Name: open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy
Uploaded: 2017-01-18T14:00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.

1. إعداد Multiwell لوحة صفيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل من 75 ميكرومتر الكومارين 6 في الإيثانول (τ ~ 2.43 م) لقياس مرجعية لتمكين تحديد ر 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 150،000 خلايا كوس إلى أربع آبار لوحة 6 جيدا والسماح لإرفاق بين عشية وضحاها في مستنبت (انظر قائمة المواد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect بئر واحد لكل منها mTq5A، mTq5V، mTq17V وmTq32V باستخدام كاشف ترنسفكأيشن التجاري وفقا لتعليمات الشركة الصانعة والثقافة لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الخلايا باستخدام حل التربسين / EDTA التجاري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 5000 كوس خلايا معلقة في هانك في محلول الملح المتوازن (HBSS) معربا عن mTq5A في كل من الآبار A1-G3 من 96 لوحة multiwell # 1.5 سمك القاع الزجاجي الذي سبق أن تعامل مع بولي-L-ليسين. كرر mTq5V معربا عن الخلايا في الآبار A4-G6، mTq17V في الآبار A5-G9 وmTq32V في الآبار A10-G12. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك جيدا H1 فارغة (لتقديم قياس أي خلفية ثابتة من لوحة multiwell). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 200 ميكرولتر من HBSS فقط إلى H2 جيدا (لتقديم قياس أي إشارة الخلفية من مستنبت الخلية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 5000 خلايا غير transfected في HBSS إلى H3 جيدا (لتوفير قياس أي إشارة الخلفية من تألق ذاتي الخلوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 200 ميكرولتر من 75 ميكرومتر الكومارين محلول الصبغة إلى جانب H4 (لتقديم شيك على أي تباين ر 0 خلال اقتناء لوحة multiwell، على سبيل المثال، نتيجة للتغيرات في درجة حرارة الغرفة أو لتقلبات في الليزر أو توقيت الدوائر. </li></ol> 2. openFLIM-HCA الحصول على البيانات ملاحظة: معلومات مفصلة يمكن الاطلاع على ويكي openFLIM-HCA 33. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بداية μManager والمساعد OpenFLIM-HCA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد ملف معايرة لتركيبة معينة من حدة تأخير مولد ومعدل تكرار الليزر تحت عنوان &quot;فليم التحكم: تأخير ملف مربع المعايرة: معايرة الملفات&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين المجلد حيث سيتم حفظ البيانات في إطار &quot;ملف: تعيين مجلد قاعدة&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من مسار الإثارة شعاع لضمان اقتران في الألياف البصرية تسليم غير مستقر، وأن كفاءة اقتران تكبير عن طريق قياس القدرة المرسلة من خلال الألياف تسليم باستخدام السلطة متر. تقلبات أقل من 5٪ مقبولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن الحكومة العراقية مما اثار مستقرة عن طريق عرض إشارة مراقبة الانتاج من الحكومة العراقية على الذبذبات الناجمة عن الحكومة العراقية إدخال إشارة الزناد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من التصوير من الفوسفور الحكومة الإسرائيلية على استشعار CCD من خلال تغطية ضوئي من الحكومة العراقية، ووضع مكاسبه إلى 750 V والتركيز واحدة من العدسات التتابع مثل أن صور الأحداث فوتون واحد متفرق (بسبب ضوء خلفية تسرب على الرغم من أن غطاء الحكومة الإسرائيلية ) المسجلة على اتفاقية مكافحة التصحر حادة قدر الإمكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن عينةمجال الرؤية مضاءة بشكل موحد عن طريق التصوير عينة الفلورسنت موحدة، مثل قطرة من محلول الصبغة إشارة على ساترة، وذلك باستخدام قوة الإثارة منخفضة بما فيه الكفاية (&lt;1 مللي واط) للتأكد من أن الحكومة العراقية لا المشبعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد ملف تعريف لوحة المناسب، أي حدد الخيار لوحات 96-جيدا ( &quot;ملف: خصائص تحميل لوحة&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام واجهة المستخدم الرسومية μManager، وضمان عدم وجود مزدوج اللون مكعب شعاع التقسيم في إطار المجهر عن طريق تحديد موقف فارغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يدويا اختيار عرض بوابة 4 نانو ثانية في الحكومة العراقية للتجربة برمتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على بيانات الصورة IRF: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام واجهة المستخدم الرسومية μManager، وضمان عدم وجود الهدف المجهر في مسار الشعاع عن طريق تحديد موقف فارغ. يدويا وضع كتلة بأكسيد شعاع الأسود فوق برج موضوعية لمنع أي هروب ضوء الليزر وزاوية للحد من أي انعكاس مرة أخرى في إطار المجهر. </li> &lt;لى&gt; استخدام μManager واجهة المستخدم الرسومية، تعيين المرشحات في CSUX (الإثارة، مزدوج اللون، الانبعاثات) على ان يكون جزء من ضوء الإثارة متناثرة من القرص نيبكو الغزل يمكن تصويرها ولكن ضمان كثافة ليست كافية لتشبع النظام للحصول على 200 مللي CCD الوقت التكامل. هذا هو لتجنب تعريض ضوئي الحكومة الإسرائيلية إلى الكثير من الضوء، والتي يمكن أن تلحق الضرر ضوئي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام وظيفة بحث maxpoint على مجموعة كاملة من التأخير من قبل مربع تأخير سريع للبرمجة تغطيتها. تحقق المخطط الإخراج المعروضة ومن ثم ضبط اليدوي مربع بالطبع تأخير بواسطة الضغط على زر الأمام بحيث الشخصي IRF الكامل هو ضمن نطاق المسح الضوئي للمربع تأخير سريع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط المعلمات اقتناء (الكثافة المحايدة، زمن التعرض، وتراكم الإطار) حتى لا تشبع اتفاقية مكافحة التصحر في ألمع الوقت بوابة والوقت التكامل الفعال هو&gt; 200 مللي ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دقت مجموعة خطوات تأخير من 25 ملاحظة على تأخير الكامله ( &quot;السيطرة فليم: سريع مربع التأخير: تعبئة التأخير&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صورة IRF عن طريق الضغط على &quot;صورة التقط FLIM&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صورة الخلفية من خلال منع الليزر ( &quot;السيطرة مسار الضوء: الكثافة المحايدة: منعت&quot;)، مما يقلل من عدد من التأخير ( &quot;السيطرة فليم: مربع تأخير السريع: إعداد تأخير الحالي (ملاحظة)&quot;)، وترك جميع الخصائص الأخرى دون تغيير و اضغط على &quot;التقط صورة فليم&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على البيانات صبغ إشارة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد H4 جيدا باستخدام μManager واجهة المستخدم الرسومية ( &quot;السيطرة XYZ: الذهاب إلى جيد: H4&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام واجهة المستخدم الرسومية μManager، حدد المرشحات (الإثارة 434/17 نانومتر، مزدوج اللون، انبعاث 482/25 نانومتر) لتصوير mTqFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام وظيفة بحث maxpoint على مجموعة كاملة من مربع تأخير سريع ومن ثم ضبط مربع تأخير الخشنة حتى الشخصية الاضمحلال الكامل هو ضمن نطاق تأخير مربع تأخير سريع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين التأخيرإلى درجة الحد الأقصى لكثافة عن طريق تغيير &quot;السيطرة FLIM: مربع تأخير السريع: إعداد تأخير الحالي (ملاحظة)&quot;. ضبط المعلمات اقتناء (الكثافة المحايدة، زمن التعرض) بحيث لا يتم المشبعة اتفاقية مكافحة التصحر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين الخطوات تأخير من 25 ملاحظة على نطاق تأخير الكامل ( &quot;السيطرة فليم: سريع مربع التأخير: تعبئة التأخير). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على البيانات صبغ إشارة عن طريق الضغط على &quot;صورة التقط FLIM&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على خلفية الثانية صورة كاميرا CCD من خلال منع الليزر الإثارة (انظر 2.11.7) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على البيانات فليم من العينة لوحة multiwell باستخدام برنامج الحصول على μManager: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموعة التي ينبغي تصوير الآبار وعدد من فوف التي سيتم الحصول عليها لكل بئر ( &quot;إعداد HCA التسلسل الاستحواذ: مواقف XYZ&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يدويا تحديد فوف نموذج يحتوي على عينة ليمكن تصوير. استخدام هذا فوف لتحديد أفضل مرشح الكثافة المحايدة، عرض البوابة في الحكومة العراقية والوقت التكامل الكاميرا وذلك لتصل إلى 75٪ من مجموعة ديناميكية من كاميرا CCD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين ضبط تلقائي للصورة ( &quot;السيطرة XYZ: ضبط تلقائي للصورة&quot;): اضغط على &quot;تركيز الرقابة عودة فقط&quot;، ومن ثم التركيز يدويا على الخلايا أو بنية الفائدة. ضبط &quot;ضبط تلقائي للصورة نطاق البحث&quot; إلى 2000 ميكرون ثم اضغط على &quot;دخول&quot;. اضغط على &quot;AF الآن&quot; لبدء إجراء ضبط تلقائي للصورة. وسوف تظهر قيمة تعويض يصل في الميدان &quot;FocusOffset (ضبط تلقائي للصورة)&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدخل قيمة تعويض تم الحصول عليها في 2.13.3 إلى &quot;AF تعويض&quot; وكرر هذا الإجراء مرتين ضبط تلقائي للصورة ( &quot;AF الآن&quot;) للتأكد من أن قيمة الإزاحة الآن الصفر، مشيرا إلى الأداء السليم للنظام ضبط تلقائي للصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام وظيفة &quot;AutoGate&quot; في برنامج الحصول على OpenFLIM-HCA لاختيار العينات لوغاريتمي من النقاط تأخير. بدلا من ذلك، هذه يمكن تحديدها يدويا، انظر الرجوعسينعقد 36 لمزيد من التفاصيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط &quot;تجميع إطارات&quot; إلى قيمة العوائد المرجوة إجمالي وقت الحصول على البيانات. زيادة عدد الإطارات المتراكمة يزيد إشارة إلى نسبة الضوضاء من البيانات FLIM على حساب زيادة أيضا إجمالي وقت الحصول على البيانات FLIM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل اكتساب FLIM من لوحة multiwell عن طريق الضغط على زر &quot;ابدأ تسلسل HCA&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على مزيد من صورة الكاميرا الخلفية لاتفاقية مكافحة التصحر من خلال منع الليزر الإثارة (انظر 2.11.7) مع إعدادات اكتساب متطابقة كما تستخدم لجمع البيانات FLIM. </li></ol> 3. تحليل البيانات openFLIM-HCA عن طريق FLIMfit <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن الملفات الإضافية اللازمة لتحليل البيانات فليم موجودة (أي IRF وقياس صبغ المرجعية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل البيانات من البئر فارغ (H1)، والمتوسط ​​تحتوي كذلك ثقافة (H2) والتي تحتوي أيضا الخلايا غير المسماة في مستنبت (H3) إلى FLIMfit( &quot;ملف: البيانات FLIM تحميل&quot;) للتحقق ما إذا كانت هناك أية مساهمات خلفية أكبر من 1٪ من إشارة من الخلايا معربا عن &quot;المانحين فقط&quot;، أي في آبار A1-G3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خلفية ملف زمنية متفاوتة (TVB) عن طريق تحميل بشكل جيد مع الثقافة المتوسطة في FLIMfit ( &quot;ملف: البيانات FLIM تحميل&quot;). تحميل البيانات كاميرا خلفية المكتسبة في القسم 2.14 ( &quot;الخلفية: تحميل خلفية&quot;) واستخدام &quot;أدوات: إنشاء TVB كثافة خريطة&quot; خيار FLIMfit لتوليد TVB. أنظر المرجع 31 لمزيد من التفاصيل على TVB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد متفاوتة مكانيا IRF التحول خريطة طريق تحميل البيانات IRF المكتسبة في القسم 2.11 وطرح الخلفية كاميرا CCD المكتسبة في القسم 2.11.7. استخدام الخيار FLIMfit &quot;أدوات: إنشاء IRF التحول خريطة&quot; لحساب متفاوتة مكانيا IRF التحول خريطة. أنظر المرجع [31] لمزيد من التفاصيل على التحول خريطة IRF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب monoexponenالمكاني تسوس إلى البيانات صبغ إشارة المكتسبة في القسم 2.12. تحميل صبغ إشارة وخارطة IRF متفاوتة مكانيا المحسوبة في القسم 3.4، ووضع معايير مناسبة ( &quot;مدى الحياة: رقم إكسب:&quot; 1) مع ر 0 مجموعة كمعلمة المجهزة ( &quot;العمر: FIT IRF التحول: جاهزة&quot;). ثم يقال قيمة ر 0 تم الحصول عليها في الجدول المبين في علامة التبويب &quot;معلمات&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات فليم عن طريق تحميل البيانات FLIM التجريبية المكتسبة في القسم 2.13، وIRF خريطة متفاوتة مكانيا المحسوبة في القسم 3.4، الخلفية كاميرا المكتسبة في القسم 2.14، الملف TVB أعدت في القسم 3.3 واكتب في قيمة سالبة ر 0 تم الحصول عليها في القسم 3.5 ( &quot;IRF: IRF التحول: ر 0&quot;). ثم احتواء البيانات التجريبية للنموذج تسوس المطلوب باستخدام FLIMfit 36 وفقا لمتطلبات التجربة. </li></ol>

The authors have nothing to disclose. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

وصفناها لوحة المجهر multiwell الآلية المصممة لHCA باستخدام FLIM بوابات الزمن. يتم التحكم هذا الصك باستخدام البرمجيات مفتوحة المصدر مكتوب في μManager مع خيار حفظ البيانات إلى ملقم ميرو وتحليل البيانات FLIM التي يجري الاضطلاع بها باستخدام FLIMfit 36، وهو برنامج مفتوح المصدر مكتوب في ماتلاب ومتاحة كعميل ميرو 32 صك μManager برنامج حاسوبي لمراقبة، openFLIM-HCA، على شبكة الإنترنت 33 مع قائمة من مكونات النظام 48 لتمكين الباحثين الأكاديميين لبناء أدوات FLIM HCA الخاصة بهم. من أجل الحصول على البيانات FLIM قوية، فمن الضروري لتحسين الحكومة العراقية وCCD إعدادات اقتناء وتأخذ في الاعتبار أية تغييرات في ر 0. كما هو موضح في 3.8.2، يجب تعيين الحكومة العراقية وضع الكسب وكاميرا CCD الوقت التكامل للوصول ~ 75٪ من النطاق الديناميكي لاتفاقية مكافحة التصحر. Uالغناء ارتفاع الفولتية الحكومة الإسرائيلية ومتعددة تراكمات إطار اتفاقية مكافحة التصحر في كل فترة زمنية بوابة يزيد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء 49 ولكن هذا يزيد من اكتساب الوقت FLIM الإجمالي (منذ يتم الحصول على عدد أقل من الفوتونات مضان في الإطار قبل أن يشبع كاميرا CCD وبالتالي فإن عدد تراكمات إطار ينبغي زيادة) وحتى هذه المفاضلة ينبغي أن يتقرر لكل تجربة. معايرة مولد تأخير يعتمد على معدل تكرار الليزر ولذلك فمن الضروري ضمان أن يتم تحميل ملف معايرة الصحيح لمعدل تكرار استخدامها في اقتناء البرمجيات. إجراء معايرة مربع تأخير يمكن العثور على ويكي openFLIM-HCA 33. إذا كان تألق ذاتي الخلوية منخفضة بالمقارنة مع إشارة مضان، ونحن نستخدم إشارة من يحتوي أيضا مستنبت فقط لتوفير الخلفية زمنية متفاوتة (TVB). للحد من مضان الخلفية من خلية ثقافة المتوسط، نتجنبوسائل الإعلام التي تحتوي على الفينول الأحمر. إذا كان تألق ذاتي الخلوية كبير، ثم TVB يمكن الحصول عليها من قياسات الخلايا غير المسماة. ومع ذلك، في هذه الرعاية الحالة يجب أن تؤخذ، وهذا يفترض أن خلفية تألق ذاتي هو نفسه لكل بكسل في الصورة. وهذا الافتراض لا يكون صحيحا إذا تألق ذاتي يختلف اختلافا كبيرا عبر خلية أو إذا كان شعاع الإثارة أو حساسية الكشف ليست موحدة على مجال الرؤية. الحصول على صورة IRF باستخدام المنتشرة نبضات ضوء الإثارة يوفر الشخصي IRF الزمني الذي convolved مع نموذج البيانات في عملية تركيب ويوفر أيضا خريطة من التباين المكاني للIRF عبر مجال الرؤية. وهذه القوة يمكن قياسها عن طريق التصوير عينة نثر مثل تعليق الغروية على الرغم من، في وثيقة لدينا، وذلك باستخدام ضوء الإثارة متناثرة من القرص نيبكو يوفر قياس أنظف من الحرية الدينية الدولية. تحديد دقيق لتوقيت سو مؤسسة البحوث الدولية أمر مهم لأن الأخطاء في تأخير الوقت بين الإثارة والوقت النابضة يمكن أن تؤثر بشكل كبير على عملية تركيب، لا سيما عندما المناسب لنماذج تسوس الأسي المعقدة. حصلت على IRF باستخدام ليست بالضبط ما هو مطلوب لعملية تركيب ليتم تسجيله في الطول الموجي الإثارة وليس في الطول الموجي الانبعاثات مضان ضوء الإثارة متناثرة، والتي يمكن أن تؤثر على توقيته، على الرغم من التباين المكاني للIRF يجب أن تكون هي نفسها في كل الأطوال الموجية. بالإضافة إلى ذلك، IRF المتناثرة قد تحولت على الصعيد العالمي في وقت قريب إلى IRF صحيح بسبب طول مسار بصري مختلفة من الجسم نثر، كما هو الحال بالنسبة للIRF تم الحصول عليها من القرص نيبكو في FLIM مقطوع بصريا. ويحسب هذا التصحيح، ر 0، وهو التحول الزمني العالمي المطلوبة التي يجب تطبيقها على الحصول عليها منتشرة IRF ضوء الإثارة، من البيانات صبغ إشارة monoexponential كما هو مبين في Protocرأ خطوة 4.4. الأصباغ التالية يمكن استخدامها لموجات الإثارة مختلفة: 75 ميكرومتر الكومارين 153 حل في الميثانول (τ ~ 4.3 م 50) يمكن أن تستخدم في الإثارة في نطاق 295-442 نانومتر. 75 ميكرومتر الكومارين 6 حل في الإيثانول (τ ~ 2.43 م 37) يمكن أن تستخدم في الإثارة في نطاق 430-500 نانومتر. و75 ميكرومتر حل Rhodamine باء في الماء (τ ~ 1.7 م 37) يمكن أن تستخدم في الإثارة في نطاق 488-575 نانومتر. ونلاحظ أنه على الرغم من أنه من الممكن في FLIMfit استخدام IRF مختلفة لكل بكسل من النظام، وعادة ما هو معقول لجعل افتراض أن IRF متفاوتة مكانيا لديه نفس الشخصية الزمني لكل بكسل في الصورة ولكن يقدم مجموعة من مكانيا متفاوتة إزاحة الزمنية النسبية للر العالمي 0. وصفنا هذا النحو خريطة التحول IRF، والتي يتم تحديدها من IRF الضوء المتناثرة. معا، يتم استخدام الشخصي IRF، ر 0 وخريطة التحول IRF أونتأكد من أن كل بكسل في فوف يتم تركيبها مع IRF المناسب. الأهم من ذلك، ر 0 يمكن أن تختلف ببطء مع مرور الوقت لذلك يجب أن تقاس قبل أي الحصول على البيانات FLIM. يجب على المستخدم أن تقرر كيفية أخذ عينات من ملامح الاضمحلال مضان وهو مطلوب لتعيين عرض للبوابات الوقت والتأخير النسبية بعد الإثارة. بشكل عام، فمن المستحسن استخدام بعرض بوابة واسعة لتحقيق أقصى قدر من إشارة الكشف عن وعادة ما نستخدم بعرض بوابة المقرر أن 4 م لFLIM من الخلايا المسمى مع البروتينات مضان. يجب أن يكون عدد من التأخير البوابة الوقت الكافي لأخذ عينات من الشخصية تسوس فلوري (بما في ذلك البوابة مجموعة واحدة لقياس إشارة فقط قبل نبض الإثارة) نظرا لتعقيد النموذج المناسب التي سيتم استخدامها في التحليل. يمكن أن تعتمد القيمة المثلى على عمر وسعة النسبية للمكونات الاضمحلال. بشكل عام، 4 بوابات كافية لmonoexponential المناسب يضمحل في حين قد 7 أو أكثر البواباتيمكن استخدامها لمزيد من النماذج تسوس المعقدة. ونلاحظ أن FLIM يمكن تنفيذها باستخدام مجموعة من التقنيات الساعة المجال أو مجال التردد وطبقت الآلية HCA FLIM صفائف لوحة multiwell أولا في (غير باجتزاء) المجهر واسعة المجال باستخدام قراءات عمر نطاق تردد من الحنق 51. ثم ورد أول الآلي البصرية باجتزاء FLIM قارئ لوحة multiwell لHCA استخدام حقل واسع بوابات وقت التصوير 28. وفي وقت لاحق، تم تطبيق على نطاق الحقل (غير باجتزاء) نطاق التردد FLIM HCA للكشف عن آخر التعديلات متعدية (التيروزين الفسفرة) عبر مكتبة الجينات باستخدام الحنق 52 و بوابات الوقت FLIM HCA تم تطبيقه على الحنق فحوصات فيروس نقص المناعة البشرية-1 الكمامة oligomerization 53 وSUMOylation من FOXM1 54 وRaichu RhoA وأجهزة الاستشعار RAC1 33. ومن الممكن أيضا استخدام TCSPC لmultiwell لوحة FLIM 26 ولكن حتى الآن أثبتت أنها صعبة لمباراة رانه مرت من تقنيات استغلال كشف واسعة المجال. نهج واحد الناشئة التي يمكن أن تعالج هذه المسألة هو استخدام المصفوفات للكشف عن العد فوتون واحد مثل المصفوفات SPAD 55. ونلاحظ أن أي قراءات من الحنق باستخدام البروتينات الفلورية ينبغي أن يعامل بحذر وأن القيم المطلقة من المعلمات التي تم الحصول عليها من FLIMfit أو أي دولة أخرى برامج التحليل فليم سوف تعتمد على الافتراضات المرتبطة النموذج المناسب. على سبيل المثال، حيث المانحة الحنق لديه مكون الاضمحلال الثاني كبير، واستخدام نموذج biexponential لاحتواء البيانات الحنق FLIM يمكن أن يؤدي إلى مساهمة العنصر أسرع الاضمحلال، والتي ترتبط عادة مع السكان FRETing تظهر أعلى مما ينبغي. ولذلك فمن المستحسن استخدام الجهات المانحة مع عمر أحادية الأسي مثل mTq2FP. حتى ذلك الحين، وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن تحليل الحنق لا تزال تتأثر الدول المظلمة من البروتينات متقبل مضان أو عن طريقعدم تجانس عامل التوجه κ 2 بسبب توزيع التشكل fluorophore مع مجموعة متنوعة من الزوايا حامل اللون والمسافات 56. ومع ذلك، نحن وغيرنا قد أظهرت أن قراءات مضان عمر الحنق لا تنتج النتائج المفيدة التي ترتبط مع القياسات البيوكيميائية، ويمكن استخدامها للكشف عن تفاعلات البروتين أو لمتابعة ديناميات هذه الأجهزة. وبالتالي هذا المنبر HCA openFLIM يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من فحوصات على أساس عمر مضان باستخدام الحنق أو تألق ذاتي الخلوية 8، فضلا عن توفير قراءات كمية من تحقيقات قائم على الأصباغ 25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="549">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">microscope frame&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">IX81</td>
			<td style="width:101px;">&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">optical autofocus</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">ZDC</td>
			<td>&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">motorized (x-y-z) microscope stage</td>
			<td style="width:64px;">Marzhauser</td>
			<td style="width:64px;">00-24-565-0000</td>
			<td>Stage with Corvus controlle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">excitation laser source</td>
			<td style="width:64px;">Fianium</td>
			<td style="width:64px;">SC400-4</td>
			<td>Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:320px;">gated optical intensifier&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">High Rate Imager (HRI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">delay generators</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>See agile delay generator and precision delay generator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">camera</td>
			<td style="width:64px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:64px;">ORCA-ER-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Nipkow disc scanner unit&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:64px;">CSU-X1&#160;</td>
			<td>http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Top hat diffuser</td>
			<td style="width:64px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:64px;">ED1-S20-MD</td>
			<td>Engineered diffusers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5V&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3850</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq17V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3847</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq32V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3848</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5A</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3849</td>
			<td>mTurquoise Amber construct</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">HEK293T</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>cell type used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">phenol red-free HBSS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>55021C-1000ML</td>
			<td>imaging media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">culture media</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td>DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">DMEM</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">FBS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">xTremeGene9</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>6.37E+09</td>
			<td>for transfection, follow online protocol from La Roche</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">trypsin/EDTA Solution</td>
			<td style="width:64px;">Thermo Fischer</td>
			<td style="width:64px;">R001100</td>
			<td>for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

Watch this Scientific Journal Video about Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

نقدم ارتفاع محتواها أداة مفتوحة المصدر تحليل (HCA) باستخدام آلية التصوير مضان عمر (FLIM) لمعايرة تفاعلات البروتين باستخدام فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) قراءات مقرها. يتم التحكم والحصول على البيانات لهذا الصك openFLIM-HCA من قبل البرامج المكتوبة في μManager وإجراء تحليل البيانات في FLIMfit.

المصدر المفتوح تحليل عالية المحتوى الاستفادة الآلي الإسفار مدى الحياة التصوير المجهري

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

التصوير C. ايليجانس الأجنة باستخدام مجهر Epifluorescent وبرمجيات المصدر المفتوح

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

التحليل السريع واستكشاف الإسفار الميكروسكوب الصور

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

التصوير الآلي شبه الإسفار من الأنسجة محددة في الزرد الأجنة

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

جنبا إلى جنب تجميد الضغط العالي والسريع تجميد استبدال الأنسجة النباتية للنقل المجهر الإلكتروني

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

سير العمل عالية المحتوى، الكمي خلية فردية من نيون علامات من المجاهر البيانات العالمي، بدعم من برمجيات المصدر المفتوح

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

تتبع وقياس العمليات التنموية في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; استخدام أدوات المصدر المفتوح

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

الخلوية الأكسدة التنميط باستخدام عالية المحتوى المجهري

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

المصدر المفتوح تحليل واحد الجسيمات لسوبر قرار المجهري مع VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...