Name: intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice
Uploaded: 2018-01-19T12:30:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice at JoVE.com

我々 は開発の eNOSTag GFP ライン、Joost 兼 Ren の動物の仕事と彼のテクニカル サポートおよび彼らの助けのための動物の介護の寄付なし・ ヴァン ・ Haperen、リニ ・ デ ・ Crom を感謝したいです。顕微鏡施設エラスムス光イメージング センターの一部であるし、我々 は彼らのサービスの OIC のスタッフに感謝したいと思います。この研究はオランダのがん学会、「Vereniging Trustfonds」エラスムス大学ロッテルダム、"スティヒティング エラスムス Heelkundig Kankeronderzoek"から DDHK 2000-2224 の助成金によって支えられた、我々 は彼らの寛大な寄付のための委員会メンバーに感謝。

<ol>
	<li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17, 545-580 (2003).</li><li>Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+hallmarks+of+cancer+in+living+mice.">Imaging hallmarks of cancer in living mice.</a> Nat Rev Cancer. 14, 406-418 (2014).</li><li>Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+tumors.">In vivo imaging of tumors.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), (2010).</li><li>Palmer, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+optical+molecular+imaging+and+analysis+in+mice+using+dorsal+window+chamber+models+applied+to+hypoxia,+vasculature+and+fluorescent+reporters.">In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent reporters.</a> Nat. Protocols. 6, 1355-1366 (2011).</li><li>Seynhaeve, A. 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D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Manzoor, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+limitations+in+nanoparticle+drug+delivery:+triggered,+intravascular+release+to+improve+drug+penetration+into+tumors.">Overcoming limitations in nanoparticle drug delivery: triggered, intravascular release to improve drug penetration into tumors.</a> Cancer Res. 72, 5566-5575 (2012).</li><li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+transport+pathways+in+tumor+vessels:+role+of+tumor+type+and+microenvironment.">Regulation of transport pathways in tumor vessels: role of tumor type and microenvironment.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4607-4612 (1998).</li><li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumours.">Drug penetration in solid tumours.</a> Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).</li><li>Koning, G. A., Eggermont, A. M., Lindner, L. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF+and+manipulation+of+the+tumor+cell-stromal+interface:+&amp;#34;ways+to+make+chemotherapy+effective&amp;#34;.">TNF and manipulation of the tumor cell-stromal interface: &amp;#34;ways to make chemotherapy effective&amp;#34;.</a> Front Biosci. 13, 3034-3045 (2008).</li><li>Brouckaert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha+augmented+tumor+response+in+B16BL6+melanoma-bearing+mice+treated+with+stealth+liposomal+doxorubicin+(Doxil)+correlates+with+altered+Doxil+pharmacokinetics.">Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics.</a> Int J Cancer. 109, 442-448 (2004).</li><li>Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., ten Hagen, L. 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A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer.">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> J Vis Exp. , e50088 (2013).</li><li>van Vliet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MR+angiography+of+tumor-related+vasculature:+from+the+clinic+to+the+micro-environment.">MR angiography of tumor-related vasculature: from the clinic to the micro-environment.</a> Radiographics. 25, S85-S97 (2005).</li><li>Dicheva, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+thermosensitive+liposomes:+a+novel+dual+targeted+heat-triggered+drug+delivery+approach+for+endothelial+and+tumor+cells.">Cationic thermosensitive liposomes: a novel dual targeted heat-triggered drug delivery approach for endothelial and tumor cells.</a> Nano Lett. 13, 2324-2331 (2013).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+intratumoral+nanoparticle+extravasation+and+penetration+by+mild+hyperthermia.">Improved intratumoral nanoparticle extravasation and penetration by mild hyperthermia.</a> J Control Release. 167, 130-137 (2013).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

腫瘍治療効果と同様、腫瘍と腫瘍血管の開発は非常にダイナミックなプロセスであると生体評価は時間と空間依存的にこれらのプロセスの正しい評価をするための洗練されたツールです。生細胞マーカー、トランスジェニック動物の作成と画像診断法の進歩の増加する供給、生体イメージングは、ますます人気になっています。組織がまだ日常的に使用されているし細胞や構造を識別するために使用できるマーカーの数多く、ティッシュが不利な点ダイナミックなプロセスを調査するとき。組織の郭清が必要、静的な情報のみを提供します。固定組織の品質に影響を与える細胞間相互作用を損なうスライスします。また、ダイナミックなプロセスを調査するとき異なっているとしばしば推定時点で組織郭清動物の大規模な量が必要です。生体イメージングと XYZ 空間次元や時間の余分な次元を作る別の選手の適切な位置決め可能な空間と時間、同じ動物で評価できます。したがって、最適な時間ポイントが逃されない、実験ごとに使用される動物の数を大幅に削減します。第二に、組織抽出を最適化するために生体の評価と確立期間を推定できます。第三に、容器の成長の目的の段階を intravitally 識別して全体マウント組織としてステンド グラスします。
本稿に記載されている生体の設計は、皮下脂肪の溜まりモデルと専用の多光子共焦点顕微鏡背血管内皮細胞、変更された蛍光ラベルを表現するトランスジェニック動物の組み合わせを使用します。
血管内皮細胞は、血管新生中、ステージ21,22の数を通過し、腫瘍のこれらの段階が同時に見る多くの場合ことができます。ENOSTag GFP マウスの線を使用して、個々 の内皮細胞は続くことができるとも糸状のダイナミクスをたどることができます。したがって、intravitally 容器開発を勉強する良いモデルです。既に現在の固有のラベルによって注射蛍光剤は、管腔形成、血流、血管外漏出、および血のクリアランスを評価するために使えます。マウスは 5 h まで継続的に視覚化されます。動物の長期的な評価が可能な動物の麻酔に関するいくつかの注意事項が取られるときで前述されている23。この研究は癌に焦点を当てて、腫瘍組織や細胞が移植されました。しかし、我々 はまた中足骨および萌芽期の肺を試しました。ただし、調査の下で組織の成長速度は制限、肌が再生するを開始する数週間後、成長の遅い腫瘍または組織に問題になることができます。
検証フェーズでは、背の皮下脂肪ウィンドウ商工会議所が大幅に変更された古典的なモデル4と比較。フレームはオートクレーブ合成材料の組み立てられる、光と小さく、大規模なウィンドウ-表示領域で。(図 1Bg、白矢印) 止め輪のフックは、リングを簡単に除去の使用だけです。フックなしリテーナー リングは、これらのイメージングと干渉するときに使用できます。皮膚があまり伸長しないゆるみ、このモデルでは発生しませんし、感染症はまれにしか見られます。これらの変更は動物の不快感を軽減し、動物のプロシージャを大幅に絞り込みます。また、MRI24を使用して腫瘍をイメージングするときは、金属部品は簡単に削除できます。
Intravitally イメージの背に顕微鏡を採用できる皮下脂肪の部屋。主な要件は、顕微鏡ステージと対物レンズの間利用可能なスペースです。画像に影響を与える重要な側面は、運動です。動きの人工物を防ぐためには、(すべての挿入の除去) 後顕微鏡テーブルにフィットし、マウスをサポートするプラットフォームを使用してください。麻酔下では、マウスの呼吸を自由にできるように優れているときマウスを抑制する必要はありません。ただし、ウィンドウはビューのフィールドの最適な固定を与えるプラットフォーム上にボルトで固定 (すなわち腫瘍がウィンドウ チャンバーを介して表示されます)。家畜暖房用電子加熱パッドを使用してプラットフォームを加熱します。このプラットフォームは社内でつくられ、リクエストの詳細を得ることができます。高分解能対物レンズは不可欠な細胞内プロセスを評価するとき、細胞質と核の間で区別することが可能になります。優れた光学分解能 (高 NA) しかし、比較的長いテーパー レンズの使用作動距離 (できれば 2 mm 以上) をお勧めします。溶込み深さおよびラベルの蛍光イメージングの制限です。さらに、退色、光毒性、および彩度は、イメージ投射の間避けなければなりません。
ここでは、統合された共焦点多光子と共焦点顕微鏡は使用されました。多光子は直立、共焦点は倒立顕微鏡です。正立型顕微鏡の利点は、水浸漬レンズの使いです。これらのレンズがある高 NA と長作動距離、(例えば、 20 または 40 倍) の高倍率でも。具体的には、いくつかの企業が販売されている、20 の X NA 1.0 水浸漬レンズを取得することをお勧めします。浸漬のレンズを使用すると、対物レンズと浸漬液が 37 ° C まで加熱する必要ということに注意してください。最高の画像は勧め最適な共焦点設定を使用する (すなわちピンホール 1 風通しの良いユニットでレーザー出力可能なゲイン高すぎない限り低く (特に利得には、ノイズが導入されています) 場合、回線速度最大、およびスキャンの平均で)。露出、彩度、およびイメージの強度の違いは、データの品質を妥協します。彩度、露出オーバーを防ぐためにそれをお勧めします。これは、異なるゲイン設定で画像を取得することによって回避できます。ゲインの変更は、画像の明るさを変更する最も簡単な方法です。必要な場合は、レーザー パワーを調整できます。画像の品質を標準化するには、固定の蛍光強度を持つスライドを使用できます。顕微鏡が最適な状態に設定されている場合でも画質がウィンドウ商工会議所と組織の品質によってのかなりの程度まで決定は念頭にしておかなければなりません。
複数の蛍光マーカーを同時にスキャンするとき裁ち落としを通じて、もう 1 つのチャネルで 1 つの蛍光体が検出されたを避けなければなりません。裁ち落としを通じて最小重複スペクトルと蛍光物質の組み合わせを使用して、シーケンシャル スキャン フレーム間は避けてください。紹介画像は 3 連続したスキャンを使用してスキャンされた (トラック 1: GFP、DID や 488 と 633 レーザー; fluor647 トラック 2: 543 レーザー; mTomato や Doxil、ローダミン トラック 3 と: 405 レーザー ヘキスト)。
腫瘍血管の開発や先端細胞ダイナミクス、管腔形成、血管外漏出、血管損傷のいくつかの段階を評価する可能性を示しています。ENOStag GFP ラインを使用して、破壊された血管床と腫瘍エリア簡単にまだ gfp 粒状の細胞残り物によって検出されます。注射剤は見つかりませんでした、これらの分野の流れの欠如を示します。つまり、化学療法剤を投与では、これらの領域をどちらか届きません。ただし、容器破壊には治療の結果することができます。前処理容器破壊をチェックするため、腫瘍の前評価は、正確な治療評価のための前提条件で、この実験的なデザインを使用して簡単に実行できます。
生体顕微鏡を使える可能性の茄多があるし、詳細な議論はこの文書の範囲を超えています。可能なアプリケーションには簡単な洞察力を与えるためには、腫瘍組織の血管 (例えば船舶、分岐や交差の数) と血流、細胞間相互作用の開発化学療法の蓄積に関する研究が含まれますターゲットし細胞内処理と上記のここに示されている例をセルします。分析は、蛍光に基づいている、ウィンドウまたは組織の品質による強度変動の注意してください。また、腫瘍組織は比較的厚く、上下ビューの平面からの蛍光は画像の信号に影響を及ぼします。客観的な測定と定量画像解析法を結合することをお勧めします。例えば、薬物濃度に興味がある、生体顕微鏡観察後ウィンドウから腫瘍を削除してコンテンツ高速液体クロマトグラフィーを用いた共焦点の画像と比較するための薬剤を調べます。
まあこのモデルを使用して、いくつかの注意事項と、腫瘍の反応の評価を実行できます。1 つは、腫瘍が皮膚にで、内側も成長することを実現する必要があります。普及率は全体の腫瘍をカバーするために十分に深い場合、3 D 計測が可能です。このような場合、遠赤色染料を使用してください。としてウィンドウ チャンバーは肌環境の腫瘍にお得な情報をここで説明し、指摘するウィンドウが通常のマウスの体温よりも若干低い温度を維持することが重要です。そのため、皮下脂肪のウィンドウの商工会議所、背と生体研究を確認する右マイクロ環境設定で腫瘍を勉強することをお勧めします。重要なは、背側皮下脂肪室プロセスおよび療法の改善のため機器の基礎を提供するメカニズムの動力学への洞察力。また、体内分布および薬物動態に関する追加情報を取得できます。従来、これらの体内研究は担腫瘍動物の治療と薬剤の吸収を測定する腫瘍/臓器の解剖によって実行されます。この生体モデルを使用して (すなわち、血管内、腫瘍、細胞内、または核) 薬の腫瘍の場所が5,25,26提供できます。だけでなくは、明らかにされるも、時間ウィンドウ--機会の最適な吸収のため薬の場所です。
この資料に記載されている実験的なデザインを使用して、広範なパラメーターを時空設定で評価できます。具体的には、ここでその生体顕微鏡による腫瘍血管の開発と治療反応の動態に重要な洞察を提供していますを紹介します。

生体外で研究プロセスの高分解能運動イメージングを使用すると、生体外で実験は適切なコンテキストで評価を許可されません。例えば、培養プレートで管間質コンパートメントまたは薬剤配達および腫瘍内の分布と腫瘍細胞の相互作用を検討することはできません。動物モデルは人間生理学および病理学を模倣するため。ただし、プロセス、特に細胞内の解像度の縦画像です挑戦。分子イメージング法、磁気共鳴画像 (MRI) など単一光子放射または計算された断層レントゲン写真撮影 (SPECT)、陽電子放出断層レントゲン写真撮影 (ペット)、解像度不足が良い浸透深さがある解剖学的構造を説明するために失敗します。高解像度を提供し、構造のイメージングを可能に光イメージングが、最小限の浸透1に貧しい人々 を伴っています。アプリケーション ウィンドウとの組み合わせで生体顕微鏡の皮脂、背などの技術の部屋または腹部のウィンドウは、高解像度イメージング、生体2,3,4。この技術は、(例えば細胞間相互作用イメージのティッシュで)、適切なコンテキストでプロセスの画像、解像度の光学的限界で時間と数日、上縦画像のこと明確な利点高度な共焦点と多光子顕微鏡。
細胞やタンパク質特異蛍光ラベルとトランスジェニック動物の導入は、体内と体外の実験のための可能性の茄多を開きます。インスタンス、細胞間相互作用、蛋白質の生産および操作または療法への応答を検討することができるため体内のこれらを使用してモデル5,6,7,8.重要なは、配置場所と時間を適切なイメージ投射装置および方法論を決定ことができます。ここでは、生体顕微鏡変更されるの移植腫瘍における注射剤との組み合わせで内皮マーカーを表現する動物の背側皮下脂肪ウィンドウ商工会議所が発表します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1145</td>
			<td>Supplemented with 10% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-versene (EDTA)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161E</td>
			<td>Make a 0.1% solution in PBS, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window frames</td>
			<td>Costum made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filler glass 10 mm, 0.55 mm</td>
			<td>Abrisia technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass 12mm, #1 thickness</td>
			<td>Thermo Scientific/VWR</td>
			<td>631-0713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hear removal gel (veet)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for sensitive skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorfine hydrochloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>use 0.05 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia unit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green</td>
			<td>BD</td>
			<td>324824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 23G 1 1/4&#34;</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 25G 5/8&#34;</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures silkan 0.7</td>
			<td>Braun</td>
			<td>1134019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuts</td>
			<td>Jeveka</td>
			<td>934 A2 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolts</td>
			<td>Jeveka</td>
			<td>84 A2 1 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope + software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated temperature controlled platform</td>
			<td>Costum made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window holder</td>
			<td>Costum made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D7139</td>
			<td>100 &#181;g/mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D22914</td>
			<td>100 &#181;g/mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>25 &#181;g/mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pegulated nanoparticles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ref 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS AF Software</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice

腫瘍および腫瘍容器開発、腫瘍に対する治療は、非常にダイナミックな生物学的プロセスです。組織では、静的な情報提供し、正しい解釈のために十分ではない多くの場合。生体評価、プロセス、時間、続いては、余分なと多くの場合予期しない情報を提供します。いくつかの画像処理室の開発映像装置への改善と生細胞トレーサー細胞特異的マーカーを表現するトランスジェニック動物の作成、生体顕微鏡をよりよく理解する重要なツールとなっています。生物学的プロセス。時空的に腫瘍血管の開発と治療効果の調査のための実験計画について述べる.このセットアップを使用して、容器開発、先端の細胞と内腔形成、血流、血管外漏出、確立された血管床、血管破壊の段階することができます可視化し、続きます。さらに、治療効果、腫瘍の運命、そして劑のローカライズも行われます。

生体イメージングの主要な属性は、侵襲的介入なしの細胞プロセスの縦方向の可視化です。これは、興味のセルの構成または誘導蛍光マーカーを発現するトランスジェニック動物が使用されます。図 2は、eNOStag 緑の蛍光蛋白質 (GFP)9とローザ mTmG マウス行10で蛍光ラベルの表現を示しています。ENOStag GFP は、GFP をタグとして切り捨てられた eNOS 遺伝子を利用して生産されたマウス ラインです。重要なは、血管内皮細胞の eNOS を高度に発現し、GFP シグナルは th eGolgi と細胞膜 (図 2 a) に示されています。ローザ mTmG マウス 2 色蛍光の膜をターゲットとした Cre 記者の対立遺伝子があります。この行は、広範な細胞 mTomato 蛍光と Cre リコンビナーゼ発現細胞の mGFP を表現し、トレースする血統の使用が大幅に。腫瘍部分は、非組み換えのドナーから移植は、赤い蛍光性主にによって表されます、腫瘍間質部分 (例えば、循環細胞、血管の細胞の膜に血液細胞を浸透し、腫瘍関連線維芽細胞 (図 2 b))。
血管の形成が堅く調整され、これを調査する優秀なモデルは発展途上の網膜12,13。また、腫瘍血管の成長は、網膜血管の開発の原則に近いキネティック プロセスです。しかし、腫瘍血管組織を欠いているし、腫瘍は改造継続的にので、腫瘍関連血管。その利点は、血管新生モデルとして腫瘍を使用する場合、容器開発のすべての段階は、同時に同じ腫瘍でしばしば見つけることが、これには持つことができます。これらが含まれます (図 2); 腫瘍の非血管部分に成長している内皮発芽前には壊れた血管 (図 2 D);確立された血管ベッド (図 2E-私) と成熟し、分岐血管 (図 2 e II)。ただし、血管内皮細胞は、これらの分野でまた見つけることが。血管新生刺激によって刺激され、血管内皮細胞は突出する糸状 (図 2 e III) とスキャンおよび方向の移行 (図 2 e-IV) のこれらの実験を使用して先端のセルに進むことができます。この先端のセルは腫瘍間質に移行し、茎細胞分裂が続きます。単一内皮先端セル、いくつか実験を拡大して、取り消し、随時更新と生体顕微鏡観察 (図 2 f) を使用して追跡することができます。
第二に、新生前部の管腔形成を決定、血液腫瘍、血管外漏出流れ生体顕微鏡を使用できます。既に現在、動物における内因性蛍光シグナル、に応じて異なる蛍光物質を管理できます。血流や血管外漏出は、ヘキスト、蛍光 dextrans または FITC BSA を使用して視覚化できます。血液の流れと粒子の漏出の拡張に関する長い循環が 100 の peg 化ナノ粒子を蛍光ラベル nm を使用ことができます。これらのナノ粒子の調製については、以前の文書5を参照してください。これらの化合物の雇用は、図 3に示されています。ローザ mTmG マウス内皮端細胞は腫瘍組織に侵入はっきり見ることができます。機能的な血流は血管の管の内腔で全身注入されたナノ粒子の紫の蛍光によって示されて (図 3A-私)。ナノ粒子は、茎セル領域 (図 3 a II) 腔の形成を示す血管内皮細胞を密接に達する。全身投与化学療法の配信によって異なります機能血管系腫瘍間質に達するために、図 3B に示すとおり、注射剤、自分のサイズの独立した破壊された血管領域に浸透しません。船を圧縮、または血液うっ滞船。
ほとんどの器官に内皮細胞膜が血と基になる組織の機能的なバリアを形成し、分子の通過が堅く調整されます。しかし、腫瘍関連血管は漏れに知られて、細孔径カットオフは、腫瘍の種類14に大きく依存します。サイズの異なる蛍光共役 dextrans を注入して、血流、透磁率、血管外漏出を評価することができます。ヘキスト (615 Da) 腫瘍組織に急速に拡散させるし、周囲の細胞によってとられる (図 3-私)。注入直後後の 10 KDa (図 3CII) と 2 MDa (図 3 C III) デキストランは血液で発見されます。ただし、10 KDa は、またより小さい分子の機能である内皮細胞膜の透過性を示す腫瘍間質で見られるデキストランは、腫瘍血管に生得的地位。40 分後注入 (図 3 C-IV) デキストラン 10 KDa が血流 (図 3 C V) とデキストラン 2MDa の蛍光強度からオフになって減少 (図 3 C VI) では同様。ただし、大規模な dextrans は、この時間枠の内で大きな分子の透過性の欠如を示す腫瘍の間質が見つかりません。
腫瘍病態、その高い増殖、壊死と非血管分野では血管新生モデルとして腫瘍を使用する場合に非常に有益できます。ただし、これは効果的な療法および調査のための問題を示します。腫瘍関連血管系の不均一性により、全体エリア薬物無料15を残して、投与薬の不均質分布です。ドラッグデリバリー システムを改善するために適用される15,16,17, をすることができますいくつかの戦略と治療の進行は、この生体の設計を使用して調べることができます。腫瘍関連血管は、血管作動物質を使用して薬物配信17を向上させる操作できます。Doxil との組み合わせで血管作動性のエージェントとして腫瘍壊死アルファ (TNF) を用いた腫瘍血管操作の結果、化学療法剤として、ドキソルビシンのカプセル化されたリポソーム製剤は原稿5,で表示されます。18,19. いくつか時間、そうでない場合に血液循環20日循環する dextrans と対照をなしてペグインターフェロン ナノ粒子が作られています。
前述したように、腫瘍領域は事前研究の質問に応じて正しい腫瘍領域を特定するスキャンすることができます。薬物の運命は、既に破損した血管床 (データは示されていない) と区域対機能血管分野で評価できます。細胞傷害性干渉することがなく抗癌剤の運命を調べるためには、治療上のエージェントと同じ組成を持つナノ粒子をモデル薬物として使用できます。ENOStag GFP 動物これらのナノ粒子に扱われた静脈、後 24 h をイメージします。ナノ粒子は腫瘍間質に最小限の血管外漏出と、血管内に存在していた (図 4 a-私)。しかし、ナノ粒子は、TNF との組み合わせで管理された、血管外漏出が増加腫瘍薬物送達腫瘍間質 (図 4 a II) に血流から観察されました。高分解能対物レンズを使用して、化合物の細胞内局在化することができます認識ヘキスト緑内皮細胞と腫瘍間質 (図 4 b) の細胞の核の位置によって次のよう。また、ドキソルビシンのような多くの化学療法薬は、DNA にインターカ レート、としてこれらの化合物の局在を評価できます。ドキソルビシン赤の蛍光特性があり、ナノキャリアが例えば、tetramethylindotricarbocyanine 過塩素酸塩 (でした) でラベル付けできます。ENOStag GFP 動物は Doxil を点滴を注射された-TNF との組み合わせでは、治療後 24 時間に撮影されました。Doxil-血管からバリウムしたしたし、取られた周囲の腫瘍組織を (図 4-私)。個々 の細胞 (図 4 C II) のより詳細な評価は、リリースされたドキソルビシンは細胞の核に認められた間質でキャリアを見つけることができることを示した。
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55115/55115fig1.jpg"> 図 1: 楽器、背側プロシージャに必要な皮下脂肪の商工会議所と機器のセットアップ。(A) 腫瘍片 (、)、注入に必要な手術器械。標準計測器が耳パンチャー (b)、(c) マイクロ スクリュー ドライバー、曲がった針 (d)。(B) 背皮下脂肪ウィンドウ商工会議所。表 (a) と (b) ウィンドウを裏 (矢印: 縫合の穴; 矢印: ボルト用の穴)、2 ボルト (c)、2 ナット (d)、1 充填ガラス (e)、2 カバー ・ メガネ (f)、および保持リング (g) 2。また、止め輪なしフック (白い矢印) を必要がある場合で使用できます。(C) 特注チャンバー ホルダー (a)、商工会議所・ チャンバー ホルダー (b)、ボルト温度制御プラットフォーム (c)、プラットフォーム (d)、商工会議所のホルダーを固定するボルトし、麻酔のホルダー チューブ (e)。(D) 動物はプラットフォームでチャンバー ホルダーにマウントされています。B16BL6 腫瘍 (矢印) は、ウィンドウの表示領域に表示されます。(E) 生体評価に必要な装置。イメージング顕微鏡制御ソフトウェア (a) 標準的な蛍光ライト (b) と、顕微鏡とコンピューター。多光子共焦点だった麻酔ユニット (d) と (c) を使用。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55115/55115fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55115/55115fig2.jpg"> 図 2: トランスジェニック動物の本質的な蛍光します。ここで示されているすべての画像は、50 〜 70 μ m 厚の間 Z スタック予測をされます。(A) eNOSGFP のタグラインで GFP はゴルジ (アスタリスク) と内皮細胞の細胞膜 (矢印) で表されます。スケールバー = 100 μ m。 (B) 腫瘍発現ローザ mTmG ラインの mTomato が血管細胞 (矢印) と (アスタリスク) の血液細胞の細胞膜で主に見られます。スケールバー = 100 μ m。 (C) A への投影成長血管前面の非血管腫瘍。スケールバー = 100 μ m。 (D) A (アスタリスク) 確立され、破損した血管と腫瘍の部分の投影。(確立された悪性腫瘍血管 (EI) 船舶 (EII); 成熟した目盛りを表示 E) の投影糸状 (EIII、矢印) と新生血管内皮細胞元単一内皮細胞拡張 (EIV、アローヘッド) filopodium 間に成熟した容器。スケールバー = 100 μ m、糸状の (F) 動き続いて 1 時間。15 分毎に、Z スタックを取られた;最大投影がここで表示されます。(白い矢印) を拡張している、糸状停滞 (=)、後退 (赤矢印)、または完全に消える (-)。スケール バー = 25 μ m.<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55115/55115fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/55115/55115fig3.jpg"> 図 3: 血管外漏出と血液の流れを説明するために投与注射ラベル。(A) A ローザ mTmG マウスは、紫の蛍光ナノ粒子を注入した、侵略の先端細胞前部の z は、10 分後 (AI) を取られました。最も血管内皮を示す投影もやし機能ルーメン (AII、矢印) があります。(AII、矢印) の流れのない、内皮もやしを稀だけ見ることができます。スケール バー = 250 μ m。 この Z スタック投影法 (B) 前処理 (BI) eNOStag GFP 動物に破壊された腫瘍血管領域を示しています。動物は、ナノ粒子 (紫、BII) とヘキスト (ブルー、BIII) 注入しました。ナノ粒子とヘキストは、顆粒細胞の残骸がまだ gfp によって示されている破壊された領域に到達しません。スケール バー = 250 μ m。 (C) eNOStag GFP マウスは、異なるサイズの 2 つの dextrans と注入された (赤 = デキストラン 2 MDa; 紫 = デキストラン 10 KDa) とヘキスト (青 = 615 ダ)、単一平面画像をご紹介し。注入後 10 分、血液や血管外漏出の存在は、同じイメージで見られています。ヘキストは血管からほとんどすぐに extravasates し、周囲の細胞 (CI) で取り上げられています。デキストラン 10 KDa (CII) は、血管と腫瘍間質で見ることができます。デキストラン 2 MDa (CIII) は、血管で見つけることができます。注射 (CIV) 後 40 分デキストラン 10 KDa が血 (CV) から消え、デキストラン 2 MDa の蛍光強度も低下 (CVI) だった。スケールバー = 100 μ m.<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55115/55115fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/55115/55115fig4.jpg"> 図 4: 化学療法の代理店の運命を調査します。ENOStag GFP 動物 (A) ナノ粒子と扱われた静脈、後で 24 h のイメージを作成します。ナノ粒子は、腫瘍間質 (AI) 最小限の血管外漏出、船舶にまだある存在。ナノ粒子は TNF と組み合わせれば、血管外漏出が血流から腫瘍間質 (AII) に観察されます。スケール バー = 250 μ m。 (B) による高解像度レンズ、内皮細胞質 (緑)、個々 のセルの核 (青) を認識することができます。スケールバー = 50 μ m。 (C) eNOStag GFP 動物だった Doxil と点滴を注入-TNF との組み合わせでは、画像が 24 h 後で撮影されました。ここでは、Doxil の血管外漏出-でした、腫瘍に血管から間質は明らか (CI)。個々 のセル (CII) のより詳細な評価は、リリースされたドキソルビシン (赤) は細胞の核 (矢印) で観察される間、(矢印)、細胞質に、紫のキャリアを見つけることができますを示しています。スケールバー = 50 μ m.<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55115/55115fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

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