטורים, פלסמידים EV הם הרבה יותר חסכוני מאשר וקטורים SV זמינים מסחרית. מערכת תכנות מחדש EV סביר זה טומן בחובו פוטנציאל ליישומים קליניים ברפואה רגנרטיבית ומספקת גישה עבור תכנות מחדש הישיר של MNCs PB לתאי גזע mesenchymal ללא אינטגרציה, תאי גזע עצביים, וכו.

שימוש בפרוטוקול זה, אנו יכולים להשיג מאות מושבות מ 1 x 10 5 nucleofected MNCs PB (איורים 1 א ו -1 B). יעילות תכנות מחדש היא כ 0.2 - 0.5% ואת המושבות להביע סמני pluripotency (1C הדמוי ו 1D). iPSCs שנוצר באמצעות פרוטוקול המתוארים הם ללא אינטגר...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors at JoVE.com

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

דור של תאי גזע מושרים אינטגרציה נטולה מן אדם הדם ההיקפי mononuclear תאי שימוש וקטורי Episomal

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מקפוא באפי מעילים באמצעות Episomal פלסמידים ללא שילוב

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

דור של תאי גזע האינטגרציה נטול האדם המושרה pluripotent שימוש קרטינוציטים נגזר שיער

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מתאי T ההיקפיים אנושיים באמצעות וירוס סנדאי בתנאים ללא מזין

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

דור של תאי גזע מושרים ממלנומה האדם שחדר-גידול לימפוציטים

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

נייד דור גזע מושר מתאי דם באמצעות וירוס Sendai ו צנטריפוגה

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

מוגדרי דור Scalable של תאי Hepatocyte דמוי מתאי גזע פלוריפוטנטיים האנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

הבדל Chondrocytes מ היקפי דם הנגזרות האדם תאים Pluripotent Pluripotent Induced

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

אינטגרציה חופשית של גזירה אנושית של תאים גזעיים Pluripotent באמצעות Laminin 521 מטריקס

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

דור של תא צורב עור תלת-ממד של כבל דם-derived המושרה בתאי גזע Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...