Name: intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice
Uploaded: 2018-01-19T12:30:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Rien van Haperen og Rini de Crom for deres utvikling og donasjon av eNOSTag-GFP linje, Joost A.P. Rens for hans kundestøtte med dyr arbeidet og dyr vaktmester for deres hjelp. Mikroskopi fasilitetene brukes er en del av Erasmus optisk Imaging Center, og vi ønsker å takke ansatte på OIC for deres tjeneste. Denne studien ble støttet av grant DDHK 2000-2224 fra hollandske Kreftforeningen, "Vereniging Trustfonds" Erasmus University Rotterdam og "Stichting Erasmus Heelkundig Kankeronderzoek", og vi takker medlemmene av komiteene for deres generøse donasjonen.

Alle dyreforsøk ble utført i henhold til nederlandsk lov og protokoller var godkjent av komiteen av dyr eksperimentering Erasmus MC, Rotterdam, Nederland.
1. mottaker musen
<ol><li>Når transgene mus er født, skjermen dyr riktig genotype bruker standard prosedyrer9. Merk: I dette manuskriptet data fra en eNOStag-GFP linje9 egenutviklede og en kjøpt ROSA-mTmG (stock 007676)10 linje presenteres.</li>
	<li>Bruk mus som er 12 uker eller eldre, og som er over 20 g.</li>
</ol>2. donor musen
Merk: En svulst fragment for implantasjon i vinduet dorsal hentes fra en ikke-transgene donor dyr. Avhengig av hvilken svulst brukes normal (med syngeneic svulster) eller immunodeficient (xenografts) mus.
<ol><li>Vokse kreftceller i et medium med riktig kosttilskudd i kultur flasker på 37 ° C og 5% CO2.</li>
	<li>Fjerne mediet fra cellen flasker, vask en gang med 1 x PBS og koble celler med 0,25% trypsin.</li>
	<li>Deaktiver trypsin ved å legge til celle kultur medium. Samle cellene Nedspinning 1200 x g i 5 min og resuspend pellet i 5 mL av PBS.</li>
	<li>Fortynne 20 µL av cellen suspensjon med 20 µL av trypan blå, som flekker døde celler. Antallet levende og døde celler ved hjelp av en hemocytometer; Antall døde celler må ikke overstige 10%.</li>
	<li>Spinne cellene igjen på 1200 x g i 5 min og resuspend celle pellet i iskalde PBS, gir 1 million celler per 100 µL. Transport cellene på is til operasjonssalen.</li>
	<li>Bedøve dyret bruker isoflurane/O2. Slå på oksygen og justere til 0,5 mL/min. Juster isoflurane vaporizer 3%. Etter noen minutter, plassere musen i anestesi kammeret. Merk: Prefill kammeret at den er klar til bruk for å minimere stress.</li>
	<li>
Når musen er bedøvet, bringe dyret operasjonsbordet for oppvarming, holdt på 37 ° C, og plassere snute i anestesi nesen kjegle.
	<ol>
<li>Merk: Dyret er skikkelig bedøvet når ingen reaksjon footpad knipe er notert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Barbere musen for bedre å visualisere injeksjonsstedet. Vaksinere bruker en 0,5 mL insulinsprøyte; injisere 100 µL av celler i flanken av musen og tillate en svulst å utvikle.</li>
	<li>Euthanize dyret av cervical forvridning under narkose godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen.  Bruke micro saks og tang, klippes huden på plasseringen av svulsten og dissekere svulsten. Sette svulst i en Petriskål med PBS. Bruke micro saks og tang, kuttet svulst i fragmenter av ca 1 mm3 (figur 1A-en). Merk: Svulsten donor museklikk bør være store nok til å gi tilstrekkelig materiell, men store, nekrotisk svulster bør unngås. For de fleste svulster nok en gjennomsnittlig diameter på 10 mm.</li>
</ol>3. implantering av vinduet kammeret
<ol><li>Utfør alle prosedyrer under aseptiske forhold. Autoclave Kirurgiske instrumenter (figur 1A) og kammer materialer (figur 1B). Merk: Vinduet kammeret brukt her, med en samlet vekt på 1,1 g, er laget av polyether Eter keton (kikk), en lys, syntetisk materiale som Mr kompatibel. PEEK er 3.4-fold lettere enn Titan, som er vanlig i litteraturen for disse vinduene. Det er motstandsdyktig mot de fleste kjemikalier, er inaktivt, provosere ikke immunreaksjoner og er solid. Dette vinduet er også mindre design sammenlignet med tidligere publiserte Vinduer. Mus med dette vinduet viser full kapasitet av bevegelse, kan klatre, og få vekt sammenlignbare til mus uten en vindu kammer. Fordi dyret kan bite i vinduet, syntetiske windows kan vare litt kortere sammenlignet med titanium windows. men er de lett å lage og er rimelig. Disse bestemte windows gjøres internt og kan skaffes på forespørsel.</li>
	<li>Sedate mottaker musen bruker innånding bedøvelse (dvs. isoflurane/O2) i en bedøvelse kammer. Bringe musen til oppvarmet drifts tabellen på 37 ° C og plassere snute i anestesi nesen kjegle (se trinn 2.6). Bruk øye ointment å unngå tørrhet.</li>
	<li>Fjerne håret fra hele tilbake ved barbering og bruke hårgelé fjerning. Pass på at alle gel er fjernet av skylling dyret med hånd-varmt vann. Tørr dyret og rens huden med 70% etanol. Merk: Barbering prosedyren kan også gjøres dagen før vinduet implantasjon. Kremen må fjernes nøye med hånden-varm vann som kan dette føre til hudirritasjon.</li>
	<li>Merke midtlinjen på musen ryggen med merketråd slik symmetrisk plasseringen av kammeret. Flytt musen huden til en klaff med midtlinjen som en sammenleggbar posisjon og forstå midten av klaff. Plasser vinduet slik at toppen av rammen er minst 2 mm under midtlinjen og sirkel vinduet vise område på huden med en markør.</li>
	<li>Ved hjelp av en skalpell holderen/blad 15 og mikro saks, fjerne hud langs trukket rundskriv. Pass på at du ikke skade underliggende fascia. Merk: Dette skaper vinduet vise område av kammeret hvor svulsten er transplantert.</li>
	<li>Trekke opp til skinfold og bruke en øre-puncher til å slå hull 1 mm i diameter gjennom huden, en på hver side av visningsområdet (figur 1A-b). Merk: Dette er hull for to bolter for å fikse vinduskarmer sammen.</li>
	<li>Plasser skreddersydd fremre kammer rammen med bolter (tall 1B 1B-c), og plassere tilbake rammen (figur 1B-b) på bolt. Plass nøtter (figur 1B-d) tilbake rammen på bolt. Merk: Disse boltene brukes til å fastsette kamrene sammen mot de skinfold og senere brukes til nakkens kammeret under evaluering under mikroskopet.</li>
	<li>Huden 2-3 mm over toppen av rammene og sørge for at transplantable vinduet visningsområdet passer kammeret området. Sted 23 G nåler gjennom to små Sutur hullene (figur 1B, svarte pilen) på toppen av rammen. Stram nøtter på bolt med en mikro skrutrekker (figur 1A-c) og en klem nål holder til nakkens nøtter. Merk: Ta forholdsregler for å sikre at huden ikke slår rundt bolter, og ikke trekk for mye.</li>
	<li>Erstatt nålene med bildet, starter på toppen, fikse rammene mot huden. Gjør dette for 5 parene Sutur hull (figur 1B, hvit pil) i rammen.</li>
	<li>Slå for å avsløre baksiden av vinduet kammeret. Plass en tykk stykke filler glass med en diameter på 10 mm og en tykkelse på 0.55 mm (figur 1B-e) og deretter standard cover glass 12 mm (figur 1B-f). Sikre disse med en låseringen (figur 1B-g) tilbake-kammeret området. Merk: Filler glasset hindrer plass å åpne mellom fascia og vinduet på forsiden, som brukes til bildebehandling.</li>
	<li>Hydrat vinduet vise område som svulst settes ved å fylle en 1 mL sprøyte med sterilt 0,9% NaCl. Tillate noen dråper falle på dette arbeidsområdet. Fjern overflødig saline med en steril bomull tips.</li>
	<li>Opprett en lomme som er stor nok til å holde 1 mm3 svulst fragmentet (figur 1A-en) bruker en 25 G nål med sin spissen er bøyd i 90 ° vinkel (figur 1A-d) i konseptkjedene. Bruker en nål holder eller Kelly tang, sett svulst fragmentet i transplantable vinduet visningsområdet i denne lomme.</li>
	<li>Lukk vinduet vise område med et standard cover glass 12 mm og en låseringen. Merk: En luftboble kan danne, men det forsvinner innen timer.</li>
</ol>4. før og etter-omsorg av dyr
<ol><li>Administrere narkotika for smertelindring (dvs. 0,05 mg/kg buprenorfin) subcutaneously som er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen. La musen for å gjenopprette fra anestesi under en varme lampe.</li>
	<li>Plass vinduet rentebærende mus individuelt i et bur og i et klima-kontrollerte rom satt til 32 ° C og over 50% fuktighet. Kontroller at vann flaskene er miljømessig temperatur før du plasserer dem på byrået å forhindre lekkasje. Bruk bur og berikelse som tillater fri bevegelse og tilgang til mat og vann. Merk: Som denne vindu kammer er svært godt tolerert, vise mus normal opptreden. Hensyn til bolig forhindrer skade vinduet kammeret forårsaket av andre mus og høy temperatur/fuktighet forhindrer kjøling ned og dehydrering av den skinfold.</li>
	<li>Sjekke musen regelmessig for tygd-off suturer, løs bolter/nøtter eller knust forsiden glass. Umiddelbart reparerer og erstatter når dette skjer. Et deksel lagd av lett materiale kan brukes å beskytte vinduet.</li>
</ol>5. intravital Imaging
Merk: I denne prosedyren multiphoton mikroskop og aktuelle Kontrollprogramvaren brukes. Her brukes programvarepakkene som ble levert med mikroskop. I prinsippet, en programvarepakke som leveres med et mikroskop, og er ment for mikroskop kontroll og erobringen av bilder vil suite dette formålet.
<ol><li>Slå på systemet: PC/mikroskop, strøm til AC confocal kontrollenhet, laser makt og laser utslipp. For eksempel med denne programvaren, starter programvaren og starte tabellen mikroskopet (figur 1E-en og 1E-c) ved å klikke "initialisere tabell." Slå på systemet og sette den til modus slik at PC å kontrollere mikroskop, xy-bordet, z-posisjonering og bildebehandling.</li>
	<li>Slå på fluorescerende lys (figur 1E-b). Merk: Dette brukes til å evaluere fluorescens bilder gjennom okulær lyse-feltet.</li>
	<li>Slå på skreddersydde, temperatur-kontrollert plattformen (figur 1 C-c; beskrevet i diskusjonen nærmere) satt på 37 ° C.</li>
	<li>Slå på anestesi enheten bruker isoflurane/O2 (figur 1E-d). Monter anesthesia røret på mikroskopet scenen (figur 1 C-e). Installere en klemme på xy-scenen å fikse anestesi snute stykket.</li>
	<li>Før vurdere dyret å etablere scenen av svulst fartøyet utvikling; Dette avhenger av hastigheten på tumor vekst, men det kan variere mellom individuelle mus.
	<ol>
<li>Sedate musen bruker innånding bedøvelse (isoflurane/O2) i en bedøvelse kammer (se trinn 2.6).</li>
		<li>Plassere dyret på temperaturkontrollert plattformen montert på mikroskopet scenen; Dette hindrer nedkjøling av dyret når det er anesthetized. Kontroller at snuten av musen ligger i anestesi membran og bruke øye ointment hvis evalueringen ville ta lengere enn 5 min. Merk: For en vurdering som er lengre enn 1 h, redusere isoflurane til 2%.</li>
		<li>Bruk kammer bolter for å fikse (figur 1 C-b, full pil) kammer på en skreddersydd kammer (figur 1 C-en). Skruen denne holderen (figur 1 C-d, stiplet pil) til oppvarmet plattformen (figur 1 C-c). Merk: Denne kombinasjonen hindrer bevegelse gjenstander i visningsområdet vinduet samtidig gir dyret å puste fritt.</li>
		<li>Husk å rengjøre visningsområdet vindu med bomull tips dyppet i vann for å hindre en sløret image og forstyrrelser kommer fra avfall på utsiden av glasset. Plass plattform og musen på mikroskopet scenen (figur 1 d). Merk: Pass på at halen ikke sette seg fast mellom plattformen og mikroskopet scenen.</li>
		<li>Visuelt sjekk utviklingstrinn svulst fartøy ved hjelp av en 10 X linsen, lyse-feltet, og fluorescerende lys. Merk: Fluorescerende fartøy bør være i fokus og blodstrøm skal være synlig lys feltet. Når er blodkar er klart sett, evaluere utviklingstrinn svulst fartøy. For eksempel avgjøre om det er tidlig angiogenese med veksten av tips celler eller en allerede etablert blodkar for narkotika-leveranser. Samme dyret kan evalueres igjen, og som tumor utvikling er en kontinuerlig prosess. Flere etapper kan observeres i en enkelt svulst samtidig.<ol>
<li>Når det ikke er mulig å fokusere på er blodkar, fjerne dyret fra scenen, la musen komme, og sted dyret tilbake i et klima-kontrollerte rom. Sjekk den igjen senere. Når musen er klar for evaluering, Fortsett med prosessen beskrevet nedenfor.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Slå på AC confocal lasere og Kontrollpanel ved å klikke "Laser" og "Ctrl panel" i kategorien konfigurasjon Merk: Det anbefales å sette laser makt lav, spesielt for Argon laser, å forhindre bleking, oppvarming av vev og photodamage. Kontrollpanelet kan settes til personlige preferanser. Intravital bildevisning flere fluorophores anbefales det å bruke følgende innstillinger: "smart gevinst, 100 V per tur," "smart forskyvning, 10% per tur," "zoom, middels," "X posisjon, middels," "Y-posisjon, medium," og "Z posisjon, 100 µm per trekk." Før avbildning, kan du justere forskyvningen for å minimere støy og optimalisere signal-til-støy-forhold. AC confocal zoom-funksjonen gir en høyere forstørrelse uten å endre målet linser. X-, Y- og Z-kontroll er nødvendig å finne interesseområder. For intravital mikroskopi, bør Z-posisjonering være ca 100 µm per tur som tick vev evalueres.</li>
	<li>Klikk på "Erverv" i kategorien tilegne seg og endre innstillingen slik: "Kjøp modus XYZ eller XYZT," "Format (512 x 512 eller 1024 x 1024)" og "Speed (400 Hz eller 200 Hz)." Klikk på «Pinhole» og sett den til 1 luftige enhet. Klikk på "Toveis X". Merk: For å optimalisere bildene, en balanse mellom laser makt og vinning pinhole bør bli slått, som er nevnt i diskusjonen.</li>
	<li>Når du vurderer flere fluorophores, velg "sekvensiell scan" og "mellom rammer" å forhindre gjennomslag, som nevnt i diskusjonen.  Velg "Linje gjennomsnittet 4" å få en god demping av lyden. Merk: Avhengig av den iboende fluorescensen i transgene dyret, andre fluorescerende markører, som dextrans, Hoechst, FITC-BSA, fluorescerende chemotherapeutics eller nanopartikler utvannet til ønsket konsentrasjonen i 0,9% NaCl kan være administrert og vurdert i svulsten. Dette er injisert gjennom hale eller penile blodåre.</li>
	<li>Klikk på "Eksperiment" i kategorien anskaffe og velg "New" for å gjøre en ny data base.</li>
	<li>Evaluere dyr hjelp, avhengig av problemstillingen, 10 X, 20 X eller 40 X målet linser. Gjennom okulær, finne en posisjon til å evaluere. Merk: Det er best å bruke tørr objektiver med en NA så høyt som mulig, så tørr linser har en relativt lang arbeider avstand og gjøre ikke trenger nedsenking væske. I diskusjonen, er bruk av vann nedsenking målet linser nevnt.</li>
	<li>Bruk en rask live skanning for å finne riktig gevinst og offset å forebygge overeksponering og optimalisere signal-til-støy-forhold. Også opprettholde samme tenkelig innstillingene under og mellom eksperimenter hvis kvantitative sammenligning er nødvendig. Merk: Ytterligere vurderinger for optimal imaging er nevnt i diskusjonen. XYZ posisjon og zoom kan fullføres under bor skanningen ved hjelp av kontrollpanelet.</li>
	<li>For å gjøre en Z-stabel, velg "Z-stack" i kategorien anskaffe gjør en rask Z-skanning bruker Z-posisjonen i kontrollpanelet og angi begynnelsen og slutten av ved å klikke "Start µm" og "End µm." Angi Z-trinn gjelder pinhole størrelsen.</li>
	<li>Ta bildene ved å klikke "start". Merk: Som intravital mikroskopi handler om kinetics og derfor dynamisk prosesser er observert, et kompromiss mellom tiden det tar å få et bilde og hastigheten på de biologiske prosessene må gjøres. Generelt, jo høyere oppløsning, mer fluorescerende kanalene er skannet og større skanningen feltet, jo flere piksler per bilde. Tykkere Z-stabler oversette til gangen lenger tenkelig. Gangen lenger tenkelig øker sjansen for bevegelse gjenstander og kan forårsake skade på vev fotografert. Vær også oppmerksom på at skanning visse fluorescerende etiketter forårsaker bleking og toksisitet, som er påvirket av laser makt og konsentrasjonen av akkumulert fargestoff.</li>
	<li>Etter skanning Z-stakken kan raskt evalueres ved å klikke "maksimal projeksjon". Z-stakken blir automatisk lagret i databasen og kan endres.</li>
</ol>6. dataanalyse
<ol><li>Avhengig av opprinnelige problemstillingen, bruker du en av flere programmer, for eksempel ImageJ5, Matlab11eller Amira, for dataanalyse. Riktig analyse er avgjørende.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17, 545-580 (2003).</li><li>Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+hallmarks+of+cancer+in+living+mice.">Imaging hallmarks of cancer in living mice.</a> Nat Rev Cancer. 14, 406-418 (2014).</li><li>Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+tumors.">In vivo imaging of tumors.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), (2010).</li><li>Palmer, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+optical+molecular+imaging+and+analysis+in+mice+using+dorsal+window+chamber+models+applied+to+hypoxia,+vasculature+and+fluorescent+reporters.">In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent reporters.</a> Nat. Protocols. 6, 1355-1366 (2011).</li><li>Seynhaeve, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+alpha+mediates+homogeneous+distribution+of+liposomes+in+murine+melanoma+that+contributes+to+a+better+tumor+response.">Tumor necrosis factor alpha mediates homogeneous distribution of liposomes in murine melanoma that contributes to a better tumor response.</a> Cancer Res. 67, 9455-9462 (2007).</li><li>Schiffelers, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-targeted+liposomes+directed+against+pathological+vasculature.">Ligand-targeted liposomes directed against pathological vasculature.</a> J Liposome Res. 12, 129-135 (2002).</li><li>Straetemans, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+receptor+gene+therapy+in+human+melanoma-bearing+immune-deficient+mice:+human+but+not+mouse+T+cells+recapitulate+outcome+of+clinical+studies.">T-cell receptor gene therapy in human melanoma-bearing immune-deficient mice: human but not mouse T cells recapitulate outcome of clinical studies.</a> Hum Gene Ther. 23, 187-201 (2012).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li><li>van Haperen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+endothelial+nitric+oxide+synthase+fused+to+green+fluorescent+protein+in+transgenic+mice.">Functional expression of endothelial nitric oxide synthase fused to green fluorescent protein in transgenic mice.</a> Am J Pathol. 163, 1677-1686 (2003).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Manzoor, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+limitations+in+nanoparticle+drug+delivery:+triggered,+intravascular+release+to+improve+drug+penetration+into+tumors.">Overcoming limitations in nanoparticle drug delivery: triggered, intravascular release to improve drug penetration into tumors.</a> Cancer Res. 72, 5566-5575 (2012).</li><li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice.">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nat Protoc. 5, 1518-1534 (2010).</li><li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo.">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> J Vis Exp. , e50546 (2013).</li><li>Hobbs, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+transport+pathways+in+tumor+vessels:+role+of+tumor+type+and+microenvironment.">Regulation of transport pathways in tumor vessels: role of tumor type and microenvironment.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4607-4612 (1998).</li><li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumours.">Drug penetration in solid tumours.</a> Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).</li><li>Koning, G. A., Eggermont, A. M., Lindner, L. H., Hagen, t. e. n., L, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperthermia+and+thermosensitive+liposomes+for+improved+delivery+of+chemotherapeutic+drugs+to+solid+tumors.">Hyperthermia and thermosensitive liposomes for improved delivery of chemotherapeutic drugs to solid tumors.</a> Pharm Res. 27, 1750-1754 (2010).</li><li>Seynhaeve, A. L., Eggermont, A. M., ten Hagen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF+and+manipulation+of+the+tumor+cell-stromal+interface:+&amp;#34;ways+to+make+chemotherapy+effective&amp;#34;.">TNF and manipulation of the tumor cell-stromal interface: &amp;#34;ways to make chemotherapy effective&amp;#34;.</a> Front Biosci. 13, 3034-3045 (2008).</li><li>Brouckaert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha+augmented+tumor+response+in+B16BL6+melanoma-bearing+mice+treated+with+stealth+liposomal+doxorubicin+(Doxil)+correlates+with+altered+Doxil+pharmacokinetics.">Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics.</a> Int J Cancer. 109, 442-448 (2004).</li><li>Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., ten Hagen, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+low-dose+tumor+necrosis+factor-alpha+to+systemic+treatment+with+STEALTH+liposomal+doxorubicin+(Doxil)+improved+anti-tumor+activity+in+osteosarcoma-bearing+rats.">Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats.</a> Anticancer Drugs. 16, 667-674 (2005).</li><li>Gabizon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+circulation+time+and+enhanced+accumulation+in+malignant+exudates+of+doxorubicin+encapsulated+in+polyethylene-glycol+coated+liposomes.">Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes.</a> Cancer Res. 54, 987-992 (1994).</li><li>Bergers, G., Benjamin, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorigenesis+and+the+angiogenic+switch.">Tumorigenesis and the angiogenic switch.</a> Nat Rev Cancer. 3, 401-410 (2003).</li><li>Eilken, H. M., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+endothelial+cell+behavior+in+sprouting+angiogenesis.">Dynamics of endothelial cell behavior in sprouting angiogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 22, 617-625 (2010).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer.">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> J Vis Exp. , e50088 (2013).</li><li>van Vliet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MR+angiography+of+tumor-related+vasculature:+from+the+clinic+to+the+micro-environment.">MR angiography of tumor-related vasculature: from the clinic to the micro-environment.</a> Radiographics. 25, S85-S97 (2005).</li><li>Dicheva, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+thermosensitive+liposomes:+a+novel+dual+targeted+heat-triggered+drug+delivery+approach+for+endothelial+and+tumor+cells.">Cationic thermosensitive liposomes: a novel dual targeted heat-triggered drug delivery approach for endothelial and tumor cells.</a> Nano Lett. 13, 2324-2331 (2013).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+intratumoral+nanoparticle+extravasation+and+penetration+by+mild+hyperthermia.">Improved intratumoral nanoparticle extravasation and penetration by mild hyperthermia.</a> J Control Release. 167, 130-137 (2013).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Som svulst og svulst fartøyet utvikling, samt svulst terapeutiske effekter, er svært dynamisk prosesser, er intravital bedømmelse en elegant verktøy for å lage en riktig vurdering av prosessene på en gang - og romlig-avhengige måte. Med den økende tilgjengeligheten av levende celle markører, etableringen av transgene dyr og fremme av imaging modaliteter, blir intravital imaging mer og mer populært. Selv om histology brukes fortsatt rutinemessig, og en rekke indikatorer kan brukes til å identifisere celler og strukturer, har vev snitting ulemper når undersøke dynamisk prosesser. Vev disseksjon er nødvendig, bare statisk informasjon; fiksering påvirker vev kvalitet; og slicing skader mobilnettet interaksjoner. Også når undersøke dynamisk prosesser, krever vev disseksjon på forskjellige og ofte antatt, tidspunkt en stor mengde av dyr. Med intravital bildebehandling, kan XYZ romlige dimensjoner og den ekstra dimensjonen tid evalueres i samme dyret, gjør riktig posisjonering av mulig i rom og tid. Derfor optimal tidspunkt er ikke savnet, og dyr nummeret brukes per eksperimentet er betydelig redusert. Andre kan tid-vinduet etablert med intravital evaluering ekstrapolert for å optimalisere vev utvinning. Tredje kan ønsket scenen av fartøyet vekst identifiseres intravitally og flekker som en hel-mount vev.
Intravital design nevnt i dette manuskriptet bruker en kombinasjon av transgene dyr uttrykke en fluorescerende etikett i endotelceller, en modifisert dorsal skinfold kammeret modell og et dedikert multiphoton AC confocal mikroskop.
Endotelceller gå gjennom en rekke etapper21,22 under angiogenese, og disse stadiene kan ofte sees samtidig i en svulst. Ved hjelp av eNOSTag-GFP mus linjen, personlige endotelceller kan følges, og selv filopodia dynamics kan spores. Det er derfor en god modell å studere fartøyet utvikling intravitally. Avhengig av de allerede-DD iboende etikettene, kan injiserbare fluorescerende agenter brukes til å vurdere lumen formasjon, blodstrøm, bloduttredelse og blod klaring. Musen er fotografert kontinuerlig for opptil 5 h. Langsiktig evalueringen av et dyr er mulig når tatt flere forholdsregler angående anestesi av dyret, som har vært beskrevet tidligere23. Som denne forskningen er fokusert på kreft, ble svulster vev eller celler implantert. Men eksperimenterte vi også med metatarsals og embryonale lunger. Men er veksten av vev under studien begrensende, som etter et par uker, huden begynner å regrow, som kan være et problem med langsom voksende svulster eller vev.
I fasen for validering av dorsal skinfold vinduet kammeret ble betydelig endret i forhold til klassisk modell4. Rammene er konstruert av autoclavable syntetisk materiale og lys og liten, med stort vindu-visning-område. Kroken låseringen (figur 1Bg, hvitt pilhode) brukes bare for enkel fjerning av ringen. Retainer ringer uten kroker kan brukes når dette forstyrre bildebehandling. Huden strekkes ikke for mye, løsne forekommer ikke i denne modellen, og infeksjoner er bare sjelden sett. Disse endringene reduserer dyr ubehag og avgrense dyr prosedyren betydelig. Også kan metalldeler enkelt fjernes når imaging svulsten bruke MRI24.
Noen mikroskop kan bli vedtatt intravitally bildet dorsal skinfold kamre. Hovedkravet er tilgjengelig plass mellom mikroskop scenen og i linsen. Et viktig aspekt som påvirker imaging er bevegelse. For å hindre bevegelse, skal en plattform som passer i tabellen mikroskopet (etter fjerning av alle innsatser) og støtter musen brukes. Det er ikke nødvendig å holde musen når det er under anestesi, og det er bedre å la musen pusten fritt. Men i vinduet er boltet på plattformen, gir optimal fiksering av synsfelt (dvs. svulsten er synlig gjennom vinduet kammeret). Plattformen er oppvarmet ved hjelp av en elektronisk oppvarming pad, som brukes til dyr oppvarming. Denne plattformen ble gjort internt, og informasjon kan fås på forespørsel. En høy oppløsning linsen er en nødvendighet når du vurderer intracellulær prosesser og gjør det mulig å forskjellsbehandle cytoplasma og kjernen. Bruk av en konisk linse med en god optisk oppløsning (høy NA) men relativt lang arbeidsavstand (fortrinnsvis 2 mm eller nyere) anbefales. Begrensning i imaging er gjennomtrenging dyp og fluorescerende intensiteten av etikettene. Videre må photobleaching, Phototoksisitet og metning unngås under bildebehandling.
Her, ble en integrert AC confocal-multiphoton og AC confocal mikroskop brukt. Multiphoton er oppreist, mens den AC-confocal er en invertert mikroskop. Fordelen med en oppreist mikroskopet er lett bruk av vann nedsenking linser. Disse linsene har en høy NA og en lang arbeidsavstand, selv på en høy (f.eks 20 eller 40 X) forstørrelse. Spesielt anbefales å få en 20 X NA 1.0 vann nedsenking linse, som selges av flere selskaper. Vær oppmerksom at når nedsenking linser brukes, linsen og nedsenking væske må være oppvarmet til 37 ° C. For de beste bildene, anbefales det å bruke optimale AC confocal innstillinger (dvs. pinhole på 1 luftige enhet, laser makt så lavt som mulig gevinst ikke for høyt (spesielt hvis gevinsten introduserer støy), linjehastighet maksimum, og ingen snitt skanninger). Overeksponering, metning og forskjellen i intensiteter bilder kompromiss datakvaliteten. Det anbefales å hindre metning og overeksponering. Dette kan omgås ved å kjøpe bilder på forskjellige gevinst innstillinger. Endre gevinsten er den enkleste måten å endre bildet lysstyrken. Hvis nødvendig, kan laser makt justeres. For å standardisere bildekvaliteten, kan lysbilder med en fast fluorescens intensitet brukes. Man må huske på at selv når mikroskopet er optimalt, bestemmes bildekvalitet i stor grad av kvaliteten på vinduet kammer og vev
Når skanning flere fluorescerende markører samtidig, må gjennomslag, der en fluorophore registreres i kanalen i en annen, unngås. Unngå gjennomslag ved hjelp av en kombinasjon av fluorophores med minimal overlappende spectra og sekvensiell skanning mellom rammer. Bildene presentert her ble skannet med 3 sekvensielle avsøkinger (spor 1: GFP, DID eller fluor647 med 488 og 633 laser; spore 2: rhodamine, Doxil eller mTomato med 543 laser, og spore 3: Hoechst med 405 laser).
Muligheten til å vurdere flere stadier av svulst fartøyet utvikling, tips-cellen dynamics, lumen formasjon, bloduttredelse og vaskulære skader er vist her. Ved hjelp av eNOStag-GFP-linjen, er svulst områder med en ødelagt vaskulær seng lett oppdaget av granulert mobilnettet matrester likevel uttrykker GFP. Ingen injiserbare agent ble oppdaget i disse områdene viser mangel på flyt. Dette betyr at administrert chemotherapeutic agenter vil ikke nå disse områdene heller. Imidlertid kan fartøyet ødeleggelse også være et terapeutisk resultat. Før evaluering av svulsten, etter forbehandling fartøyet ødeleggelse, er en forutsetning for nøyaktig terapeutiske evalueringen og kan utføres enkelt med denne eksperimentell design.
Det er en overflod av muligheter som intravital mikroskopi kan brukes, og detaljert diskusjon er utenfor omfanget av denne publikasjonen. Gi en kort innsikt, inkluderer mulig programmer studier på akkumulering av chemotherapeutics i tumor vev, utviklingen av fartøy (f.eks antall fartøy, grener og kryss) og blodstrøm, celle-celle interaksjoner, celle målretting og intracellulær behandling, samt eksempler ovenfor og vist her. Som analysen er basert på fluorescens, være klar over intensitet svingninger på grunn av kvaliteten på vinduet eller vev. Også, som tumor vev er relativt tykk, fluorescens fra over eller under flyet av har en innvirkning på signalet i bildet. Det er best å kombinere kvantitative bildeanalyser med objektive mål. For eksempel, hvis interessert i stoffet konsentrasjoner, fjerne tumor vev fra vinduet etter intravital mikroskopi og finne stoffet innhold med HPLC sammenlignes med AC confocal bilder.
Evalueringen av tumor respons kan utføres som godt med denne modellen, men med forholdsregler. En må innse at svulster også vokser innover inn i huden. 3D-målinger gjøres hvis gjennomtrengning er dypt nok til å dekke hele svulsten. I slike tilfeller bør langt rødt fargestoffer brukes. Vinduet kammeret som beskrevet her avtaler med svulster i huden omgivelser, og det er viktig å påpeke at vinduet opprettholder en temperatur litt lavere enn normal mus kroppstemperaturen. Derfor er det best å studere tumorer i høyre mikro miljømessige innstillingen å bekrefte intravital studier med det dorsal skinfold vinduet kammer. Viktigere, den rygg skinfold kammeret gir innblikk i the kinetics av prosesser og mekanismer, gir en instrumental basis for forbedring av terapi. Ekstra informasjon om biodistribution og farmakokinetikken fås også. Klassisk, utføres disse biodistribution studier av behandler svulst-bærende dyr og dissekere svulster/organer for å måle narkotika opptak. Bruker denne intravital modellen, kan intratumoral plasseringen av et medikament (dvs. intravascular, intratumoral, intracellulær eller kjernefysiske) tilbys5,25,26. Ikke bare er plasseringen av stoffet avslørt, men også tid vindu-av-muligheten for mest optimale opptaket.
Bruker eksperimentell design beskrevet i denne artikkelen, kan en rekke parametere vurderes i timelige og romlig omgivelser. Spesielt viser her vi at intravital mikroskopi gir viktig innsikt i dynamikken i svulst fartøyet utvikling og terapeutiske respons.

Mens i vitro studier aktivere høyoppløselig kinetic avbildning av prosesser, aktiveres ikke i vitro eksperimentering evaluering i riktig sammenheng. For eksempel kan samspillet av kreftceller med stromal avdelinger eller narkotika-leveranser og distribusjon i en svulst studeres i en kultur plate. Dyremodeller brukes derfor å etterligne menneskelige fysiologi og patologi. Men er langsgående avbilding av prosesser, spesielt på en subcellular oppløsning, utfordrende. Molekylær imaging metoder, for eksempel magnetisk resonans imaging (MRI), enkelt-fotonet utslipp beregnet tomografi (SPECT) og fantes et positron utslipp tomografi (PET), har god gjennomtrenging dyp men mangel oppløsningen eller unnlater å illustrere anatomiske strukturer. Optisk tenkelig gir høy oppløsning og gjør avbilding av strukturer, men det er ledsaget av fattige minimal penetrasjon1. Programmet av intravital mikroskopi i kombinasjon med vinduet kammer teknologi, for eksempel en dorsal skinfold eller mage-vinduet gir høy-resolution tenkelig i vivo2,3,4. Denne teknologien har forskjellige fordeler, fordi det gir langsgående imaging timer og dager, for avbildning av prosesser i riktig sammenheng (f.eks celle-celle interaksjoner i fotografert vev), og løsninger på optisk grensene for avanserte AC confocal og multiphoton mikroskop.
Innføring av transgene dyr med celle - eller protein-spesifikk fluorescerende etiketter åpner en mengde muligheter for i vivo og ex vivo experimentations. For eksempel, celle-celle interaksjoner, produksjonen av proteiner og svaret manipulasjon eller terapi kan studeres modeller i vivo bruker disse5,6,7,8. Viktigere, plasser i sted og tid kan bestemmes med riktig bildebehandlingsutstyr og metodikk. Her, den intravital mikroskopi dyr uttrykke en endothelial markør i kombinasjon med injiserbare agenter i en svulst implantert i en modifisert dorsal skinfold vinduet kammeret er presentert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1145</td>
			<td>Supplemented with 10% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-versene (EDTA)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161E</td>
			<td>Make a 0.1% solution in PBS, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window frames</td>
			<td>Costum made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filler glass 10 mm, 0.55 mm</td>
			<td>Abrisia technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass 12mm, #1 thickness</td>
			<td>Thermo Scientific/VWR</td>
			<td>631-0713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hear removal gel (veet)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for sensitive skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorfine hydrochloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>use 0.05 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia unit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green</td>
			<td>BD</td>
			<td>324824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 23G 1 1/4&#34;</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 25G 5/8&#34;</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures silkan 0.7</td>
			<td>Braun</td>
			<td>1134019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuts</td>
			<td>Jeveka</td>
			<td>934 A2 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolts</td>
			<td>Jeveka</td>
			<td>84 A2 1 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope + software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated temperature controlled platform</td>
			<td>Costum made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window holder</td>
			<td>Costum made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D7139</td>
			<td>100 &#181;g/mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D22914</td>
			<td>100 &#181;g/mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>25 &#181;g/mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pegulated nanoparticles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ref 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS AF Software</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice

Svulst og svulst fartøyet utvikling, samt tumor respons på therapeutics, er svært dynamisk biologiske prosesser. Histologi gir statisk informasjon og er ofte ikke tilstrekkelig for en korrekt tolkning. Intravital evaluering, som en prosess er fulgt i tid, gir ekstra og ofte uventet. Med etableringen av transgene dyr uttrykke celle-spesifikke indikatorer og levende celle tracers forbedringer bildebehandlingsutstyr og utviklingen av flere tenkelig kamre, har intravital mikroskopi blitt et viktig verktøy for bedre å forstå biologiske prosesser. Dette dokumentet beskriver en eksperimentell design for etterforskningen av svulst fartøyet utvikling og terapeutiske effekter på en romlig og tidsmessige måte. Bruker dette oppsettet, kan scenen av fartøyet utvikling, tips cellen og lumen formasjon, blodstrøm, bloduttredelse, en etablert vaskulær seng og vaskulær ødeleggelse visualisere og fulgte. Videre kan terapeutiske effekter, intratumoral skjebne og lokalisering av chemotherapeutic forbindelser også følges.

Hovedattributtet til intravital imaging er langsgående visualisering av cellulære prosesser uten invasiv intervensjon. For dette brukes transgene dyr uttrykke en grunnleggende eller induserbart fluorescerende markør i celler av interesse. Figur 2 viser uttrykk for fluorescerende etiketter i eNOStag-grønn fluorescerende protein (GFP)9 og Rosa-mTmG mus linjer10. ENOStag-GFP er en mus som ble produsert internt bruker en avkortet eNOS genet som en kode for GFP. Viktigere, eNOS uttrykkes svært endotelceller, og GFP signalet er tydelig i th eGolgi og mobilnettet membran (figur 2A). Rosa-mTmG mus har en membran målrettede tofarget fluorescens grobunn reporter allelet. Denne linjen uttrykker mTomato fluorescens i utbredt celler og mGFP i grobunn recombinase-uttrykke celler og brukes vesentlig for avstamning sporing. Som en svulst brikke er transplantert fra en ikke-transgene donor, røde fluorescens er overveiende uttrykt ved stromal deler i svulsten (f.eks i membranen av vaskulære celler, sirkulerende celler, infiltrert blod celler, og svulst-assosiert fibroblaster (figur 2B)).
Fartøyet formasjon er strengt regulert, og en utmerket modell å studere dette er utvikle netthinnen12,13. Fartøyet tumorveksten er også en kinetisk prosess som ligner i prinsippet til netthinnen fartøyet utvikling. Imidlertid svulst fartøy mangler organisasjon og, som en svulst er kontinuerlig remodeling, så er det svulst-assosiert blodkar. Dette kan ha sine fordeler når du bruker svulst som angiogenic modell, som alle stadier av fartøyet utvikling kan ofte bli funnet i samme svulsten samtidig. Disse inkluderer en endothelial spirende foran vokser i en un vascularized del av svulsten (figur 2C); skadede skip (figur 2D); og en etablert vaskulær seng (figur 2E-jeg) med modne, forgrenet fartøy (Figur 2E-II). Imidlertid kan angiogenic endotelceller også finnes i disse områdene. Når stimulert av angiogenic stimuli, en endothelial celle stikker filopodia (Figur 2E-III) og kan gå videre i en tips celle, bruker disse filopodia for skanning og retningsbestemt overføring (Figur 2E-IV). Denne tips cellen overfører til tumor interstitium og etterfølges av deler stilk celler. En enkelt endothelial tip-cellen har flere filopodia utvide, trekke og fornyelse når som helst, og kan spores ved hjelp av intravital mikroskopi (figur 2F).
Dernest kan intravital mikroskopi brukes til å bestemme lumen formasjon en angiogenic foran, blodstrøm gjennom svulst, og bloduttredelse. Avhengig av allerede-DD iboende signaler fluorescerende i dyr, kan ulike fluorescerende forbindelser administreres. Blodstrøm og bloduttredelse kan visualiseres ved hjelp av Hoechst, fluorescerende dextrans eller FITC-BSA. For utvidede studier på blodet flyt og partikkel bloduttredelse, lang sirkulasjon fluorescently merket pegylert nanopartikler 100 nm kan brukes. Om utarbeidelse av disse nanopartikler, se forrige publikasjonen5. Bruken av disse forbindelsene er vist i Figur 3. Endothelial tips cellene i en Rosa-mTmG mus kan sees tydelig invadere tumor vev. Funksjonell blodstrøm er demonstrert av den lilla fluorescensen av systemisk injisert nanopartikler i lumen vaskulær rør (figur 3A-jeg). Nanopartikler nå nært endothelial tips celler illustrerer dannelsen av en lumen i stilk cellen området (Figur 3A-II). Levering av systemisk administrert chemotherapeutics avhenger av en funksjonell blodkar for å nå svulst interstitium og som vist i figur 3B, injiserbare agenter, uavhengig av størrelse, trenge gjennom ikke områder med ødelagt fartøyer, komprimert fartøy, eller fartøyer med blod stasis.
I de fleste organer, endothelial fôr danner en funksjonell barriere mellom blod og underliggende vev og passering av molekylene er strengt regulert. Svulst-assosiert blodkar, men er kjent for å være lekk, og pore-størrelse cut-off avhenger sterkt svulst type14. Fluorescerende-konjugerte dextrans med forskjellige størrelser kan injiseres for å vurdere den blodstrøm, permeabilitet og bloduttredelse. Hoechst (615 Da) diffunderer raskt til tumor vev og er tatt opp av omkringliggende celler (Figur 3 c-jeg). Kort tid etter injeksjon, dekstran 10 KDa (figur 3CII) og 2 MDa (Figur 3 C-III) finnes i blodet. Imidlertid tilskrevet dekstran 10 KDa er også sett i svulst-interstitium som angir permeabilitet av endothelial fôr for mindre molekyler, som er en funksjon av svulst fartøy. 40 min etter injeksjon (Figur 3 C-IV), dekstran 10 KDa fjernes fra blodet (Figur 3 C-V) og fluorescerende intensiteten av dekstran 2MDa er redusert også (Figur 3 C-VI). Men finnes store dextrans ikke i svulst interstitium, demonstrerer en mangel på permeabilitet til store molekyler innenfor denne tidsrammen.
Svulst patofysiologi, med sin svært voksende necrotic og un vascularized områder, kan være ganske informativ når du bruker svulst som en angiogenic modell. Men utgjør dette et problem for effektiv terapi og etterforskning. Heterogenitet av svulst-assosiert blodkar forårsaker en heterogen fordeling av administrert narkotika, slik at hele områder medikamentfri15. For å forbedre narkotika-leveranser, flere strategier kan være anvendt15,16,17, og terapeutiske progresjon kan undersøkes ved hjelp av denne intravital design. Svulst-assosiert blodkar kan manipuleres med vasoactive agenter for å forbedre narkotika levering17. Resultatene av svulst fartøyet manipulasjon bruker svulst necrosis alpha (TNF) som en vasoactive agent i kombinasjon med Doxil, innkapslede liposomal utformingen av doksorubicin, som en chemotherapeutic agent presenteres i dette manuskriptet5, 18 , 19. i motsetning til dextrans, gjøres pegylert nanopartikler sirkulere for flere timer, hvis ikke dager, i blod sirkulasjon20.
Som tidligere nevnt kan svulst området pre skannede å identifisere de riktige svulst områdene avhengig av problemstillingen. Stoffet skjebne kan evalueres i områder med en funksjonell blodkar mot områder med en allerede skadet vaskulær seng (data ikke vist). Undersøke skjebnen til chemotherapeutic agenter uten cytotoksiske forstyrrelser, nanopartikler med samme sammensetning som terapeutisk agent kan brukes som et stoff som modell. En eNOStag-GFP dyr var behandlet IV med disse nanopartikler og fotografert 24 timer senere. Nanopartikler var fremdeles på blodkar, med minimal bloduttredelse til tumor interstitium (figur 4A-jeg). Men når nanopartikler ble administrert i kombinasjon med TNF, ble bloduttredelse observert fra blodet i svulst interstitium (Figur 4A-II), øker intratumoral narkotika-leveranser. Ved hjelp av høyoppløselige målet linser, kan den intracellulære lokaliseringen av et sammensatt bli gjenkjent, som vist her ved kjernefysiske plasseringen av Hoechst grønne endotelceller og cellene i svulst interstitium (figur 4B). Dessuten, som mange chemotherapeutic agenter, som doksorubicin, intercalate med DNA, lokalisering av disse forbindelsene kan evalueres. Doksorubicin har røde fluorescerende egenskaper, og nanocarrier kan være merket med, for eksempel tetramethylindotricarbocyanine-perklorat (gjorde). En eNOStag-GFP dyr ble injisert IV med Doxil-i kombinasjon med TNF, og bildene ble tatt 24 timer etter behandling. Doxil-extravasated av blodkar og ble tatt opp av rundt tumor vev (figur 4C-jeg). En mer detaljert vurdering av individuelle celler (Figur 4 C-II) viste at transportøren kan bli funnet i cytoplasma, mens utgitt doksorubicin ble observert i mobilnettet kjernen.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55115/55115fig1.jpg"> Figur 1: instrumenter, dorsal skinfold kammer og utstyr oppsett kreves for prosedyren. (A) svulst fragmenter (a) og Kirurgiske instrumenter nødvendig for implantasjon. Ikke-standard instrumenter er et øre puncher (b), en mikro skrutrekker (c) og en bøyd nål (d). (B) Dorsal skinfold vinduet kammer. Foran (a) og bak (b) vindu (pil: hull for suturer; pilspiss: hull for bolter), 2 skruer (c), 2 nøtter (d), 1 filler glass (e), 2 cover glass (f) og 2 beholde ringer (g). Også kan beholde ringer uten kroker (hvitt pilhode) brukes når nødvendig. (C) skreddersydd kammer holderen (A), bolter for den kammer til kammer holderen (b), temperaturkontrollert plattform (c), skruer for å feste kammer abonnenten til plattformen (d), og holderen med av bedøvelsen rør (e). (D) dyr montert i kammeret holderen på plattformen. En B16BL6 svulst (pil) vises i vinduet visningsområdet. (E) utstyret som trengs for intravital evalueringen. Datamaskin med bildebehandling og mikroskopet kontroll programvare (a) standard fluorescerende lys (b) og mikroskopet. En multiphoton AC confocal ble brukt (c) med en bedøvelse enhet (d). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55115/55115fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55115/55115fig2.jpg"> Figur 2: iboende fluorescens av transgene dyr. Alle bilder vises her er Z stabel anslag mellom 50 og 70 µm tykk. (A) eNOSGFP-tag line, GFP uttrykkes i Golgi (stjerne) og cellemembranen (pil) av endotelceller. Skala bar = 100 µm. (B) Intratumoral uttrykk for mTomato i Rosa-mTmG linje finnes hovedsakelig i cellemembranen vaskulære celler (pil) og blod celler (stjerne). Skala bar = 100 µm. (C) A projeksjon av en voksende angiogenic front i un vascularized svulst. Skala bar = 100 µm. (D) A projeksjon av svulst med etablerte og skadede skip (stjerne). (E) en projeksjon av etablerte svulst blodkar (EI) viser modne tick fartøy (EII); angiogenic endothelial tips celler med filopodia (EIII, pilspiss); og en eldre fartøy, som en enkelt endothelial celle utvider en filopodium (EIV, pilspiss) inn i interstitium. Skala bar = 100 µm. (F) bevegelse av filopodia, fulgte 1t. Hvert 15 min, ble Z stabel tatt; en maksimal projeksjon presenteres her. Filopodia utvider (hvit pil), stillestående (=), trekke (rød pil) eller selv helt forsvinner (-). Skala bar = 25 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55115/55115fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/55115/55115fig3.jpg"> Figur 3: administrasjon av injiserbare etiketter å illustrere bloduttredelse og blodstrøm. (A) A Rosa mTmG musen ble injisert med lilla fluorescerende nanopartikler, og en Z-stabel av en invaderende tips celle foran ble tatt 10 min senere (AI). En projeksjon viser at mest endothelial har spirer en funksjonell lumen (AII, pil). Bare sjelden sees endothelial spirer uten strøm (AII, pilspiss). Skala bar = 250 µm. (B) denne Z stabel projeksjonen viser et ødelagt svulst fartøyet område i en eNOStag-GFP dyr før behandling (BI). Dyret ble injisert med nanopartikler (lilla, BII) og Hoechst (blå, BIII). Nanopartikler og Hoechst nå ikke ødelagt områder, angitt av granulert celle rusk likevel uttrykker GFP. Skala bar = 250 µm. (C) en eNOStag-GFP mus ble injisert med to dextrans i forskjellige størrelser (rød = dekstran 2 MDa, lilla = dekstran 10 KDa) og Hoechst (blå = 615 Da), og single-plane bilder presenteres her. 10 min etter injeksjon, tilstedeværelse i blod og bloduttredelse er sett i samme bilde. Hoechst extravasates nesten umiddelbart av blodkar og brukes av de omkringliggende cellene (CI). Dekstran 10 KDa (CII) kan sees i fartøy og svulst interstitium. Dekstran 2 MDa (CIII) kan bli funnet i fartøyer. 40 min etter injeksjon (CIV), dekstran 10 KDa forsvinner fra blodet (CV), og fluorescerende intensiteten av dekstran 2 MDa var også redusert (CVI). Skala bar = 100 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55115/55115fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/55115/55115fig4.jpg"> Figur 4: undersøke skjebnen til chemotherapeutic agenter. (A) en eNOStag-GFP dyr var behandlet IV med nanopartikler og fotografert 24 timer senere. Nanopartikler er fremdeles på skip, med minimal bloduttredelse i svulst interstitium (AI). Nanopartikler er kombinert med TNF, er bloduttredelse observert fra blodet i svulst interstitium (alle). Skala bar = 250 µm. (B) bruke høyoppløselig linser, endothelial cytoplasma (grønn) og kjernen (blå) i en enkelt celle kan gjenkjennes. Skala bar = 50 µm. (C) en eNOStag-GFP dyr ble injisert IV med Doxil-i kombinasjon med TNF, og bildene ble tatt 24 timer senere. Her, bloduttredelse av Doxil-gjorde av fartøyene i svulsten interstitium er åpenbare (CI). En mer detaljert vurdering av individuelle celler (CII) viser at lilla transportøren finnes i cytoplasm (pil), mens den utgitt doksorubicin (rød) er observert i mobilnettet kjernen (pilspiss). Skala bar = 50 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55115/55115fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice at JoVE.com

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Denne protokollen beskriver intravital avbilding av transgene mus uttrykke celle-spesifikke fluorescerende markører. Intravital imaging inneholder en ikke-invasiv metode for høyoppløselig observasjoner i levende dyr bruker implanterbare windows som den mikroskopiske visualiseringen av prosesser er mulig. Denne metoden er spesielt nyttig å studere langsgående prosesser.

Intravital mikroskopi av svulst-assosiert blodkar benytter avansert Dorsal Skinfold vinduet Chambers på transgene fluorescerende mus

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kvantifisere Glomerular permeabilitet i Fluorescent Macromolecules Bruke 2-Photon Mikroskopi i München Wistar rotter

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Construction of Vapor Chambers Used to Expose Mice to Alcohol During the Equivalent of all Three Trimesters of Human Development

Bygging av Vapor Chambers Brukes til Expose Mus til alkohol under tilsvarende alle tre trimester av Human Development

Exposure to alcohol during development can result in a constellation of morphological and behavioral abnormalities that are collectively known as Fetal ...

Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia

Iskemisk skade på kroppsvev i Dorsal skinfold Chamber of Mouse: A Skin Flap modell for å undersøke Akutt Vedvarende Ischemia

Despite profound expertise and advanced surgical techniques, ischemia-induced complications ranging from wound breakdown to extensive tissue necrosis are ...

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

Måling Stigende aortic Stivhet<em&gt; I Vivo</em&gt; I Mus hjelp av ultralyd

We present a protocol for measuring in vivo aortic stiffness in mice using high-resolution ultrasound imaging. Aortic diameter is measured by ultrasound ...

Exergaming in Older People Living with HIV Improves Balance, Mobility and Ameliorates Some Aspects of Frailty

Exergaming i boende eldre med HIV forbedrer balansen, mobilitet og lindrer Noen aspekter av skrøpelighet

Approximately 1.2 million people in the United States live with HIV infection. Medical advancements have increased the life expectancy and this cohort is ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Intramikroskopi og Trombevekten Induksjon i øreflippen av en naken Mouse

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Avansert bildeteknologi av lunge Homing menneskelige lymfocytter i en eksperimentell i Vivo modell av allergiske betennelse basert på lys arks mikroskopi

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Kvantitativ analyse av mobilnettet komposisjon i avansert aterosklerotisk lesjoner av glatt muskel celle avstamning-Tracing mus

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Scratch Migration analysen og rygg Skinfold Chamber for in vitro og in vivo analyse av såret healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...