Name: intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice
Uploaded: 2018-01-19T12:30:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice at JoVE.com

Vi vil gerne takke Rien van Haperen og Rini de Crom for deres udvikling og donation af linjen eNOSTag-normal god landbrugspraksis, Joost A.P. Rens for sin tekniske bistand med det animalske arbejde og de animalsk pedeller for deres hjælp. Mikroskopi faciliteter bruges er en del af Erasmus-optisk Imaging Center, og vi vil gerne takke personalet OIC for deres service. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud DDHK 2000-2224 fra hollandske Kræftens Bekæmpelse, "Vereniging Trustfonds" Erasmus University Rotterdam og "Stichting Erasmus Heelkundig Kankeronderzoek", og vi vil gerne takke medlemmerne af udvalgene for deres generøse donation.

Alle dyreforsøg blev gjort i henhold til nederlandsk lovgivning, og protokoller blev godkendt af Udvalget dyre eksperimenter af Erasmus MC, Rotterdam, Holland.
1. modtagende mus
<ol><li>Når de Transgene mus er født, skærmen dyr for passende genotype ved hjælp af standardprocedurer9. Bemærk: I dette manuskript, data indhentet fra en eNOStag-NGL linje9 udviklet in-house og en købt ROSA-mTmG (stock 007676)10 linje er præsenteret.</li>
	<li>Bruge mus der er 12 uger gamle eller ældre, og der er over 20 g.</li>
</ol>2. donor mus
Bemærk: En tumor fragment til implantation i vinduet dorsale er fremstillet af en ikke-transgene donordyret. Afhængigt af hvilken tumor bruges normal (med syngeneic tumorer) eller immundefekte (xenografts) mus.
<ol><li>Vokse tumorceller i et medium med de relevante kosttilskud i kultur kolber på 37 ° C og 5% CO2.</li>
	<li>Fjern mediet fra celle kolber, vaske en gang med 1 x PBS, og frigør celler ved hjælp af 0,25% trypsin.</li>
	<li>Deaktiver trypsin ved at tilføje cellekulturmedium. Indsamle cellerne, spin ned på 1.200 x g i 5 min, og resuspenderes i 5 mL PBS.</li>
	<li>Fortyndes 20 µL af cellesuspension med 20 µL af trypan blå, som pletter døde celler. Tæl antallet af levende og døde celler ved hjælp af en hemocytometer; antallet af døde celler bør ikke overstige 10%.</li>
	<li>Spin celler igen på 1.200 x g i 5 min og resuspenderes celle i iskold PBS, højtydende 1 million celler pr. 100 µL. Transport celler på is på operationsstuen.</li>
	<li>Bedøver dyret ved hjælp af isofluran/O2. Tænd ilt og justere strømmen til 0,5 mL/min. Reguler isofluran vaporizer til 3%. Efter et par minutter, skal du placere musen i anæstesi-afdeling. Bemærk: Prefill kammeret for at sikre det er klar til brug til at minimere stress.</li>
	<li>
Når musen er bedøvet, bringe dyret på operationsbordet i varme, holdt ved 37 ° C, og Placer snuden i anæstesi næsen kegle.
	<ol>
<li>Bemærk: Dyret er korrekt bedøvet, når ingen reaktion på en footpad knivspids er noteret.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Barbering med musen for at bedre visualisere injektionsstedet. Podes ved hjælp af en 0,5 mL insulin sprøjte; indsprøjtes 100 µL af celler ind i flanken på musen og tillade en tumor til at udvikle.</li>
	<li>Aflive dyret af cervikal dislokation under bedøvelse som er godkendt af din institutionelle Animal Care og brug udvalget.  Brug mikro saks og pincet, skar huden på placeringen af tumor og dissekere tumor. Sætte tumor i en petriskål med PBS. Ved hjælp af mikro saks og pincet, skåret tumor i fragmenter af ca 1 mm3 (figur 1A-en). Bemærk: Tumor af donor musen skal være stor nok til at give tilstrækkeligt materiale, men store, nekrotisk tumorer bør undgås. For de fleste tumorer nok en gennemsnitlig diameter på 10 mm.</li>
</ol>3. implantation af vinduet kammer
<ol><li>Udføre alle procedurer under aseptiske forhold. Autoklave kirurgiske instrumenter (figur 1A) og kammer materialer (figur 1B). Bemærk: Vinduet mødesalen anvendes her, med en samlet vægt på 1,1 g, er lavet af polyether ether keton (PEEK), en lys, syntetisk materiale, der er Mr kompatibel. PEEK er 3.4-fold lettere end titanium, som er almindeligt anvendt i litteraturen for disse vinduer. Det er resistent over for de fleste kemikalier, er inert, provokere ikke immun reaktioner og er robust. Dette vindue er også mindre i design i forhold til tidligere offentliggjorte windows. Mus monteret med dette vindue show fuld kapacitet for motion, kan klatre, og få vægt sammenligneligt til mus uden et vindue kammer. Fordi dyret kan bide på vinduet, syntetiske windows kan vare lidt kortere i forhold til titanium windows; de er imidlertid let at lave og er billig. Disse særlige vinduer er lavet in-house og kan erhverves efter anmodning.</li>
	<li>Adstadige modtager musen bruger indånding anæstetika (dvs. isofluran/O2) i en anæstesi-afdeling. Bringe musen til opvarmet operationsbordet holdt ved 37 ° C og Anbring snuden i anæstesi næsen kegle (Se trin 2.6). Anvende øjet salve for at undgå tørhed.</li>
	<li>Fjerne håret fra hele tilbage ved barbering og anvende hår fjernelse gel. Passe på, at alle gel fjernes ved at skylle dyret forsigtigt med hånd-varm vand fra hanen. Tør dyret og rense huden med 70% ethanol. Bemærk: Proceduren barbering kan også være gjort dagen før vinduet implantation. Cremen skal fjernes grundigt med hånd-varm vand, da dette kan forårsage hudirritation.</li>
	<li>Mark midterlinien på musen rygsøjlen med en markør for at sikre den symmetriske positionering af salen. Flyt musen, trække huden ind en klap ved hjælp af den midterste linje som en sammenfoldelig position og forstå midt i klap. Placer vinduet, sådan at toppen af rammen er mindst 2 mm under midterlinien og cirkel området vindue se på huden med en markør.</li>
	<li>Ved hjælp af en skalpel indehaveren/klinge størrelse 15 og mikro saks, fjerne huden langs de tegnede cirkulær linje. Pas på ikke at beskadige underliggende fascia. Bemærk: Dette skaber området vindue visning af salen, hvor tumoren er transplanteret.</li>
	<li>Trække op til skinfold og bruge en øre puncher til punch huller 1 mm i diameter gennem huden, én på hver side af eksempelområdet (figur 1A-b). Bemærk: Disse er huller til to bolte til at fastsætte vinduesrammer sammen.</li>
	<li>Placere rammen custom-made forreste kammer ved hjælp af bolte (tal 1B-a, 1 b-c) og placere den tilbage ramme (figur 1B-b) på bolte. Placer nødder (figur 1B-d) på rammen tilbage på bolte. Bemærk: Disse bolte der bruges til at rette i chambers sammen mod den skinfold og bruges senere til at immobilisere salen under evaluering under mikroskop.</li>
	<li>Træk huden 2-3 mm over toppen af rammerne og sørg for at området ender vindue visning matcher området kammer. Plads 23 G nåle gennem de to lille sutur huller (figur 1B, sort pil) øverst på rammen. Spænd møtrikkerne på bolte med en micro skruetrækker (figur 1A-c) og en klemmer nål indehaveren til at immobilisere nødder. Bemærk: Tage forholdsregler for at sikre, at huden ikke bliver omkring bolte, og ikke stramme for meget.</li>
	<li>Udskifte nåle med suturer, startende fra toppen til at lave rammer mod huden. Gør det til 5 par af sutur huller (figur 1B, Hvid pil) i rammen.</li>
	<li>Aktivere mus for at afsløre bagsiden af vinduet kammer. Placer et tykt stykke fyldstof glas med en diameter på 10 mm og en tykkelse på 0,55 mm (figur 1B-e) og derefter en standard dækning glas 12 mm (figur 1B-f). Fastgør disse med en låseringen (figur 1B-g) i området tilbage-kammer. Bemærk: Fyld glasset forhindrer plads til at åbne mellem fascia og vinduet på forsiden, der bruges til billedbehandling.</li>
	<li>Hydrat området vindue se hvor tumor vil blive indsat ved at udfylde en 1 mL sprøjte med steril 0,9% NaCl. Tillad et par dråber til at falde på denne vis område. Fjern overskydende saltopløsning med en steril bomuld spids.</li>
	<li>I fascia, oprette en lomme stor nok til at holde 1 mm3 tumor fragmentet (figur 1A-a) ved hjælp af en 25 G kanyle med dens spids er bøjet i en 90 ° vinkel (figur 1A-d). Ved hjælp af en nål indehaveren eller Kelly pincet, indsætte tumor fragment ender vindue se området i denne lomme.</li>
	<li>Luk vinduet Vis område med en standard dækning glas 12 mm og en låseringen. Bemærk: En luftboble kan danne, men det vil forsvinde inden for timer.</li>
</ol>4. før og efterbehandlingen af dyret
<ol><li>Administrere medicin til smertelindring (dvs., 0,05 mg/kg buprenorphin) subcutaneously som er godkendt af din institutionelle Animal Care og brug udvalget. Tillad den mus hen til genoprette fra anæstesi under en varme lampe.</li>
	<li>Placer vinduet-bærende mus individuelt i et bur og en klima-kontrollerede værelse indstillet til 32 ° C og over 50% fugtighed. Sørg for at vandflasker er miljømæssige temperatur før du placerer dem på bur at forhindre lækage. Bruge bure og berigelse, der tillader uhindret bevægelighed og adgang til mad og vand. Bemærk: Som vindue her er meget veltolereret, mus viser normal adfærd. Individuelle boliger forhindrer skader vindue salen forårsaget af andre mus, og den høje temperatur/fugtighed forhindrer afkøling ned og dehydrering af den skinfold.</li>
	<li>Kontrollere musen regelmæssigt til tygges-off suturer, løs bolte/møtrikker eller dække glasskår. Straks reparere og udskifte, når dette sker. Et cover lavet af let materiale kan bruges til at beskytte vinduet.</li>
</ol>5. intravital Imaging
Bemærk: Denne procedure, en multiphoton mikroskop og passende kontrol software bruges. Her, er software-pakker, der blev leveret med mikroskoper brugt. Hovedstol vil enhver software-pakke, der leveres med et mikroskop og er beregnet for mikroskopet kontrol og for erobringen af billeder suite herpå.
<ol><li>Tænd for systemet: PC/mikroskop, magt til Konfokal styreenheden, laser power, og laser emission. For eksempel med denne software, starter softwaren og initialisere tabellen mikroskop (figur 1E-a og 1E-c) ved at klikke på "initialisere tabel." Tænd for systemet og indstillet det til aktivering af PC til at styre mikroskop, xy-table, z-positionering og billedoptagelse.</li>
	<li>Tænd den fluorescerende lys (figur 1E-b). Bemærk: Dette bruges til at evaluere fluorescens billeder gennem okulær sammen med lyse felt.</li>
	<li>Tænd den skræddersyede, temperatur-kontrollerede platform (figur 1 C-c; beskrevet i diskussion mere detaljeret) indstillet på 37 ° C.</li>
	<li>Tænd for anæstesi enheden ved hjælp af isofluran/O2 (figur 1E-d). Montere anæstesi røret på stadiet mikroskop (figur 1 C-e). Installere en klemme på xy-fase at fastsætte anæstesi snude stykke.</li>
	<li>Forhånd vurdere dyret for at etablere fase af tumor fartøj udvikling; Dette afhænger af hastigheden af tumorvækst, men det kan variere mellem individuelle mus.
	<ol>
<li>Adstadige musen bruger indånding anæstetika (isofluran/O2) i en anæstesi-afdeling (Se trin 2.6).</li>
		<li>Placere dyret på temperatur-kontrollerede platform monteret på mikroskop scene. Dette forhindrer til afkøling af dyret, når det er bedøvede. Sørg for Snuden af musen er placeret i anæstesi kegle og anvende øjet salve, hvis evalueringen vil tage længere tid end 5 min. Bemærk: En evaluering længere end 1 h, reducere isofluran flow til 2%.</li>
		<li>Brug kammer bolte til at lave (figur 1 C-b, fuld pil) salen på en skræddersyet kammer indehaveren (figur 1 C-en). Skru denne indehaveren (figur 1 C-d, stiplet pil) til opvarmet platform (figur 1 C-c). Bemærk: Denne kombination forhindrer bevægelse artefakter i vinduet Vis område mens det stadig tillader dyret at ånde frit.</li>
		<li>Sørg for at rengøre glasset i den rude Se område med bomuld spids dyppet i vand for at undgå en sløret billede og interferens kommer fra snavs på ydersiden af glasset. Placere platform og musen på stadiet mikroskopet (fig. 1 d). Bemærk: passe på, at halen ikke sætter sig fast mellem platformen og mikroskop fase.</li>
		<li>Visuelt kontrollere stadium af tumor fartøj udvikling ved hjælp af en 10 X mål linse, lyse-felt og fluorescerende lys. Bemærk: Fluorescerende fartøjer skal være i fokus og blodgennemstrømningen skal være synlig ved hjælp af lysfelt. Når Vaskulaturen ses tydeligt, vurdere fase af tumor fartøj udvikling. For eksempel, afgøre, om der er tidlig debut angiogenese med væksten i spidsen celler eller en allerede etableret Vaskulaturen for drug delivery. Samme dyr kan evalueres igen, og som tumor udvikling er en kontinuerlig proces. Flere faser kan observeres i en enkelt tumor på samme tid.<ol>
<li>Når det ikke er muligt at fokusere på Vaskulaturen, fjerne dyret fra scenen, lad musen genoprette og sted dyret tilbage i en klima-kontrollerede plads. Tjekke det igen senere. Når musen er klar til evaluering, fortsætte processen beskrevet nedenfor.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Tænd de Konfokal lasere og Kontrolpanel ved at klikke på "Laser" og "Ctrl panel" i fanen konfiguration Bemærk: Det anbefales at indstille laser power lav, især for Argon laser, at forhindre blegning, opvarmning af væv og solskader. Kontrolpanelet kan indstilles til personlige præferencer. For intravital billeddannelse ved hjælp af flere fluorophores anbefales det at anvende følgende indstillinger: "smart gevinst, 100 V pr. tur," "smart offset, 10% pr. tur," ", medium,""X zoomposition, medium," "Y position, medium," og "Z position, 100 µm per igen." Før imaging, justere forskydning for at minimere støjen og optimere signal til støjforhold. Konfokal zoom-funktionen giver mulighed for en højere forstørrelse uden at ændre mål linser. X, Y og Z kontrol er nødvendig for at finde interesseområder. Intravital mikroskopi, bør Z-positionering være omkring 100 µm per tur som tick væv er evalueret.</li>
	<li>Klik på "Køb" i fanen erhverve og ændre indstillingen til: "Erhvervelse mode XYZ eller XYZT," "Format (512 x 512 eller 1024 x 1024)" og "Hastighed (400 Hz eller 200 Hz)." Klik på "Pinhole" og sæt den til 1 luftige enhed. Klik på "Bidirectional X". Bemærk: For at optimere billeder, findes en balance mellem laser power, gevinst og pinhole bør, som er nævnt i diskussionen.</li>
	<li>Ved vurderingen af flere fluorophores, Vælg "sekventiel scan" og "mellem rammer" til at forhindre gennemblødning, som er nævnt i diskussionen.  Vælg "Linje gennemsnit 4" til at opnå en god reduktion af støjen. Bemærk: Afhængigt af den iboende fluorescens i den transgene dyr, andre fluorescerende markører, indkvartering dextrans, Hoechst, FITC-BSA, fluorescerende kemoterapeutika og nanopartikler fortyndet til den ønskede koncentration i 0,9% NaCl kan være forvaltes og vurderes i tumor. Disse er injiceres gennem den hale eller penis vene.</li>
	<li>Klik på "Eksperiment" i fanen erhverve og vælg "New" til at lave en ny data base.</li>
	<li>Evaluere den animalsk hjælp, afhængig af forskningsspørgsmål, 10 X, 20 X eller 40 X mål linser. Gennem okulær, finde en position til at evaluere. Bemærk: Det er bedst at bruge tørre linser med en NA så højt som muligt, så tør linser har en forholdsvis lang arbejdstid afstand og gør ikke behovet for fordybelse væske. I diskussionen, er brugen af vand-fordybelse målet linser nævnt.</li>
	<li>Bruge en hurtig levende scanning for at finde den rette gevinst og offset undgå overeksponering og optimere signal til støjforhold. Desuden opretholde samme indstillinger under og mellem eksperimenter hvis kvantitativ sammenligning er nødvendig. Bemærk: Yderligere overvejelser for optimal imaging er nævnt i diskussionen. XYZ holdning og zoom kan færdiggøres under live scanningen ved hjælp af Kontrolpanel.</li>
	<li>For at gøre en Z-stak, vælge "Z-stack" under fanen erhverve gør en hurtig Z-scanning ved hjælp af Z-position i betjeningspanelet og indstille begyndelsen og slutningen af scanningen ved at klikke på "Begin µm" og "Ende µm." Indstille Z-trin størrelse relateret til pinhole størrelse.</li>
	<li>Fange billeder ved at klikke på "start". Bemærk: Som intravital mikroskopi handler om kinetik og derfor dynamiske processer er observeret, et kompromis mellem den tid, det tager at erhverve et billede og hastigheden af de biologiske processer skal gøres. Generelt, jo højere opløsning, de mere fluorescerende kanaler er scannet og jo større den scanning felt, de flere pixels per billede. Tykkere Z-stakke oversætte til en længere imaging tid. En længere imaging tid øger chancen for bevægelse artefakter og kan forårsage skade på vævet afbildet. Desuden være opmærksom på at scanne visse fluorescerende etiketter forårsager blegning og giftighed, der er berørt af laser power og koncentrationen af de akkumulerede farvestof.</li>
	<li>Efter scanning Z-stak kan hurtigt vurderes ved at klikke på "maksimal projektion". Z-stakken gemmes automatisk i databasen og kan omdøbes.</li>
</ol>6. dataanalyse
<ol><li>Afhængigt af den oprindelige problemformulering, skal du bruge en af flere software-programmer, såsom ImageJ5, Matlab11eller Amira, til dataanalyse. Korrekt analyse er afgørende.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17, 545-580 (2003).</li><li>Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+hallmarks+of+cancer+in+living+mice.">Imaging hallmarks of cancer in living mice.</a> Nat Rev Cancer. 14, 406-418 (2014).</li><li>Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+tumors.">In vivo imaging of tumors.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), (2010).</li><li>Palmer, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+optical+molecular+imaging+and+analysis+in+mice+using+dorsal+window+chamber+models+applied+to+hypoxia,+vasculature+and+fluorescent+reporters.">In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent reporters.</a> Nat. Protocols. 6, 1355-1366 (2011).</li><li>Seynhaeve, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+alpha+mediates+homogeneous+distribution+of+liposomes+in+murine+melanoma+that+contributes+to+a+better+tumor+response.">Tumor necrosis factor alpha mediates homogeneous distribution of liposomes in murine melanoma that contributes to a better tumor response.</a> Cancer Res. 67, 9455-9462 (2007).</li><li>Schiffelers, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-targeted+liposomes+directed+against+pathological+vasculature.">Ligand-targeted liposomes directed against pathological vasculature.</a> J Liposome Res. 12, 129-135 (2002).</li><li>Straetemans, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+receptor+gene+therapy+in+human+melanoma-bearing+immune-deficient+mice:+human+but+not+mouse+T+cells+recapitulate+outcome+of+clinical+studies.">T-cell receptor gene therapy in human melanoma-bearing immune-deficient mice: human but not mouse T cells recapitulate outcome of clinical studies.</a> Hum Gene Ther. 23, 187-201 (2012).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li><li>van Haperen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+endothelial+nitric+oxide+synthase+fused+to+green+fluorescent+protein+in+transgenic+mice.">Functional expression of endothelial nitric oxide synthase fused to green fluorescent protein in transgenic mice.</a> Am J Pathol. 163, 1677-1686 (2003).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Manzoor, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+limitations+in+nanoparticle+drug+delivery:+triggered,+intravascular+release+to+improve+drug+penetration+into+tumors.">Overcoming limitations in nanoparticle drug delivery: triggered, intravascular release to improve drug penetration into tumors.</a> Cancer Res. 72, 5566-5575 (2012).</li><li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice.">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nat Protoc. 5, 1518-1534 (2010).</li><li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo.">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> J Vis Exp. , e50546 (2013).</li><li>Hobbs, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+transport+pathways+in+tumor+vessels:+role+of+tumor+type+and+microenvironment.">Regulation of transport pathways in tumor vessels: role of tumor type and microenvironment.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4607-4612 (1998).</li><li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumours.">Drug penetration in solid tumours.</a> Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).</li><li>Koning, G. A., Eggermont, A. M., Lindner, L. H., Hagen, t. e. n., L, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperthermia+and+thermosensitive+liposomes+for+improved+delivery+of+chemotherapeutic+drugs+to+solid+tumors.">Hyperthermia and thermosensitive liposomes for improved delivery of chemotherapeutic drugs to solid tumors.</a> Pharm Res. 27, 1750-1754 (2010).</li><li>Seynhaeve, A. L., Eggermont, A. M., ten Hagen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF+and+manipulation+of+the+tumor+cell-stromal+interface:+&amp;#34;ways+to+make+chemotherapy+effective&amp;#34;.">TNF and manipulation of the tumor cell-stromal interface: &amp;#34;ways to make chemotherapy effective&amp;#34;.</a> Front Biosci. 13, 3034-3045 (2008).</li><li>Brouckaert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha+augmented+tumor+response+in+B16BL6+melanoma-bearing+mice+treated+with+stealth+liposomal+doxorubicin+(Doxil)+correlates+with+altered+Doxil+pharmacokinetics.">Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics.</a> Int J Cancer. 109, 442-448 (2004).</li><li>Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., ten Hagen, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+low-dose+tumor+necrosis+factor-alpha+to+systemic+treatment+with+STEALTH+liposomal+doxorubicin+(Doxil)+improved+anti-tumor+activity+in+osteosarcoma-bearing+rats.">Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats.</a> Anticancer Drugs. 16, 667-674 (2005).</li><li>Gabizon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+circulation+time+and+enhanced+accumulation+in+malignant+exudates+of+doxorubicin+encapsulated+in+polyethylene-glycol+coated+liposomes.">Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes.</a> Cancer Res. 54, 987-992 (1994).</li><li>Bergers, G., Benjamin, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorigenesis+and+the+angiogenic+switch.">Tumorigenesis and the angiogenic switch.</a> Nat Rev Cancer. 3, 401-410 (2003).</li><li>Eilken, H. M., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+endothelial+cell+behavior+in+sprouting+angiogenesis.">Dynamics of endothelial cell behavior in sprouting angiogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 22, 617-625 (2010).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer.">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> J Vis Exp. , e50088 (2013).</li><li>van Vliet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MR+angiography+of+tumor-related+vasculature:+from+the+clinic+to+the+micro-environment.">MR angiography of tumor-related vasculature: from the clinic to the micro-environment.</a> Radiographics. 25, S85-S97 (2005).</li><li>Dicheva, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+thermosensitive+liposomes:+a+novel+dual+targeted+heat-triggered+drug+delivery+approach+for+endothelial+and+tumor+cells.">Cationic thermosensitive liposomes: a novel dual targeted heat-triggered drug delivery approach for endothelial and tumor cells.</a> Nano Lett. 13, 2324-2331 (2013).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+intratumoral+nanoparticle+extravasation+and+penetration+by+mild+hyperthermia.">Improved intratumoral nanoparticle extravasation and penetration by mild hyperthermia.</a> J Control Release. 167, 130-137 (2013).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Som tumor og tumor fartøj udvikling samt tumor terapeutiske virkninger, er meget dynamiske processer, er intravital evaluering et elegant værktøj til at foretage en korrekt vurdering af disse processer på et tidspunkt - og rumlige-afhængige måde. Med den øgede tilgængelighed af levende celle markører, oprettelsen af transgene dyr og udviklingen af imaging modaliteter, bliver intravital imaging mere og mere populære. Selvom histologi bruges stadig rutinemæssigt, og et væld af markører kan bruges til at identificere celler og strukturer, har væv skæring ulemper når undersøge dynamiske processer. Væv dissektion er påkrævet, giver kun statiske oplysninger; fiksering påvirker væv kvalitet; og udskæring skader cellulære vekselvirkninger. Også, når undersøge dynamiske processer, væv dissektion på forskellige og ofte formodede, tidspunkter kræver en stor mængde af dyr. Med intravital imaging, kan XYZ rumlige dimensioner og den ekstra dimension af tid evalueres i de samme dyr, gør den korrekte placering af forskellige spillere muligt i tid og rum. Derfor er ikke gå glip af optimale tidspunkter, og animalske antallet bruges pr. eksperiment reduceres betydeligt. For det andet kan tidsvinduet etableret med intravital evaluering ekstrapoleres til at optimere væv udvinding. For det tredje kan den ønskede fase af fartøjet vækst identificeret intravitally og farves som et hele-mount væv.
Intravital design er nævnt i dette manuskript bruger en kombination af transgene dyr at udtrykke en fluorescerende etiket i endothelial celler, en modificeret dorsale skinfold kammer model, og en dedikeret multiphoton-Konfokal mikroskop.
Endotelceller gå gennem en række stadier21,22 under angiogenese, og disse faser kan ofte ses samtidig i en svulst. Bruger eNOSTag-NGL mus linje, individuelle endotelceller kan følges, og selv filopodia dynamics kan spores. Det er derfor en god model til at studere fartøj udvikling intravitally. Afhængigt af de allerede-nuværende iboende etiketter, kan injicerbare fluorescerende agenter bruges til at vurdere lumen dannelse, blodgennemstrømning, ekstravasation og blod clearance. Musen er afbildet kontinuerligt for op til 5 h. Den langsigtede evaluering af et dyr er muligt når der træffes flere forholdsregler vedrørende bedøvelse af dyret, der har været beskrevet tidligere23. Da denne forskning er fokuseret på kræft, blev tumorer væv eller celler implanteret. Men vi også eksperimenteret med mellemfodsknogler og embryonale lunger. Dog vækst af væv under undersøgelse er en begrænsning, som efter et par uger, huden begynder at regrow, som kan være et problem med langsomt voksende tumorer eller væv.
I valideringsfasen sammenlignet den dorsale skinfold vindue kammer var betydeligt ændret med den klassiske model4. Rammerne er konstrueret af autoklaverbart syntetisk materiale og er lette og små, med et stort vindue-se område. Krog af låseringen (figur 1Bg, hvid pilespids) bruges kun til nem fjernelse af ringen. Holderen ringe uden kroge kan bruges, når disse forstyrrer billeddannelse. Huden er ikke strakt alt for meget, løsne forekommer ikke i denne model, og infektioner ses kun sjældent. Disse ændringer reducere dyrs ubehag og forfine den animalske procedure betydeligt. Også, de metal dele let kan fjernes når imaging tumor ved hjælp af Mr24.
Enhver mikroskop kan vedtages til intravitally billede dorsale skinfold kamre. Det vigtigste krav er den tilgængelige plads mellem mikroskop fase og mål linse. Et vigtigt aspekt, der påvirker imaging er motion. For at forhindre bevægelse artefakter, bør en platform, der passer i tabellen mikroskop (efter fjernelse af alle skær) og understøtter musen anvendes. Det er ikke nødvendigt at begrænse musen, når det er under bedøvelse, og det er bedre at lade musen ånde frit. Men vinduet er boltet fast til den platform, giver optimal fiksering af synsfelt (dvs. tumor er synlige gennem vinduet). Platformen er opvarmet ved hjælp af en elektronisk varmepude, som anvendes til dyr varme. Denne platform blev lavet in-house, og detaljerne kan fås efter anmodning. En høj opløsning mål linse er en nødvendighed ved evaluering af intracellulær processer og gør det muligt at forskelsbehandle cytoplasma og kernen. Brug af en tilspidset linse med en god optisk opløsning (høj NA) men en relativt lang arbejde afstand (helst 2 mm eller derover) anbefales. Begrænsning i imaging er indtrængningsdybde og fluorescerende intensiteten af etiketterne. Desuden, photobleaching, fototoksicitet, og mætning skal undgås under imaging.
Her, blev en integreret Konfokal-multiphoton og en Konfokal mikroskop brugt. Multiphoton er opretstående, mens den Konfokal er en inverteret mikroskop. Fordelen ved en opretstående mikroskop er nem brug af vand-fordybelse linser. Disse linser har en høj NA og lang arbejde afstand, selv ved høj (f.eks. 20 eller 40 X) forstørrelse. Specifikt, anbefales det at anskaffe en 20 X NA 1,0 vand-fordybelse linse, som sælges af flere virksomheder. Vær opmærksom på at, når fordybelse linser bruges, mål linse og fordybelse væske skal være opvarmet til 37 ° C. De bedste billeder, det anbefales at bruge optimale Konfokal indstillinger (dvs. pinhole på 1 luftige enhed, laser power så lavt som muligt, gevinst ikke for højt (især hvis gevinsten introducerer støj), line hastighed på maksimum, og ingen gennemsnit af scanninger). Overeksponering, mætning, og forskellen i intensiteter mellem billeder kompromittere datakvalitet. Det anbefales at forhindre mætning og overeksponering. Dette kan omgås ved at erhverve billeder på forskellige gain-indstillinger. Ændre gevinsten er den nemmeste måde at ændre billedets lysstyrke. Hvis det er nødvendigt, kan laser power justeres. For at standardisere billedkvaliteten, kan dias med en fast fluorescens intensitet bruges. Man skal huske på at selv når mikroskop er indstillet optimalt, billedkvalitet bestemmes i høj grad af kvaliteten af vinduet kammer og væv
Når du scanner flere fluorescerende markører samtidigt, skal gennemblødning, hvor en fluorophore er opdaget i den engelske kanal fra en anden, undgås. Undgå gennemblødning ved hjælp af en kombination af fluorophores med minimal overlappende spectra og sekventiel scanning mellem rammer. Billederne præsenteres her blev scannet ved hjælp af 3 sekventielle scanninger (spor 1: normal god landbrugspraksis, DID eller fluor647 med 488 og 633 laser; spore 2: rhodaminfilteret, Doxil eller mTomato med 543 laser; og spore 3: Hoechst med 405 laser).
Mulighed for at evaluere flere stadier af tumor fartøj udvikling, tip celle dynamics, lumen dannelse, ekstravasation og vaskulære skader er vist her. Ved hjælp af linjen eNOStag-normal god landbrugspraksis, opdages tumor områder med en ødelagt vaskulære bed let af granuleret cellulære rester stadig udtryk for normal god landbrugspraksis. Ingen injicerbare agent blev fundet i disse områder, som angiver manglen strøm. Det betyder, at administreres kemoterapeutiske stoffer vil ikke nå disse områder enten. Fartøj ødelæggelse kan dog også være et terapeutisk resultat. Forudgående evaluering af tumor, skal kontrolleres for forbehandling fartøj ødelæggelse, er en forudsætning for den nøjagtige terapeutiske evaluering og let kan udføres ved hjælp af denne eksperimentelle design.
Der er et væld af muligheder som intravital mikroskopi kan anvendes, og detaljeret diskussion er uden for rammerne af denne publikation. For at give et kort indblik, omfatter mulige anvendelser studier på ophobning af kemoterapeutika i tumor væv, udvikling af fartøjer (f.eks. antallet af fartøjer, grene og vejkryds) og blodgennemstrømningen, celle-celle interaktioner, celle målretning, og intracellulære forarbejdning samt eksempler nævnt ovenfor og vist her. Som analysen er baseret på fluorescens, være opmærksom på intensitet udsving på grund af kvaliteten af vindue eller væv. Også, som tumor væv er forholdsvis tyk, fluorescens fra over eller under plan synspunkt har en indvirkning på signalet i billedet. Det er bedst at kombinere den kvantitative billedanalyse med objektive målinger. For eksempel, hvis du er interesseret i stoffet koncentrationer, fjerne tumor væv fra vinduet efter intravital mikroskopi og bestemme stof indhold ved hjælp af med HPLC for at sammenligne med de Konfokal billeder.
Evaluering af tumor respons kan udføres som godt ved hjælp af denne model, men med nogle forholdsregler. Man må indse, at tumorer også vokse indad, ind i huden. 3D-målinger kan foretages, hvis penetration er dyb nok til at dække hele tumoren. I så fald bør far-red farvestoffer anvendes. Vinduet kammeret som beskrevet her tilbud med tumorer i hud omgivelser, og det er vigtigt at påpege, at vinduet opretholder en temperatur lidt lavere end kropstemperatur normale mus. Det er derfor bedst at studere tumorer i lige mikro miljømæssige omgivelser til at bekræfte intravital undersøgelser med den dorsale skinfold vindue kammer. Vigtigere er, den dorsale skinfold kammer giver indblik i kinetik af processer og mekanismer, giver en instrumental grundlag for forbedring af terapi. Også kan indhentes ekstra oplysninger om biodistribution og farmakokinetik. Klassisk, udføres disse biodistribution undersøgelser af behandling af tumor-bærende dyr og dissekere tumorer/organer for at måle stof optagelse. Ved hjælp af denne intravital model kan intratumoral placeringen af et lægemiddel (dvs. intravaskulær, intratumoral, intracellulære eller nukleare) gives5,25,26. Ikke kun er placeringen af stoffet afsløret, men også den tid vindue-af-mulighed for den mest optimale optagelse.
Ved hjælp af eksperimentelle design, der er beskrevet i denne artikel, kan en lang række parametre evalueres i tidsmæssige og rumlige omgivelser. Specifikt, viser her vi, at intravital mikroskopi giver vigtig indsigt i dynamikken i tumor fartøj udvikling og terapeutisk respons.

Mens in vitro- undersøgelser aktiverer høj opløsning kinetic imaging processer, giver in vitro- eksperimenter ikke evalueringen i den rette sammenhæng. For eksempel ikke kan samspillet mellem tumorceller og stromale rum eller medicinafgivelse og distribution inde en tumor undersøges i en kultur plade. Dyremodeller er derfor bruges til at efterligne den menneskelige fysiologi og patologi. Men den langsgående imaging processer, især på en subcellulært opløsning, er udfordrende. Molekylær billeddannelse metoder, såsom magnetisk resonans imaging (MR), single photon emission beregnet tomografi (SPECT) og positron emission tomografi (PET), har gode penetration dybder men manglende opløsning eller undlader at illustrere anatomiske strukturer. Optiske billeddannelse giver høj opløsning og gør det muligt for billeddannelse af strukturer, men det er ledsaget af fattige til minimal penetration1. Anvendelsen af intravital mikroskopi i kombination med vindue kammer teknologier, såsom en dorsal skinfold eller abdominal vindue, giver mulighed for høj opløsning billedbehandling i vivo2,3,4. Denne teknologi har klare fordele, da det giver mulighed for langsgående imaging over timer og endda dage for billeddannelse af processer i den rette sammenhæng (f.eks. celle-celle interaktioner i de afbildede væv) og for beslutninger på de optiske begrænsninger af Avanceret Konfokal og multiphoton mikroskoper.
Indførelsen af transgene dyr med celle - eller protein-specifikke fluorescerende etiketter åbner et væld af muligheder for i vivo og ex vivo eksperimenter. For forekomst, celle-celle interaktioner, produktionen af proteiner og reaktion på manipulation eller terapi kan studeres modeller i vivo ved hjælp af disse5,6,7,8. Vigtigere, position i tid og sted kan bestemmes med de rette imaging udstyr og metoder. Her, den intravital mikroskopi af dyr at udtrykke en endotel markør i kombination med injicerbar agenter i en tumor implanteret i en modificeret dorsale skinfold vindue kammer er præsenteret.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1145</td>
			<td>Supplemented with 10% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-versene (EDTA)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161E</td>
			<td>Make a 0.1% solution in PBS, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window frames</td>
			<td>Costum made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filler glass 10 mm, 0.55 mm</td>
			<td>Abrisia technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass 12mm, #1 thickness</td>
			<td>Thermo Scientific/VWR</td>
			<td>631-0713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hear removal gel (veet)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for sensitive skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorfine hydrochloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>use 0.05 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia unit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green</td>
			<td>BD</td>
			<td>324824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 23G 1 1/4&#34;</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 25G 5/8&#34;</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures silkan 0.7</td>
			<td>Braun</td>
			<td>1134019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuts</td>
			<td>Jeveka</td>
			<td>934 A2 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolts</td>
			<td>Jeveka</td>
			<td>84 A2 1 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope + software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated temperature controlled platform</td>
			<td>Costum made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window holder</td>
			<td>Costum made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D7139</td>
			<td>100 &#181;g/mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D22914</td>
			<td>100 &#181;g/mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>25 &#181;g/mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pegulated nanoparticles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ref 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS AF Software</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice

Tumor og tumor fartøj udvikling såvel som tumor respons til therapeutics, er yderst dynamisk biologiske processer. Histologi giver statiske oplysninger og er ofte ikke tilstrækkelige til en korrekt fortolkning. Intravital evaluering, hvor en proces er fulgt i gang, giver ekstra og ofte uventede oplysninger. Med oprettelsen af transgene dyr udtrykker celle-specifikke markører og levende celle røbestoffer, forbedringer til imaging udstyr og udvikling af flere billeddiagnostiske afdelinger, er intravital mikroskopi blevet et vigtigt værktøj til bedre at forstå biologiske processer. Dette papir beskriver en eksperimenterende design for undersøgelsen af tumor fartøj udvikling og terapeutiske virkninger på en måde, rumlige og tidsmæssige. Bruger denne opsætning, kan fase af fartøjet udvikling, tip celle og lumen dannelse, blodgennemstrømning, ekstravasation, etablerede vaskulære seng og vaskulære ødelæggelse visualiseres og fulgt. Derudover kan terapeutiske virkninger, intratumoral skæbne og lokalisering af kemoterapeutiske stoffer også følges.

Den vigtigste egenskab ved intravital imaging er de langsgående visualisering af cellulære processer uden invasive indgreb. Hertil bruges transgene dyr udtrykker en konstitutiv eller inducerbar fluorescerende markør i celler af interesse. Figur 2 illustrerer udtryk for fluorescerende etiketter i eNOStag-grøn fluorescerende proteiner (NGL)9 og Rosa-mTmG mus linjer10. ENOStag-normal god landbrugspraksis er en mus-linje, der blev produceret in-house bruger en afkortet Enosh genet som et mærke for normal god landbrugspraksis. Vigtigere, Enosh er stærkt udtrykt i endothelial celler, og normal god landbrugspraksis signalet er tydeligt ses i th eGolgi og cellulære membran (figur 2A). Rosa-mTmG mus har en membran-målrettet tofarvede fluorescens Cre reporter allel. Denne linie udtrykker mTomato fluorescens i udbredt celler og mGFP i Cre recombinase-udtrykker celler og bruges langt for afstamning sporingen. Som en tumor stykke er transplanteret fra en ikke-transgene donor, røde fluorescens overvejende er udtrykt ved stromale dele i tumor (f.eks. i membranen af vaskulære celler, cirkulerende celler, infiltreret blodlegemer, og tumor-associerede fibroblaster (figur 2B)).
Fartoej formation er stramt reguleret, og en fremragende model til at studere dette er den tredje nethinden12,13. Fartøj tumorvækst er også en kinetisk proces, der svarer i princippet til retinal fartøj udvikling. Men tumor fartøjer mangler organisation, og som en tumor løbende remodeling, så er den tumor-associerede Vaskulaturen. Dette kan have sine fordele, når du bruger tumor som angiogene forbillede, som alle fartøj udviklingstrin kan ofte findes i den samme svulst på samme tid. Disse omfatter en endotel spirende front vokser ind i en un-vaskulariserede del af tumor (figur 2 c); beskadigede fartøjer (figur 2D); og en etableret vaskulære seng (figur 2E-jeg) med modne, forgrenet fartøjer (Figur 2E-II). Angiogene endotelceller findes dog også på disse områder. Når stimuleret af angiogene stimuli, en endotel celle stikker filopodia (Figur 2E-III) og kan rykke ind i en spids celle, bruge disse filopodia til scanning og retningsbestemt migration (Figur 2E-IV). Dette tip celle vandrer ind i tumor-interstitium og efterfølges af dividere stilk celler. En enkelt endotel tip celle har flere filopodia udvidelse, tilbagetrækningskraften og fornyelse på ethvert tidspunkt, og kan spores ved hjælp af intravital mikroskopi (figur 2F).
For det andet, intravital mikroskopi kan bruges til at bestemme lumen dannelse på en angiogene front, blodgennemstrømningen i hele tumor, og ekstravasation. Afhængigt af allerede-nuværende iboende fluorescerende signaler i dyret, kan forskellige fluorescerende stoffer administreres. Blodgennemstrømning og ekstravasation kan visualiseres ved hjælp af Hoechst, fluorescerende dextrans eller FITC-BSA. For udvidet undersøgelser på blod flow og partikel ekstravasation, omløb fluorescently mærket pegyleret nanopartikler af 100 nm kan bruges. For detaljer om forberedelsen af disse nanopartikler, se en tidligere publikation5. Ansættelse af disse forbindelser er vist i figur 3. Endotel tip celler i en Rosa-mTmG mus kan ses tydeligt, invaderer tumor væv. Funktionelle blodgennemstrømningen er påvist ved den lilla fluorescens af systemisk injiceres nanopartikler i lumen af vaskulære rør (figur 3A-jeg). Nanopartikler nå tæt endotel tip celler illustrerer dannelsen af en lumen i området stilk celle (Figur 3A-II). Levering af systemisk administreret kemoterapeutika afhænger en funktionel Vaskulaturen for at nå tumor interstitium, og som vist i figur 3B, injicerbare agenter, uafhængigt af deres størrelse, trænge ikke områder med ødelagte fartøjer, komprimeret fartøjer eller fartøjer med blod stasis.
I de fleste organer, endotel foring danner en funktionel barriere mellem blod og underliggende væv og passage af molekylerne er stramt reguleret. Tumor-associerede Vaskulaturen, dog er kendt for at være utæt, og pore-størrelse cut-off afhænger i høj grad på tumor type14. Lysstofrør-konjugeret dextrans med forskellige størrelser kan sprøjtes for at vurdere blodgennemstrømning, permeabilitet og ekstravasation. Hoechst (615 Da) diffunderer hurtigt ind i tumor væv og er taget op af omkringliggende celler (figur 3 c-jeg). Kort efter injektionen, dextran 10 KDa (figur 3CII) og 2 MDa (Figur 3 C-III) der findes i blodet. Imidlertid tilskrives dextran 10 KDa ses også i tumor interstitium, der angiver permeabilitet af endotel foring for mindre molekyler, som er en funktion, tumor fartøjer. 40 min efter injektion (Figur 3 C-IV), dextran 10 KDa er fjernet fra blodet (Figur 3 C-V) og fluorescerende intensiteten af dextran 2MDa er faldet så godt (Figur 3 C-VI). Store dextrans findes ikke i tumor interstitium, demonstrerer manglende permeabilitet til store molekyler inden for denne tidsramme.
Tumor Patofysiologi, med sin meget prolifererende, nekrotisk, og un-vaskulariserede områder, kan være ganske informativ, når ved hjælp af tumor som en angiogene forbillede. Dog, dette udgør et problem for effektiv behandling og undersøgelse. Heterogenitet af tumor-associerede Vaskulaturen forårsager en heterogen fordeling af administreret medicin, forlader hele områder stoffri15. For at forbedre drug delivery, flere strategier kan være anvendt15,16,17, og terapeutiske progression kan undersøges ved hjælp af denne intravital design. Tumor-associerede Vaskulaturen kan manipuleres ved hjælp af vasoaktive stoffer til at forbedre drug delivery17. Resultaterne af tumor fartøj manipulation ved hjælp af tumor nekrose alpha (TNF) som en vasoaktive agent i kombination med Doxil, den indkapslede liposomal formulering af doxorubicin, som en kemoterapeutiske agent præsenteres i dette manuskript5, 18 , 19. i modsætning til dextrans, pegyleret nanopartikler er lavet til at cirkulere i flere timer, hvis ikke dage, i blod omløb20.
Som tidligere nævnt, kan området tumor være pre scannet til at identificere de korrekte tumor områder alt efter forskningsspørgsmål. Drug skæbne kan evalueres i områder med en funktionel Vaskulaturen versus områder med en allerede beskadiget vaskulære seng (data ikke vist). For at undersøge skæbnen af kemoterapeutiske stoffer uden cytotoksisk indblanding, nanopartikler med samme sammensætning som de terapeutiske agent kan bruges som en model stof. Et eNOStag-NGL dyr blev behandlet i.v. med disse nanopartikler og afbildet 24 timer senere. Nanopartikler var stadig til stede i Vaskulaturen, med minimal ekstravasation i tumor interstitium (figur 4A-jeg). Men når nanopartikler blev administreret i kombination med TNF, ekstravasation blev observeret fra blodet ind i tumor interstitium (Figur 4A-II), øge intratumoral drug delivery. Ved hjælp af høj opløsning målet linser, kan de intracellulære lokalisering af et stof, der genkendes, som vist her i den nukleare placering af Hoechst i grøn endothelial celler og celler i tumor interstitium (figur 4B). Desuden, som mange kemoterapeutiske stoffer som doxorubicin, intercalate med DNA, lokalisering af disse forbindelser kan evalueres. Doxorubicin har rødt fluorescerende egenskaber, og nanocarrier kan være mærket med, for eksempel, tetramethylindotricarbocyanine perchlorat (gjorde). Dyrets eNOStag-normal god landbrugspraksis var injiceres i.v. med Doxil-har i kombination med TNF, og billeder blev taget 24 timer efter behandling. Doxil-behovet ud af blodkarrene og blev taget op af omkringliggende tumor væv (figur 4 c-jeg). En mere detaljeret vurdering af individuelle celler (Figur 4 C-II) viste, at luftfartsselskabet kan findes i cytoplasma, mens frigivne doxorubicin blev observeret i den cellulære kerne.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55115/55115fig1.jpg"> Figur 1: instrumenter, dorsale skinfold kammer, og opsætning af udstyr er nødvendige for proceduren. (A) Tumor fragmenter (en) og kirurgiske instrumenter skal bruges til implantation. Ikke-standard betalingsnumre instrumenter er en øre puncher (b), en micro skruetrækker (c) og en bøjet nål (d). (B) dorsale skinfold vindue kammer. For (a) og bag (b) vindue (pil: huller til suturer; pilespids: huller til bolte), 2 bolte (c), 2 nødder (d), 1 fyldstof glas (e), 2 cover briller (f) og 2 bevarer ringe (g). Bevarer ringe uden kroge (hvid pilespids) kan også bruges når det er påkrævet. (C) Custom-made kammer indehaveren (A), bolte til den afdeling til afdeling indehaveren (b), temperatur-kontrollerede platform (c), bolte til at sikre indehaveren af salen til den platform (d), og holderen med anæstesi tube (e). (D) dyr monteret i salen holder på platformen. En B16BL6 tumor (pil) er synlig i vinduet Vis område. (E) udstyr til brug ved den intravital evaluering. Computer med billedbehandling og mikroskop kontrol software (a), standard fluorescerende lys (b), og mikroskop. En multiphoton Konfokal blev brugt (c) med en anæstesi enhed (d). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55115/55115fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55115/55115fig2.jpg"> Figur 2: iboende fluorescens af transgene dyr. Alle billeder vist her er Z-stakken fremskrivninger mellem 50 og 70 µm tykt. (A) eNOSGFP-tag-linje, normal god landbrugspraksis er udtrykt i Golgi (asterisk) og cellemembranen (pil) i endothelial celler. Skalalinjen = 100 µm. (B) Intratumoral udtryk for mTomato i Rosa-mTmG linje er overvejende findes i cellemembranen af vaskulære celler (pil) og blodlegemer (stjerne). Skalalinjen = 100 µm. (C) A projektion af en voksende angiogene front i un-vaskulariserede tumor. Skalalinjen = 100 µm. (D) A projektion af en del af tumor med etablerede og beskadigede fartøjer (stjerne). (E) en projektion af etablerede tumor Vaskulaturen (EI) viser ældre krydse fartøjer (EII); angiogene endotel tip celler med filopodia (EIII, pilespids); og en ældre fartøj, hvorfra en enkelt endotel celle strækker sig en filopodium (EIV, pilespids) ind i interstitium. Skalalinjen = 100 µm. (F) bevægelse af filopodia, fulgte til 1 h. Hver 15 min, blev en Z-stak taget; en maksimal projektion præsenteres her. Filopodia udvider (hvid pil), stagnerende (=), tilbagetrækningskraften (rød pil), eller endog helt forsvinder (-). Skalalinjen = 25 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55115/55115fig2large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/55115/55115fig3.jpg"> Figur 3: forvaltningen af injicerbar etiketter til at illustrere ekstravasation og blodgennemstrømning. (A) A Rosa mTmG mus blev sprøjtet med lilla fluorescerende nanopartikler, og en Z-stak en invaderende tip celle front blev taget 10 min senere (AI). En fremskrivning viser, at de fleste endotel spirer har en funktionel lumen (AII, pil). Kun sjældent ses endotel spirer uden flow (AII, pilespids). Skalalinjen = 250 µm. (B) denne Z-stakken fremskrivning viser en ødelagt tumor fartøj område i et eNOStag-NGL dyr før behandling (BI). Dyret blev sprøjtet med nanopartikler (lilla, BII) og Hoechst (blå, BIII). Nanopartikler og Hoechst når ikke ødelagte områder, anført af granuleret celle debris stadig udtryk for normal god landbrugspraksis. Skalalinjen = 250 µm. (C) en eNOStag-NGL mus blev sprøjtet med to dextrans i forskellige størrelser (rød = Dextran 2 MDa; lilla = dextran 10 KDa) og Hoechst (blå = 615 Da), og single-plane billeder præsenteres her. 10 min efter injektion, tilstedeværelse i blod og ekstravasation ses i samme billede. Hoechst extravasates næsten straks ud af blodkarrene og tages op af de omkringliggende celler (CI). Dextran 10 KDa (CII) kan ses i fartøjer og i tumor interstitium. Dextran 2 MDa (CIII) kan findes i fartøjer. 40 min efter injektion (CIV), Dextran 10 KDa forsvinder fra blodet (CV), og fluorescerende intensiteten af Dextran 2 MDa blev også formindsket (CVI). Skalalinjen = 100 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55115/55115fig3large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/55115/55115fig4.jpg"> Figur 4: undersøge skæbnen af kemoterapeutika. (A) eNOStag-NGL dyr blev behandlet i.v. med nanopartikler og afbildet 24 timer senere. Nanopartikler er stadig til stede i fartøjer, med minimal ekstravasation i tumor interstitium (AI). Når nanopartikler er kombineret med TNF, observeret ekstravasation fra blodet ind i tumor interstitium (AII). Skalalinjen = 250 µm. (B) ved hjælp af høj opløsning linser, endotel cytoplasma (grøn) og kernen (blå) i en enkelt celle kan genkendes. Skalalinjen = 50 µm. (C) eNOStag-NGL dyr var injiceres i.v. med Doxil-har i kombination med TNF, og billeder blev taget 24 timer senere. Her, ekstravasation af Doxil-gjorde ud af fartøjer i tumor interstitium er indlysende (CI). En mere detaljeret vurdering af individuelle celler (CII) viser, at den lilla luftfartsselskab kan findes i cytoplasma (pil), mens den frigivne doxorubicin (rød) er observeret i den cellulære kerne (pilespids). Skalalinjen = 50 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55115/55115fig4large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice at JoVE.com

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Denne protokol beskriver den intravital billeddannelse af Transgene mus udtryk for celle-specifikke fluorescerende markører. Intravital imaging indeholder en ikke-invasiv metode til høj opløsning observationer hos levende dyr brug af implantabelt windows hvorigennem den mikroskopiske visualisering af processer er muligt. Denne metode er især nyttig til at studere langsgående processer.

Intravital mikroskopi af Tumor-associerede Vaskulaturen ved hjælp af avancerede dorsale Skinfold vindue kamre på transgene fluorescerende mus

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kvantificering Glomerular fyldbarhed Fluorescent Macromolecules Brug 2-Photon mikroskopi i München Wistarrotter

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Intravital Video Mikroskopi Målinger af Retinal blodgennemstrømningen i Mus

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Construction of Vapor Chambers Used to Expose Mice to Alcohol During the Equivalent of all Three Trimesters of Human Development

Konstruktion af Vapor Chambers Bruges til Expose Mus til alkohol i Equivalent af alle tre trimestre af Human Development

Exposure to alcohol during development can result in a constellation of morphological and behavioral abnormalities that are collectively known as Fetal ...

Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia

Iskæmisk væv skade i Dorsal hudfolden Afdeling Mus: En hudlap modellen til Akut Persistent Iskæmi

Despite profound expertise and advanced surgical techniques, ischemia-induced complications ranging from wound breakdown to extensive tissue necrosis are ...

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

Måling Stigende Aorta Stivhed<em&gt; In Vivo</em&gt; I mus ved hjælp af ultralyd

We present a protocol for measuring in vivo aortic stiffness in mice using high-resolution ultrasound imaging. Aortic diameter is measured by ultrasound ...

Exergaming in Older People Living with HIV Improves Balance, Mobility and Ameliorates Some Aspects of Frailty

Exergaming i ældre mennesker med hiv Forbedrer Balance, mobilitet og forbedrer nogle aspekter af skrøbelighed

Approximately 1.2 million people in the United States live with HIV infection. Medical advancements have increased the life expectancy and this cohort is ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Intravital mikroskopi og thrombus Induktion i øreflippen af ​​en hårløs mus

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Avanceret billedbehandling af lunge Homing humane lymfocytter i en eksperimenterende i Vivo Model af allergisk betændelse baseret på lys-ark mikroskopi

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Kvantitativ analyse af cellulære sammensætning i avancerede aterosklerotiske læsioner af glat muskel celle afstamning sporingen mus

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Scratch migration assay og dorsale Skinfold kammer for in vitro og in vivo analyse af sårheling

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...