Name: intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice
Uploaded: 2018-01-19T12:30:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice at JoVE.com

Vi vill tacka Rien van Haperen och Rini de Crom för deras utveckling och donation av eNOSTag-GFP, Joost A.P. Rens för hans tekniskt bistånd med animaliskt arbete och djur vaktmästare för deras hjälp. De mikroskopi utrymmen som används är en del av stadens Erasmus optisk Imaging, och vi vill tacka Personalen på OIC för sin tjänst. Denna studie stöddes av grant DDHK 2000-2224 från holländska Cancerfonden, ”Vereniging Trustfonds” Erasmus University Rotterdam och ”Stichting Erasmus Heelkundig Kankeronderzoek”, och vi tackar ledamöterna i utskotten för deras generösa donation.

Alla djurförsök var gjort i enlighet med nederländsk lag, och protokoll godkändes av kommittén av djur experimenterandet Erasmus MC, Rotterdam, Nederländerna.
1. mottagaren mus
<ol><li>När de transgena möss föds, skärmen djuren för lämpliga genotyp använder standardprocedurerna9. Obs: I detta manuskript presenteras uppgifter som erhållits från en eNOStag-GFP linje9 egenutvecklade och en köpt ROSA-mTmG (lager 007676)10 linje.</li>
	<li>Använda möss som är 12 veckor eller äldre och som är över 20 g.</li>
</ol>2. givare mus
Obs: En tumör fragment för implantation i fönstret dorsala erhålls från en icke-transgena donatordjuret. Beroende på typ av tumör används normala (med syngena tumörer) eller nedsatt immunförsvar (xenograft) möss.
<ol><li>Växer tumörcellerna i ett medium med de lämpliga kosttillskott i kultur kolvar på 37 ° C och 5% CO2.</li>
	<li>Ta bort mediet från cell kolvar, tvätta en gång med 1 x PBS och lossa cellerna med 0,25% trypsin.</li>
	<li>Inaktivera trypsin genom att lägga till cellodlingsmedium. Samla in cellerna, snurra ner vid 1200 x g i 5 min och återsuspendera pelleten i 5 mL PBS.</li>
	<li>Späd ut 20 µL cellsuspension med 20 µL av trypan blå, som fläckar döda celler. Räkna antalet levande och döda celler som använder en hemocytometer; antalet döda celler bör inte överstiga 10%.</li>
	<li>Snurra cellerna igen på 1,200 x g för 5 min och återsuspendera cellpelleten i iskall PBS, högproducerande 1 miljoner celler per 100 µL. transportera cellerna på is till operationssalen.</li>
	<li>Söva djuret med isofluran/O2. Slå på syre och justera flödet till 0,5 mL/min. Justera den isofluran spridare till 3%. Efter några minuter, Placera musen i anestesi kammaren. Obs: Prefill kammaren för att säkerställa att den är redo för användning för att minimera stress.</li>
	<li>
När musen är drogad, föra djuret till operationsbordet värme, hålls vid 37 ° C, och placera nosen i anestesi näsan konen.
	<ol>
<li>Obs: Djuret är ordentligt drogad när ingen reaktion på en footpad nypa noteras.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raka musen för att bättre visualisera injektionsstället. Inokulera med en 0,5 mL insulinspruta; Injicera 100 μl av celler i flanken av musen och tillåta en tumör att utveckla.</li>
	<li>Avliva djuret av cervikal dislokation under narkos som har godkänts av din institutionella djur vård och användning kommittén.  Använda micro sax och pincett, skar upp huden på platsen för tumören och dissekera tumören. Lägg tumören i en petriskål med PBS. Använda micro sax och pincett, skärs tumören i fragment av cirka 1 mm3 (figur 1A-en). Obs: Tumören av givare musen ska vara tillräckligt stor för att ge tillräckligt material, men stora, nekrotiska tumörer bör undvikas. För de flesta tumörer räcker en genomsnittlig diameter av 10 mm.</li>
</ol>3. implantation av fönster kammaren
<ol><li>Utför alla procedurer under aseptiska förhållanden. Autoklav den kirurgiska instrument (figur 1A) och kammare material (figur 1B). Obs: Fönster kammaren används här, med en total vikt på 1,1 g, är gjord av etereterketonplast (PEEK), ett ljus, syntetiska material som är MRI kompatibel. PEEK är 3.4-fold lättare än Titan, som är vanligt förekommande i litteraturen för dessa fönster. Det är resistent mot de flesta kemikalier, är inert, provocera inte immunreaktioner och är robust. Detta fönster är också mindre i design jämfört med tidigare publicerade windows. Möss försedd med detta fönster Visa full kapacitet av rörelse, kan klättra och vinna vikt comparably till möss utan en fönster-kammare. Eftersom djuret kan bita på fönstret, syntetiska windows kan pågå lite kortare jämfört med Titan windows; de är dock lätt att göra och är billig. Dessa särskilda windows görs in-house och kan fås på begäran.</li>
	<li>Lugna mottagarens musen använder inandning anestetika (dvs. isofluran/O2) i en anestesi-kammare. Föra musen till uppvärmd operationsbordet hålls vid 37 ° C och placera nosen i anestesi näsan konen (se steg 2,6). Tillämpa ögonsalva för att undvika torrhet.</li>
	<li>Ta bort håret från hela tillbaka genom rakning och tillämpa hair removal gel. Var noga med att alla gel avlägsnas genom sköljning djuret noga med hand-varmt kranvatten. Torka djuret och rengör huden med 70% etanol. Obs: Rakning förfarandet kan även göras dagen innan fönstret implantation. Grädden behöver avlägsnas noggrant med hand-varmt vatten eftersom detta kan orsaka hudirritation.</li>
	<li>Markera mittlinjen på mus ryggraden med en markör för symmetriska placeringen av kammaren. Flytta musen, dra huden in en flik med mittlinjen som en hopfällbar ställning och ta tag i mitten av lock. Placera fönstret så att toppen av ramen är minst 2 mm under mittlinjen och cirkel fönster Visa området på huden med en markör.</li>
	<li>Använda en skalpell innehavaren/bladet storlek 15 och micro sax, ta bort huden längs den ritade cirkulära linjen. Var noga med att inte skada underliggande fascia. Obs: Detta skapar fönster Visa området på avdelningen där tumören är transplanterade.</li>
	<li>Dra upp den hudveck och använda ett öra hålslag för att stansa hål 1 mm i diameter genom huden, en på endera sidan av visningsområdet (figur 1A-b). Obs: Detta är hål för två bultar fixar fönsterkarmar tillsammans.</li>
	<li>Placera ramen skräddarsydda främre kammaren med bultar (siffror 1B-en, 1B-c) och placera tillbaka ramen (figur 1B-b) på bultarna. Placera nötter (figur 1B-d) på den baksida ramen på bultarna. Obs: Dessa bultar används fixar kamrarna tillsammans mot det hudveck och används senare för att immobilisera kammaren under utvärdering under mikroskopet.</li>
	<li>Dra ut huden 2-3 mm ovanför toppen av ramarna och se till att området transplanterbara fönster Visa matchar området kammare. Plats 23 G nålar genom två små suturen hål (figur 1B, svart pil) överst på ramen. Dra åt muttrarna på bultarna med en mikro skruvmejsel (figur 1A-c) och en fastspänning nålförare att immobilisera nötter. Obs: Vidta försiktighetsåtgärder för att säkerställa att huden inte slås runt bultarna, och dra inte åt för mycket.</li>
	<li>Byt nålar med suturer, börjar längst, fixar ramar mot huden. Gör detta för 5 paren av suturen hål (figur 1B, vita pilen) i ramen.</li>
	<li>Starta musen för att avslöja baksidan av fönster kammaren. Placera en tjock glasbit filler med en diameter på 10 mm och en tjocklek på 0,55 mm (figur 1B-e) och sedan en standard skyddsglaset på 12 mm (figur 1B-f). Säkra dessa med en låsringen (figur 1B-g) i området back-kammare. Obs: Filler glaset hindrar utrymme att öppna mellan fascian och fönstret på framsidan, som används för avbildning.</li>
	<li>Återfukta fönster Visa området där tumören infogas genom att fylla en 1 mL spruta med steril 0,9% NaCl. Låt några droppar falla på Visa området. Ta bort överflödigt saltlösning med steril bomull spets.</li>
	<li>I fascian, skapa en ficka som är stor nog att rymma 1 mm3 tumör fragmentet (figur 1A-a) med en 25 G nål med dess spets är böjd i en 90 ° vinkel (figur 1A-d). Med en nålförare eller Kelly pincett, infoga tumör fragmentet i mitten av transplanterbara fönster Visa området i denna ficka.</li>
	<li>Stäng fönstret Visa området med en standard täcka glas 12 mm och en låsringen. Obs: En luftbubbla kan bilda, men det kommer att försvinna inom timmar.</li>
</ol>4. före och efterbehandling av djuret
<ol><li>Administrera läkemedel för smärtlindring (dvs. 0,05 mg/kg buprenorfin) subkutant som godkänts av din institutionella djur vård och användning kommittén. Låt musen för att återhämta sig från anestesi under en värme-lampa.</li>
	<li>Placera fönster-bärande möss individuellt i en bur och i ett klimat-kontrollerade rum till 32 ° C och över 50% luftfuktighet. Kontrollera att vatten flaskorna är miljö temperatur innan du placerar dem på buren för att förhindra läckage. Använda burar och berikande att tillåta fri rörlighet och tillgång till mat och vatten. Obs: Som kammaren fönster tolereras mycket väl, möss visar normalt beteende. Enskilda bostäder förhindrar skador på fönster kammaren orsakas av andra möss och den hög temperatur/luftfuktigheten förhindrar kyla ner och uttorkning av det hudveck.</li>
	<li>Kontrollera musen regelbundet för att tuggas-off suturer, lösa bultar eller trasiga skyddsglaset. Omedelbart reparera och byta ut när detta händer. En cover av lätta material kan användas för att skydda fönstret.</li>
</ol>5. intravital Imaging
Obs: I den här proceduren multiphoton Mikroskop och lämplig kontroll programvaran används. Här används programpaket som tillhandahölls med Mikroskop. I princip alla programpaket som kommer med ett mikroskop och är tänkt för Mikroskop kontroll och för att fånga bilder kommer suite detta ändamål.
<ol><li>Slå på systemet: PC/Mikroskop, makt till confocal styrenheten, laser power och laser utsläpp. Exempelvis med denna programvara, starta programmet och initiera tabellen Mikroskop (figur 1E-en och 1E-c) genom att klicka på ”initiera tabell”. Slå på systemet och ange det till det läge som gör det möjligt för datorn att styra Mikroskop, xy-bord, z-positionering och Bildinsamling.</li>
	<li>Slå på det fluorescerande ljuset (figur 1E-b). Obs: Detta används för att utvärdera fluorescens bilder genom okulära tillsammans med ljusa fält.</li>
	<li>Växla på skräddarsydda, temperatur-kontrollerad plattform (figur 1 C-c, beskrivs i diskussionen mer i detalj) vid 37 ° C.</li>
	<li>Slå på anestesi enheten med isofluran/O2 (figur 1E-d). Montera anestesi röret på Mikroskop scenen (figur 1 C-e). Installera en klämma på xy-scenen för att fixa anestesi nos lappa.</li>
	<li>Förväg utvärdera djuret för att upprätta utvecklingsstadiet tumör fartyget. Detta beror på hastigheten på tumörtillväxt, men det kan variera mellan enskilda möss.
	<ol>
<li>Lugna musen använder inandning anestetika (isofluran/O2) i en anestesi kammare (se steg 2,6).</li>
		<li>Placera djuret på temperatur-kontrollerad plattform monterad på Mikroskop scenen; Detta förhindrar nedkylning av djuret när det är sövd. Kontrollera att nosen i musen ligger i anestesi konen och tillämpa ögonsalva om utvärderingen kommer att ta längre än 5 min. Obs: För en utvärdering som är längre än 1 h, minska isofluran till 2%.</li>
		<li>Använda kammaren bultarna för att åtgärda (figur 1 C-b, full pilen) kammaren på en skräddarsydd kammare hållare (figur 1 C-a). Skruva denna hållare (figur 1 C-d, streckad pil) till uppvärmd plattformen (figur 1 C-c). Obs: Denna kombination förhindrar rörelse artefakter i fönstret Visa området samtidigt tillåta djuret att andas fritt.</li>
		<li>Se till att rengöra glaset i fönstret Visa området med bomull spets doppad i vatten för att förhindra en suddig bild och störningar som kommer från skräp på utsidan av glaset. Placera den plattform och mus på Mikroskop scenen (figur 1 d). Obs: var noga med att svansen inte fastnar mellan plattformen och Mikroskop scenen.</li>
		<li>Kontrollera visuellt utvecklingsstadiet tumör fartyget med en 10 X objektiv, ljusa-fältet och fluorescerande ljus. Obs: Fluorescerande fartyg ska vara i fokus och blodflödet ska synas med ljusa fält. När blodkärlen syns tydligt, utvärdera etappen av fartyget tumörutveckling. Till exempel avgöra om det är tidigt debuterande angiogenes med tillväxten av tip-cellerna eller en redan etablerade vaskulatur för drogen leverans. Samma djur kan utvärderas igen, och som tumören utveckling är en kontinuerlig process. Flera etapper kan observeras i en enda tumör på samma gång.<ol>
<li>När det inte är möjligt att fokusera på kärlsystemet, ta bort djuret från scenen, låt musen återvinna, och plats djuret åter i ett klimat-kontrollerade utrymme. Kontrollera det igen senare. När musen är klar för utvärdering, fortsätta med processen som beskrivs nedan.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Slå på de confocal lasrarna och Kontrollpanelen genom att klicka på ”Laser” och ”Ctrl panel” i fliken konfiguration Obs: Det rekommenderas att ställa lasereffekten låg, särskilt för Argon laser, för att förhindra blekning, uppvärmning av vävnad och åldrad hud. Kontrollpanelen kan ställas in på personliga preferenser. Vid intravital bildåtergivning med flera fluorophores det rekommenderas att tillämpa följande inställningar: ”smart vinst, 100 V per tur”, ”smart offset, 10% per tur”, ”, medium”, ”X zoomläge, medium”, ”Y-position, medium”, och ”Z position, 100 µm per tur”. Innan imaging, justera förskjutningen för att minimera buller och optimera det signal-brus-förhållandet. Confocal zoom-funktionen möjliggör en högre förstoring utan att ändra objektiv. X, Y och Z-kontroll är nödvändigt att hitta fält av intresse. För intravital mikroskopi, bör Z-positionering vara ca 100 µm per tur eftersom fästingen vävnad utvärderas.</li>
	<li>Klicka på ”förvärv” i fliken förvärva och ändra inställningen till: ”förvärv läge XYZ eller XYZT”, ”Format (512 x 512 eller 1024 x 1024)” och ”Speed (400 eller 200 Hz)”. Klicka på ”hål” och ange det till 1 luftiga enhet. Klicka på ”dubbelriktad X”. Obs: För att optimera bilder, mellan lasereffekt, vinst och pinhole bör finnas en balans, som nämns i diskussionen.</li>
	<li>Vid utvärdering av flera fluorophores, Välj ”sekventiella scan” och ”mellan ramar” att förhindra genomlysningseffekten, som nämns i diskussionen.  Välj ”Line genomsnitt 4” att få en bra minskning av bullret. Obs: Beroende på den inneboende fluorescensen i transgena djuret, andra fluorescerande markörer, gillar dextrans, Hoechst, FITC-BSA, fluorescerande kemoterapeutika eller nanopartiklar utspätt till önskad koncentration i 0,9% NaCl kan vara administreras och bedömas i tumören. Dessa injiceras genom svans eller penis ven.</li>
	<li>Klicka på ”Experiment” i erhållnings-fliken och välj ”nytt” för att göra en ny data bas.</li>
	<li>Utvärdera den djur med, beroende på forskningsfrågan, 10 X, 20 X och 40 X-objektiv objektiv. Genom okulära, hitta en ställning att utvärdera. Obs: Det är bäst att använda torra objektiv med en NA så högt som möjligt, så torr linser har en relativt lång fungerande avstånd och gör inte behovet av nedsänkning vätska. I diskussionen nämns användning av nedsänkning i vatten objektiv.</li>
	<li>Använda en snabb live scan för att hitta rätt gain och offset att förhindra överexponering och optimera det signal-brus-förhållandet. Dessutom bibehålla samma imaging inställningar under och mellan experiment om kvantitativ jämförelse behövs. Obs: Ytterligare överväganden för optimal avbildning nämns i diskussionen. XYZ position och zoom kan slutföras under levande sökningen med hjälp av Kontrollpanelen.</li>
	<li>För att göra en Z-stack, Välj ”Z-stack” i fliken förvärva gör en snabb Z-scan med Z-ställning i Kontrollpanelen och ange början och slutet av sökningen genom att klicka på ”Begin µm” och ”slutet µm”. Ange Z-steg storlek relaterade till pinhole storlek.</li>
	<li>Fånga bilder genom att klicka på ”Starta”. Obs: Som intravital mikroskopi handlar om kinetik och därför dynamiska processer följs, en kompromiss mellan den tid som krävs för att förvärva en bild och hastigheten på de biologiska processerna måste göras. Ju högre upplösning, är de mer fluorescerande kanalerna i allmänhet skannas och ju större skanning fältet, fler pixlar per bild. Tjockare Z-stackar översätta till en längre imaging tid. En längre imaging tid ökar chansen att rörelse artefakter och kan orsaka vävnadsskada avbildas. Tänk också på att skanna vissa fluorescerande etiketter orsakar blekning och toxicitet, som påverkas av lasereffekten och koncentrationen av ackumulerade färgämnet.</li>
	<li>Efter skanning Z-stacken kan snabbt utvärderas genom att klicka på ”maximal projektion”. Z-stacken sparas automatiskt i databasen och kan döpas.</li>
</ol>6. dataanalys
<ol><li>Beroende på den ursprungliga frågeställningen, använda en av flera program, till exempel ImageJ5, Matlab11eller Amira, för dataanalys. Korrekt analys är avgörande.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17, 545-580 (2003).</li><li>Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+hallmarks+of+cancer+in+living+mice.">Imaging hallmarks of cancer in living mice.</a> Nat Rev Cancer. 14, 406-418 (2014).</li><li>Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+tumors.">In vivo imaging of tumors.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), (2010).</li><li>Palmer, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+optical+molecular+imaging+and+analysis+in+mice+using+dorsal+window+chamber+models+applied+to+hypoxia,+vasculature+and+fluorescent+reporters.">In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent reporters.</a> Nat. Protocols. 6, 1355-1366 (2011).</li><li>Seynhaeve, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+alpha+mediates+homogeneous+distribution+of+liposomes+in+murine+melanoma+that+contributes+to+a+better+tumor+response.">Tumor necrosis factor alpha mediates homogeneous distribution of liposomes in murine melanoma that contributes to a better tumor response.</a> Cancer Res. 67, 9455-9462 (2007).</li><li>Schiffelers, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-targeted+liposomes+directed+against+pathological+vasculature.">Ligand-targeted liposomes directed against pathological vasculature.</a> J Liposome Res. 12, 129-135 (2002).</li><li>Straetemans, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+receptor+gene+therapy+in+human+melanoma-bearing+immune-deficient+mice:+human+but+not+mouse+T+cells+recapitulate+outcome+of+clinical+studies.">T-cell receptor gene therapy in human melanoma-bearing immune-deficient mice: human but not mouse T cells recapitulate outcome of clinical studies.</a> Hum Gene Ther. 23, 187-201 (2012).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li><li>van Haperen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+endothelial+nitric+oxide+synthase+fused+to+green+fluorescent+protein+in+transgenic+mice.">Functional expression of endothelial nitric oxide synthase fused to green fluorescent protein in transgenic mice.</a> Am J Pathol. 163, 1677-1686 (2003).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Manzoor, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+limitations+in+nanoparticle+drug+delivery:+triggered,+intravascular+release+to+improve+drug+penetration+into+tumors.">Overcoming limitations in nanoparticle drug delivery: triggered, intravascular release to improve drug penetration into tumors.</a> Cancer Res. 72, 5566-5575 (2012).</li><li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice.">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nat Protoc. 5, 1518-1534 (2010).</li><li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo.">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> J Vis Exp. , e50546 (2013).</li><li>Hobbs, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+transport+pathways+in+tumor+vessels:+role+of+tumor+type+and+microenvironment.">Regulation of transport pathways in tumor vessels: role of tumor type and microenvironment.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4607-4612 (1998).</li><li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumours.">Drug penetration in solid tumours.</a> Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).</li><li>Koning, G. A., Eggermont, A. M., Lindner, L. H., Hagen, t. e. n., L, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperthermia+and+thermosensitive+liposomes+for+improved+delivery+of+chemotherapeutic+drugs+to+solid+tumors.">Hyperthermia and thermosensitive liposomes for improved delivery of chemotherapeutic drugs to solid tumors.</a> Pharm Res. 27, 1750-1754 (2010).</li><li>Seynhaeve, A. L., Eggermont, A. M., ten Hagen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF+and+manipulation+of+the+tumor+cell-stromal+interface:+&amp;#34;ways+to+make+chemotherapy+effective&amp;#34;.">TNF and manipulation of the tumor cell-stromal interface: &amp;#34;ways to make chemotherapy effective&amp;#34;.</a> Front Biosci. 13, 3034-3045 (2008).</li><li>Brouckaert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha+augmented+tumor+response+in+B16BL6+melanoma-bearing+mice+treated+with+stealth+liposomal+doxorubicin+(Doxil)+correlates+with+altered+Doxil+pharmacokinetics.">Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics.</a> Int J Cancer. 109, 442-448 (2004).</li><li>Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., ten Hagen, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+low-dose+tumor+necrosis+factor-alpha+to+systemic+treatment+with+STEALTH+liposomal+doxorubicin+(Doxil)+improved+anti-tumor+activity+in+osteosarcoma-bearing+rats.">Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats.</a> Anticancer Drugs. 16, 667-674 (2005).</li><li>Gabizon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+circulation+time+and+enhanced+accumulation+in+malignant+exudates+of+doxorubicin+encapsulated+in+polyethylene-glycol+coated+liposomes.">Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes.</a> Cancer Res. 54, 987-992 (1994).</li><li>Bergers, G., Benjamin, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorigenesis+and+the+angiogenic+switch.">Tumorigenesis and the angiogenic switch.</a> Nat Rev Cancer. 3, 401-410 (2003).</li><li>Eilken, H. M., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+endothelial+cell+behavior+in+sprouting+angiogenesis.">Dynamics of endothelial cell behavior in sprouting angiogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 22, 617-625 (2010).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer.">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> J Vis Exp. , e50088 (2013).</li><li>van Vliet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MR+angiography+of+tumor-related+vasculature:+from+the+clinic+to+the+micro-environment.">MR angiography of tumor-related vasculature: from the clinic to the micro-environment.</a> Radiographics. 25, S85-S97 (2005).</li><li>Dicheva, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+thermosensitive+liposomes:+a+novel+dual+targeted+heat-triggered+drug+delivery+approach+for+endothelial+and+tumor+cells.">Cationic thermosensitive liposomes: a novel dual targeted heat-triggered drug delivery approach for endothelial and tumor cells.</a> Nano Lett. 13, 2324-2331 (2013).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+intratumoral+nanoparticle+extravasation+and+penetration+by+mild+hyperthermia.">Improved intratumoral nanoparticle extravasation and penetration by mild hyperthermia.</a> J Control Release. 167, 130-137 (2013).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Tumör och fartyget tumörutveckling, samt tumör terapeutiska effekter, är mycket dynamiska processer, är intravital utvärdering ett elegant verktyg för att göra en korrekt bedömning av dessa processer på ett sätt som tid - och rumsliga-beroende. Med den ökande tillgången till levande cell markörer, skapandet av transgena djur och befordran av imaging modaliteter, blir intravital imaging mer och mer populärt. Även om histologi används fortfarande rutinmässigt, och en mängd markörer kan användas för att identifiera celler och strukturer, har vävnad snittning nackdelar när du undersöker dynamiska processer. Vävnad dissektion krävs, ge endast statisk information; fixering påverkar vävnad kvalitet; och skivning skadar cellulära interaktioner. Också, när du undersöker dynamiska processer, vävnad dissektion på olika och ofta förmodade, tidpunkter kräver en stor mängd djur. Med intravital imaging, kan XYZ rumsliga dimensioner och den extra dimensionen tid utvärderas på samma djur, gör den korrekt placering av olika spelare möjligt i tid och rum. Därför optimala tidpunkter är inte missat, och antalet djur som används per experiment har minskat avsevärt. För det andra kan-fönstret tid etablerat med intravital utvärdering extrapoleras för att optimera vävnad extraktion. För det tredje, önskad långt fartyget tillväxt kan identifieras intravitally och målat som en helhet-mount vävnad.
Intravital designen nämns i detta manuskript använder en kombination av transgena djur uttrycker en fluorescerande etikett i endotelceller, en modifierad dorsala skinfold kammare modell och en dedikerad multiphoton-confocal mikroskopet.
Endotelceller gå igenom ett antal etapper21,22 under angiogenes, och dessa stadier kan ofta ses samtidigt i en tumör. Använder eNOSTag-GFP mus linjen, enskilda endotelceller kan följas, och även filopodia dynamics kan spåras. Det är därför en bra modell för att studera fartyget utveckling intravitally. Beroende på de redan-nu inneboende etiketterna, kan injicerbara fluorescerande agenter användas att bedöma lumen bildandet, blodflödet, extravasering och blod clearance. Musen är avbildade kontinuerligt i upp till 5 h. Långsiktig utvärdering av ett djur är genomförbart när flera försiktighetsåtgärder avseende bedövning av djuret tas, som har beskrivits tidigare23. Som denna forskning är fokuserad på cancer, var tumörer vävnad eller celler implanteras. Dock experimenterat vi också med fotbenen och embryonala lungor. Dock är tillväxttakten i vävnaden under studien begränsande, som efter ett par veckor, börjar huden att återföds ständigt, vilket kan vara ett problem med långsamt växande tumörer eller vävnader.
Under fasen för validering i dorsala skinfold fönster kammare ändrades avsevärt jämfört med klassisk modell4. Ramarna är tillverkade av autoklaverbart syntetiskt material och är lätta och små, med ett stort fönster-Visa område. Kroken för låsringen (figur 1Bg, vita pilspets) används endast för enkel borttagning av ringen. Hållare ringar utan krokar kan användas när dessa störa imaging. Huden sträcks inte för mycket, lossa uppstår inte i denna modell, och infektioner ses sällan. Dessa modifieringar minska animaliskt obehag och förfina djur förfarandet avsevärt. Också, metalldelarna kan lätt avlägsnas när imaging tumören med hjälp av MRI24.
Alla Mikroskop kan antas till intravitally bild dorsala skinfold chambers. Det viktigaste kravet är det tillgängliga utrymmet mellan Mikroskop scenen och objektivet. En viktig aspekt som påverkar imaging är motion. För att förhindra rörelse artefakter, ska en plattform som passar i tabellen Mikroskop (efter avlägsnande av alla skär) och stöder musen användas. Det är inte nödvändigt att hindra musen när det är under narkos, och det är bättre att låta musen andetag fritt. Men fönstret är bultad på plattformen, vilket ger optimal fixering av synfältet (dvs tumören är synliga genom fönstret kammaren). Plattformen är uppvärmd med en elektronisk värmedyna, som använde för djurens värme. Denna plattform var gjord in-house och detaljerna kan erhållas på begäran. En högupplöst objektiv är en nödvändighet när du utvärderar intracellulära processer och gör det möjligt att diskriminera mellan cytoplasman och kärnan. Användning av en avsmalnande lins med en bra optisk upplösning (hög NA) men en relativt långa arbetsavstånd (helst 2 mm eller högre) rekommenderas. Begränsningen i imaging är genomträngningsdjupet och fluorescerande intensiteten i etiketterna. Dessutom måste fotoblekning, fototoxicitet och mättnad undvikas under imaging.
Här, användes en integrerad confocal-multiphoton och en confocal mikroskopet. Multiphoton är upprätt, medan de confocal är en inverterade Mikroskop. Fördelen med ett upprätt Mikroskop är lätt användningen av nedsänkning i vatten linser. Dessa linser har en hög NA och en lång arbetsavstånd, även vid en hög (t.ex. 20 eller 40 X) förstoring. Specifikt, rekommenderas det att skaffa en 20 X NA 1.0 nedsänkning i vatten lins, som säljs av flera företag. Vara medveten om att när nedsänkning linser används, den objektiv och nedsänkning vätska behöver värmas till 37 ° C. För de bästa bilderna, det rekommenderas att använda optimala confocal inställningar (dvs hål på 1 luftiga enhet, laser power så låg som möjligt, vinst inte för högt (särskilt om vinsten introducerar buller), linjehastighet på maximum och ingen genomsnitt skanningar). Överexponering, mättnad och skillnaden i intensitet mellan bilderna äventyra datakvalitet. Det rekommenderas att förhindra mättnad och överexponering. Detta kan kringgås genom att förvärva bilder vid olika vinst inställningar. Ändra vinsten är det enklaste sättet att ändra bildens ljusstyrka. Om det behövs kan lasereffekten justeras. För att standardisera bildkvaliteten, kan bilder med en fast fluorescensintensitet användas. Man måste hålla i åtanke att även när mikroskopet ställs in optimalt, bildkvalitet bestäms i stor utsträckning kvaliteten på fönster plenisalen och vävnad
När du skannar flera fluorescerande markörer samtidigt, måste genomlysningseffekten, där en fluorophore detekteras i kanalen av en annan, undvikas. Undvika genomlysningseffekten genom att använda en kombination av fluorophores med minimal överlappande spectra och sekventiell skanning mellan ramar. De bilder som presenteras här har skannats med hjälp 3 sekventiell skanningar (spår 1: GFP, DID eller fluor647 med 488 och 633 laser; spår 2: rodamin, Doxil eller mTomato med 543 laser; och spår 3: Hoechst med 405 laser).
Här visas möjligheten att utvärdera flera skeden av fartyget tumörutveckling, tip cell dynamics, lumen bildandet, extravasering och kärlskador. Använder linjen eNOStag-GFP, upptäcks tumör områden med förstörda vaskulär säng lätt av granulerad cellulära rester fortfarande uttrycker GFP. Ingen injicerbara agent upptäcktes i dessa områden, som anger bristen på flödet. Detta innebär att administreras kemoterapeutika når inte dessa områden heller. Fartyg förstörelse kan dock också vara ett terapeutiskt resultat. Före utvärdering av tumören, att kontrollera för förbehandling fartyget förstörelse, är en förutsättning för korrekta terapeutiska utvärdering och kan utföras enkelt med denna experimentella design.
Det finns en uppsjö av möjligheter som intravital mikroskopi kan användas, och detaljerad diskussion är utanför ramen för denna publikation. För att ge en kort inblick, inkludera möjliga tillämpningar studier på ackumulation av kemoterapeutika i tumörvävnad, utveckling av fartyg (t.ex. antalet fartyg, grenar och korsningar) och blodflödet, cell-cell interaktioner, cell inriktning, och intracellulära bearbetning, samt exempel på ovan nämnda och visas här. Som analysen baseras på fluorescens, vara medveten om intensitet svängningar på grund av fönstret eller vävnad. Också, som tumörvävnad är relativt tjock, fluorescens från ovan eller under planet synpunkt inverkar på signalen i bilden. Det är bäst att kombinera den kvantitativ bildanalys med objektiva mätningar. Exempelvis om intresserad läkemedelskoncentrationen, ta bort tumörvävnad från fönstret efter intravital mikroskopi och bestämma drogen innehåll med med HPLC för att jämföra med de confocal bilderna.
Utvärdering av tumör svar kan utföras som väl med denna modell, men med vissa försiktighetsåtgärder. Man måste inse att tumörer också växa inåt, in i huden. 3D-mått kan göras om penetrationen är tillräckligt djup för att täcka hela tumören. I sådana fall bör mån färgämnen användas. Fönster kammaren som beskrivs här erbjudanden med tumörer i huden miljö, och det är viktigt att påpeka att fönstret håller en temperatur något lägre än kroppstemperaturen normal mus. Därför är det bäst att studera tumörer i inställningen för just micro miljö för att bekräfta intravital studier med den dorsala skinfold fönster kammare. Ännu viktigare, den dorsala skinfold kammare erbjuder inblick i kineticsen av processer och mekanismer, som ger en instrumental grund för förbättring av terapi. Dessutom kan extra information om biodistribution och farmakokinetik erhållas. Klassiskt, utförs dessa biodistribution studier av behandling av tumör-bärande djur och dissekera tumörer/organ för att mäta drog upptag. Använder denna intravital modell, kan intratumoral platsen för ett läkemedel (dvs intravaskulär, intratumoral, intracellulära eller kärnavfall) ges5,25,26. Är inte bara platsen för drogen avslöjade, men också tid fönster-av-möjlighet för mest optimala upptaget.
Med hjälp av experimentell design som beskrivs i denna artikel, kan ett brett utbud av parametrar utvärderas i en temporal och spatial inställning. Specifikt, visar här vi att intravital mikroskopi ger viktiga insikter i dynamiken i fartyget tumörutveckling och terapeutiskt svar.

Även om in vitro- studier aktivera högupplösta kinetiska avbildning av processer, aktiverar i vitro experiment inte utvärdering i rätt sammanhang. Exempelvis kan inte samspelet mellan tumörceller med stromaceller fack eller drogen leverans och distribution inuti en tumör studeras i en kultur plattan. Djurmodeller används därför för att efterlikna människans fysiologi och patologi. Men är den längsgående avbildning av processer, särskilt på en subcellulär upplösning, utmanande. Molekylär imaging metoder, såsom magnetisk resonanstomografi (MRT), single-photon utsläpp beräknas tomography (SPECT) och positronemissionstomografi (PET), har god penetration djup men saknar upplösning eller misslyckas att illustrera anatomiska strukturer. Optisk imaging ger hög upplösning och möjliggör bildtagning av strukturer, men det åtföljs av fattiga till minimal penetration1. Tillämpningen av intravital mikroskopi i kombination med fönster kammare tekniker, såsom en dorsal skinfold eller buken fönster, möjliggör högupplöst avbildning i vivo2,3,4. Denna teknik har distinkta fördelar, som gör det möjligt för längsgående imaging över timmar och även dagar, för avbildning av processer i rätt sammanhang (t.ex. cell-cell interaktioner i avbildad vävnaden) och för beslut vid optisk gränserna för avancerade confocal och multiphoton Mikroskop.
Införandet av transgena djur med cell - eller protein-specifika fluorescerande etiketter öppnar en uppsjö av möjligheter för i vivo och ex vivo experimenterande. För instans, cell-cell interaktioner, produktionen av proteiner och svaret på manipulation eller terapi kan studeras modeller i vivo med hjälp av dessa5,6,7,8. Ännu viktigare, position i tid och plats kan bestämmas med korrekt imaging utrustning och metodik. Här, intravital microscopyen djur uttrycker en endothelial markör i kombination med injicerbara medel i en tumör som implanteras i en modifierad dorsala skinfold fönster avdelningen presenteras.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1145</td>
			<td>Supplemented with 10% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-versene (EDTA)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161E</td>
			<td>Make a 0.1% solution in PBS, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window frames</td>
			<td>Costum made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filler glass 10 mm, 0.55 mm</td>
			<td>Abrisia technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass 12mm, #1 thickness</td>
			<td>Thermo Scientific/VWR</td>
			<td>631-0713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hear removal gel (veet)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for sensitive skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorfine hydrochloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>use 0.05 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia unit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green</td>
			<td>BD</td>
			<td>324824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 23G 1 1/4&#34;</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 25G 5/8&#34;</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures silkan 0.7</td>
			<td>Braun</td>
			<td>1134019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuts</td>
			<td>Jeveka</td>
			<td>934 A2 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolts</td>
			<td>Jeveka</td>
			<td>84 A2 1 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope + software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated temperature controlled platform</td>
			<td>Costum made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window holder</td>
			<td>Costum made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D7139</td>
			<td>100 &#181;g/mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D22914</td>
			<td>100 &#181;g/mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>25 &#181;g/mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pegulated nanoparticles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ref 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS AF Software</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice

Tumör och fartyget tumörutveckling, samt tumör svar på therapeutics, är mycket dynamiska biologiska processer. Histologi ger statisk information och är ofta inte tillräckligt för en korrekt tolkning. Intravital utvärdering, där en process följs i tid, ger extra och ofta oväntad information. Med skapandet av transgena djur uttrycka-specifika markörer och levande cell spårämnen, förbättringar av bildåtergivningsutrustning och utvecklingen av flera imaging kammare, har intravital mikroskopi blivit ett viktigt verktyg för att bättre förstå biologiska processer. Detta dokument beskriver en experimentell design för utredning av fartyget tumörutveckling och terapeutiska effekter på ett rumsliga och tidsmässiga sätt. Med denna setup, kan scenen av fartyget utveckling, tip-cellen och lumen bildandet, blodflödet, extravasering, etablerade vaskulär säng och vaskulär förstörelse visualiseras och följt. Dessutom terapeutiska effekter, intratumoral öde, och lokalisering av kemoterapeutiska föreningar kan också följas.

Det viktigaste attributet för intravital imaging är den längsgående visualiseringen av cellulära processer utan invasiv intervention. För detta används transgena djur uttrycker en konstitutiv eller inducerbara fluorescerande markör i celler av intresse. Figur 2 illustrerar uttrycket av fluorescerande etiketter i eNOStag-grönt fluorescerande protein (GFP)9 och Rosa-mTmG mus linjer10. Den eNOStag-GFP är en mus-linje som producerats internt med en stympad eNOS gen som en tagg för god Jordbrukarsed. Ännu viktigare, eNOS uttrycks mycket i endotelceller och god Jordbrukarsed signalen syns tydligt i th eGolgi och cellulära membran (figur 2A). Rosa-mTmG möss har en membran-riktade tvåfärgad fluorescens Cre reporter allel. Denna linje uttrycker mTomato fluorescens i utbredd celler och mGFP i Cre recombinase-uttryckande celler och används kraftigt för lineage tracing. Som en tumör bit transplanteras från en icke-transgena givare, röd fluorescens uttrycks huvudsakligen av stromal delar i tumören (t.ex. i membranet i vaskulära celler, cirkulerande celler, infiltrerat blodkroppar och tumör-associerad fibroblaster (figur 2B)).
Bildandet av blodkärl är hårt reglerad, och en utmärkt modell för att studera detta är den utveckla retina12,13. Tumörtillväxt fartyget är också en kinetic process som liknar i princip retinala kärl utveckling. Dock tumören fartyg saknar organisation och, som en tumör kontinuerligt remodeling, så är den tumör-associerad kärlsystemet. Detta kan ha sina fördelar när du använder tumören som angiogena modell, som alla utvecklingsstadier fartyget kan ofta hittas i samma tumören samtidigt. Dessa inkluderar en endothelial groning front växer till en un-vaskulariserad del av tumören (figur 2 c); skadat fartyg (figur 2D); och en etablerad vaskulär säng (figur 2E-jag) med mogna, grenade fartyg (Figur 2E-II). Men, angiogena endothelial celler kan också hittas i dessa områden. När stimuleras av angiogena stimuli, ett endotelceller sticker filopodia (Figur 2E-III) och kan avancera i en tip cell, använda dessa filopodia för scanning och riktad migration (Figur 2E-IV). Denna spets cell migrerar till den tumör interstitium och följs av att dela stjälken celler. En enda endothelial tip-cellen har flera filopodia expanderar, tillbakadragande och förnya när som helst, och kan spåras med hjälp av intravital mikroskopi (figur 2F).
För det andra kan intravital mikroskopi användas för att bestämma lumen bildas en angiogena framtill, blodflödet i hela tumören, och extravasering. Beroende på redan-nu inneboende fluorescerande signaler i djur, kan olika fluorescerande föreningar administreras. Blodflödet och extravasering kan visualiseras med Hoechst, fluorescerande dextrans eller FITC-BSA. För utökade studier på blod flöde och partikel extravasering, lång omsättning fluorescently märkt pegylerat nanopartiklar av 100 nm kan användas. Mer information om utarbetandet av dessa nanopartiklar, finns en tidigare publikation5. Anställningen av dessa föreningar demonstreras i figur 3. De endothelial tip-cellerna i en Rosa-mTmG mus kan ses tydligt invaderar tumörvävnad. Funktionella blodflödet demonstreras av den lila fluorescensen av systemiskt injicerade nanopartiklar i lumen av vaskulär rör (figur 3A-jag). Nanopartiklar nå nära endothelial tip-cellerna som illustrerar bildandet av en lumen i området stjälk cellen (Figur 3A-II). Leverans av systemiskt administrerade kemoterapeutika beror på en funktionell vaskulatur för att nå den tumör interstitium, och som visas i figur 3B, injicerbara medel, oberoende av deras storlek, tränga inte utrymmen med förstörda kärl, komprimerat fartyg eller fartyg med blod stasis.
I de flesta organ, endothelial slemhinnan bildar en funktionell barriär mellan blod och underliggande vävnad, och passage av molekyler är hårt reglerad. Tumör-associerad kärlsystemet, är dock känt att vara läckande och porstorlek cut-off beror mycket på den tumör typ14. Lysrör-konjugerad dextrans med olika storlekar kan injiceras för att bedöma blodflöde, permeabilitet och extravasering. Hoechst (615 Da) diffunderar snabbt i tumörvävnad och tas upp av omgivande celler (figur 3 c-jag). Kort efter injektionen, dextran 10 KDa (figur 3CII) och 2 MDa (Figur 3 C-III) finns i blodet. Dock dextran 10 KDa syns också i den tumör interstitium, som anger genomträngligheten av endothelial foder för mindre molekyler, som är en funktion som tillskrivs tumör fartyg. 40 min efter injektion (Figur 3 C-IV), dextran 10 KDa rensas från blodet (Figur 3 C-V) och dextran 2MDa fluorescerande intensitet är minskade också (Figur 3 C-VI). Stora dextrans finns dock inte i den tumör interstitium, visar en brist på permeabilitet för stora molekyler inom denna tidsram.
Tumör patofysiologi, med dess mycket prolifererande nekrotisk och un-vaskulariserad områden, kan vara ganska informativ när tumören som en angiogena modell. Men utgör detta ett problem för effektiv behandling och utredning. Tumör-associerad vaskulatur heterogenitet orsakar en heterogen fördelning av administrerade läkemedel, lämnar hela områden drogfri-15. För att förbättra drogen leverans, flera strategier kan vara tillämpad15,16,17, och terapeutiska progression kan undersökas med hjälp av denna intravital design. Den tumör-associerad vaskulatur kan manipuleras med vasoaktiva medel för att förbättra drogen leverans17. Resultaten av tumör fartyget manipulation med tumör tumörnekrosfaktor alfa (TNF) som en vasoaktiva medel i kombination med Doxil, den inkapslade liposomal beredningen av doxorubicin, som kemoterapeutiska medel presenteras i detta manuskript5, 18 , 19. i motsats till dextrans, pegylerat nanopartiklar är gjorda för att cirkulera i flera timmar, om inte dagar, i blodcirkulationen20.
Som tidigare nämnts, kan området tumör vara pre skannade att identifiera de rätta tumör områdena beroende på forskningsfrågan. Drogen öde kan utvärderas i områden med en funktionell vaskulatur kontra områden med en redan skadad vaskulär säng (inga data anges). För att undersöka ödet av kemoterapeutiska medel utan cytotoxiska inblandning, nanopartiklar med samma sammansättning som det terapeutiska medlet kan användas som en modell drog. Djurets eNOStag-GFP var behandlade i.v. med dessa nanopartiklar och avbildas 24 h senare. Nanopartiklar var fortfarande närvarande i kärlsystemet, med minimal extravasering till den tumör interstitium (figur 4A-jag). När nanopartiklar gavs i kombination med TNF, observerades dock extravasering från blodbanan till den tumör interstitium (Figur 4A-II), ökad intratumoral drogen leverans. Med hjälp av högupplösta objektiv, kan den intracellulära lokaliseringen av en förening kännas igen, som visas här av kärnvapen var Hoechst i gröna endothelial celler och celler i tumören interstitium (figur 4B). Dessutom som många kemoterapeutika, som doxorubicin, intercalate med DNA, kan lokalisering av dessa föreningar utvärderas. Doxorubicin har röd fluorescerande egenskaper och nanocarrier kan märkas med, exempelvis tetramethylindotricarbocyanine perklorat (gjorde). Djurets eNOStag-GFP var injiceras i.v. med Doxil-gjorde i kombination med TNF, och bilder togs 24 h efter behandling. Doxil-extravasering av blodkärlen och togs upp av omgivande tumörvävnad (figur 4 c-jag). En mer detaljerad utvärdering av enskilda celler (Figur 4 C-II) visade att flygbolaget kan hittas i cytoplasman, medan släppt doxorubicin observerades i cellulära kärnan.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55115/55115fig1.jpg"> Figur 1: instrument, dorsala skinfold kammare, och utrustning installationen behövs för metoden. (A) tumör fragment (en) och kirurgiska instrument som krävs för implantation. Standardiserade instrument är ett öra hålslag (b), en micro skruvmejsel (c) och en böjd nål (d). (B) dorsala skinfold fönster kammare. Fram (a) och bak (b) fönster (pil: hål för suturer; pilspets: hål för bultar), 2 bultar (c), 2 st muttrar (d), 1 filler glas (e), 2 lock glas (f) och 2 behålla ringar (g). Spårringar utan krokar (vit pilspets) kan också användas när det behövs. (C) skräddarsydda kammare innehavaren a, bultar för i kammaren-att-kammare innehavaren b, temperatur-kontrollerad plattform (c), bultar för att säkra att kammaren innehavaren den plattform (d) och hållaren med anestesi tube (e). (D) djur monterad i hållaren kammare på plattformen. En B16BL6 tumör (pil) syns i fönstret Visa området. (E) utrustning som behövs för intravital utvärdering. Dator med imaging och Mikroskop kontroll programvara (a) standard fluorescerande ljus (b) och mikroskopet. En multiphoton confocal var används (c) med en anestesi (d). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55115/55115fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55115/55115fig2.jpg"> Figur 2: inneboende fluorescens av transgena djur. Alla bilder som visas här är Z-stack projektioner mellan 50 och 70 µm tjock. (A) i eNOSGFP-taggen raden, GFP uttrycks i Golgi (asterisk) och cellmembranet (pil) av endotelceller. Skalstapeln = 100 µm. (B) Intratumoral redovisning av mTomato i Rosa-mTmG linjen återfinns huvudsakligen i cellmembranet av vaskulär (pil) och blodkroppar (asterisk). Skalstapeln = 100 µm. (C) A projektion av en växande angiogena front till un-vaskulariserad tumör. Skalstapeln = 100 µm. (D) A projektionen av del av tumören med etablerade och skadat fartyg (asterisk). (E) en projektion av etablerad tumör vaskulatur (EI) visar mogen fästing fartyg (EII); angiogena endothelial tip-cellerna med filopodia (EIII, pilspets); och en mogen fartyg, från vilken en enda endotelceller sträcker sig en filopodium (EIV, pilspets) in interstitium. Skalstapeln = 100 µm. (F) förflyttning av filopodia, följde för 1 h. Varje 15 min, togs en Z-stack; en maximal projektion presenteras här. Filopodia utökar (vit pil), stillastående (=), SRL-block (röd pil), eller helt försvinna (-). Skalstapeln = 25 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55115/55115fig2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/55115/55115fig3.jpg"> Figur 3: administrering av injicerbara etiketter att illustrera extravasering och blodflöde. (A) A Rosa mTmG mus injicerades med lila fluorescerande nanopartiklar och en Z-stack av en invaderande tip cell främre togs 10 min senare (AI). En projektion visar att mest endothelial groddar har en funktionell lumen (AII, pil). Endast sällan kan endothelial groddar ses utan flöde (AII, pilspets). Skalstapeln = 250 µm. (B) denna Z-stack projektion visar en förstörda tumör fartyget område i ett eNOStag-GFP djur före behandling (BI). Djuret injicerades med nanopartiklar (lila, BII) och Hoechst (blå, BIII). Nanopartiklar och Hoechst når inte förstörda områden, indikeras av granulerad cellfragment som fortfarande uttrycker GFP. Skalstapeln = 250 µm. (C) en eNOStag-GFP mus injicerades med två dextrans i olika storlekar (röd = Dextran 2 MDa; lila = dextran 10 KDa) och Hoechst (blå = 615 Da), och single-plane bilder presenteras här. 10 min efter injektion, närvaro i blodet och extravasering ses i samma bild. Hoechst extravasates nästan omedelbart ur blodkärlen och tas upp av de omgivande cellerna (CI). Dextran 10 KDa (CII) kan ses i fartyg och i den tumör interstitium. Dextran 2 MDa (CIII) kan hittas i kärlen. 40 min efter injektion (CIV), Dextran 10 KDa försvinner från blodet (CV) och fluorescerande intensiteten av Dextran 2 MDa var också minskat (CVI). Skalstapeln = 100 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55115/55115fig3large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/55115/55115fig4.jpg"> Figur 4: utreda ödet av kemoterapeutika. (A), ett eNOStag-GFP djur var behandlade i.v. med nanopartiklar och avbildas 24 h senare. Nanopartiklar är fortfarande närvarande i fartyg, med minimal extravasering i den tumör interstitium (AI). När nanopartiklar kombineras med TNF, observeras extravasering från blodet in i tumören interstitium (AII). Skalstapeln = 250 µm. (B) använda högupplösta linser, endothelial cytoplasman (grön) och kärnan (blå) i en enskild cell kan kännas igen. Skalstapeln = 50 µm. (C), ett eNOStag-GFP djur var injiceras i.v. med Doxil-gjorde i kombination med TNF, och bilder togs 24 h senare. Här, extravaseringen av Doxil-gjorde av fartygen i tumören interstitium är uppenbara (CI). En mer detaljerad utvärdering av enskilda celler (CII) visar att lila transportören kan hittas i cytoplasman (pil), medan den släppta doxorubicin (röd) observeras i cellulära kärnan (pilspets). Skalstapeln = 50 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55115/55115fig4large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice at JoVE.com

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Det här protokollet beskriver den intravital avbildning av transgena möss uttrycker-specifika fluorescerande markörer. Intravital imaging ger en icke-invasiv metod för högupplösta observationer i levande djur med implanterbara windows genom vilka mikroskopiska visualisering av är möjligt. Denna metod är särskilt användbar för att studera längsgående processer.

Intravital mikroskopi av tumör-associerad vaskulatur använder avancerade dorsala Skinfold fönster Chambers på transgena fluorescerande möss

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kvantifiering glomerulär permeabilitet av fluorescerande makromolekyler Använda 2-foton mikroskopi i München Wistarråttor

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Construction of Vapor Chambers Used to Expose Mice to Alcohol During the Equivalent of all Three Trimesters of Human Development

Konstruktion av Vapor Chambers används för att exponera Möss till alkohol under motsvarande för alla tre trimestern av mänsklig utveckling

Exposure to alcohol during development can result in a constellation of morphological and behavioral abnormalities that are collectively known as Fetal ...

Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia

Ischemisk Tissue Skada i Dorsal skinfold avdelning Mus: En Skin Flap modell för att undersöka Akut Ihållande Ischemi

Despite profound expertise and advanced surgical techniques, ischemia-induced complications ranging from wound breakdown to extensive tissue necrosis are ...

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

Mätning Stigande Aorta Styvhet<em&gt; In Vivo</em&gt; I möss med ultraljud

We present a protocol for measuring in vivo aortic stiffness in mice using high-resolution ultrasound imaging. Aortic diameter is measured by ultrasound ...

Exergaming in Older People Living with HIV Improves Balance, Mobility and Ameliorates Some Aspects of Frailty

Exergaming i äldre personer som lever med HIV förbättrar balansen, rörlighet och förbättrar vissa aspekter av Frailty

Approximately 1.2 million people in the United States live with HIV infection. Medical advancements have increased the life expectancy and this cohort is ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Intravital mikroskopi och trombos induktion i örsnibben av en hårlös mus

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Avancerade Imaging av Lung Homing mänskligt lymfocyter i en experimentell i Vivo modell av allergisk Inflammation baserat på ljus-ark mikroskopi

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Kvantitativ analys av cellulära sammansättningen i avancerade aterosklerotiska lesioner av glatt muskulatur Cell härstamning-Tracing möss

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Scratch migration assay och dorsal skinfold kammare för in vitro-och in vivo-analys av sårläkning

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...