Name: open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy
Uploaded: 2017-01-18T14:00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.

1. Fremstilling af flerbrøndsplade Array <ol><li> Forbered en opløsning af 75 pM Coumarin 6 i ethanol (T ~ 2,43 ns) for referencemålinger for at muliggøre bestemmelse af t 0. </li><li> Seed 150.000 Cos-celler i fire brønde i en plade med 6 og tillade at vedhæfte natten over i dyrkningsmediet (se Materialer List). </li><li> Transfektion én brønd hver med mTq5A, mTq5V, mTq17V og mTq32V anvendelse af et kommercielt transfektionsreagens i henhold til producentens anvisninger og kultur for 24 timer. </li><li> Frigør celler under anvendelse af en kommerciel trypsin / EDTA opløsning ifølge producentens protokol. </li><li> Pipette 5.000 Cos-celler suspenderet i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), der udtrykker mTq5A i hver af brøndene A1-G3 af en # 1.5 tykkelse glas-bund 96 flerbrøndspladen, der tidligere er behandlet med poly-L-lysin. Gentag for mTq5V udtrykker celler i brønde A4-G6, mTq17V i brønde A5-G9 og mTq32V i brønde A10-G12. </li&gt; <li> Lad godt H1 tom (til at give måling af en statisk baggrund fra flerbrøndspladen). </li><li> Pipetter 200 pi HBSS kun i godt H2 (for at tilvejebringe målinger af enhver baggrund signal fra celledyrkningsmediet). </li><li> Pipette 5.000 ikke-transficerede celler i HBSS i brønd H3 (for at tilvejebringe måling af en baggrundssignal fra cellulær autofluorescens). </li><li> Pipetter 200 pi af 75 uM coumarin farvestofopløsning i godt H4 (for at tilvejebringe en kontrol af enhver variation af t 0 løbet flerbrøndspladen erhvervelse, f.eks på grund af ændringer i omgivelsernes temperatur eller til udsving i laser eller timing kredsløb. </li></ol> 2. openFLIM-HCA datafangst BEMÆRK: Nærmere oplysninger kan findes på openFLIM-HCA wiki 33. <ol><li> Start μManager og OpenFLIM-HCA Plugin </li><li> Vælg kalibreringen filen for den specifikke kombination af forsinkelse generator enhed oglaser gentagelse sats under &quot;FLIM kontrol: Forsinkelse box kalibrering fil: Kalibrering filer&quot;. </li><li> Indstil den mappe, hvor data vil blive gemt under &quot;Fil: Set Base mappe&quot;. </li><li> Kontroller excitation strålegangen at sikre, at koblingen i levering optiske fiber er stabil, og at koblingseffektivitet maksimeres ved at måle effekt overføres gennem levering fiber under anvendelse af en effektmåler. Udsving lavere end 5% er acceptable. </li><li> Kontroller, at den indiske regering udløsning er stabil ved at vise skærmens udgangssignalet fra den indiske regering på et oscilloskop udløst af den indiske regering input trigger signal. </li><li> Kontroller billeddannelse af den indiske regerings fosfor på CCD-sensoren ved at dække fotokatoden af ​​den indiske regering, indstilling sin gevinst til 750 V og fokusere en af ​​relæ linser sådan at billeder af sparsomme enkelt foton begivenheder (på grund af baggrundslys lækker selvom den indiske regering dæksel ) optaget på CCD er så skarpe som muligt. </li><li> Kontroller, at prøvensynsfelt er ensartet belyst af imaging en ensartet fluorescerende prøve, såsom en dråbe af henvisningen farveopløsning på et dækglas under anvendelse af en tilstrækkelig lav magnetiseringseffekt (&lt;1 pW) for at sikre, at den indiske regering ikke er mættet. </li><li> Vælg den relevante plade definition-fil, dvs vælge mulighed for 96-brønds plader ( &quot;Fil: Load Plate egenskaber&quot;). </li><li> Brug af μManager GUI, sikre, at der ikke er nogen dikroisk stråledeler terning i mikroskopet ramme ved at vælge en tom position. </li><li> Vælg manuelt en port bredde på 4 ns på den indiske regering for hele forsøget. </li><li> Erhverve IRF billeddata: <ol><li> Brug af μManager GUI, sikre, at der ikke er nogen mikroskopobjektivet i strålegangen ved at vælge en tom position. Manuelt placere en sort anodiseret stråle blokken over målet tårn for at forhindre enhver laserlys undslippe og vinkel det at minimere enhver refleksion tilbage i mikroskopet rammen. </li> &lt;li&gt; Brug af μManager GUI, sætte filtrene i CSUX (Excitation, Dichroic, Emission), således at den del af excitation spredte lys fra spinning Nipkow disk kan afbildes, men sikre intensiteten ikke er tilstrækkelig til at mætte systemet til en 200 ms CCD integration tid. Dette er for at undgå at udsætte den indiske regering fotokatoden at for meget lys, som kan beskadige fotokatoden. </li><li> Brug Find maxpoint funktion over hele spektret af de forsinkelser, der er omfattet af den programmerbare hurtigt forsinkelse kassen. Tjek output diagram vises og derefter justere den manuelle kursus forsinkelse kasse ved at skubbe fremad knap så hele IRF profil er inden scanningen vifte af den hurtige forsinkelse kassen. </li><li> Juster parametrene erhvervelse (Neutral tæthed, eksponeringstid, Frame ophobning), så CCD ikke er mættet i den lyseste tid-gate og effektiv integration tid er&gt; 200 ms. </li><li> Set forsinkelse trin på 25 ps under fuld forsinkelse ringedee ( &quot;FLIM kontrol: Hurtig forsinkelse box: Befolke forsinkelser&quot;). </li><li> Erhverve IRF billede ved at trykke på &quot;Snap FLIM image&quot;. </li><li> Anskaf et baggrundsbillede ved at blokere laser ( &quot;Light sti kontrol: Neutral tæthed: blokeret&quot;), at reducere antallet af forsinkelser ( &quot;FLIM kontrol: Hurtig forsinkelse box: Aktuel forsinkelse indstilling (ps)&quot;), lade alle andre egenskaber, uændret og tryk på &quot;Snap FLIM billede&quot;. </li></ol></li><li> Anskaf henvisning farvestof data: <ol><li> Vælg godt h4 ved hjælp af μManager GUI ( &quot;XYZ kontrol: Gå til godt: H4&quot;). </li><li> Brug af μManager GUI vælge filtre (excitation 434/17 nm, Dichroic, Emission 482/25 nm) til billeddannelse mTqFP. </li><li> Brug Find maxpoint funktion over hele spektret af den hurtige forsinkelse boksen og derefter justere den grove forsinkelse boksen, så den fulde henfald profil er inden forsinkelsen rækkevidde hurtige forsinkelse kassen. </li><li> Indstil forsinkelsentil det punkt af maksimal intensitet ved at ændre &quot;FLIM kontrol: Hurtig forsinkelse box: Aktuel forsinkelse indstilling (ps)&quot;. Juster parametrene erhvervelse (Neutral tæthed, eksponeringstid), så CCD ikke er mættet. </li><li> Set forsinkelse trin på 25 ps under fuld forsinkelse interval ( &quot;FLIM kontrol: Hurtig forsinkelse box: Befolke forsinkelser). </li><li> Anskaf henvisning farvestof data ved at trykke på &quot;Snap FLIM image&quot;. </li><li> Anskaf en anden baggrund CCD-kamera billede ved at blokere excitation laser (se 2.11.7) </li></ol></li><li> Erhverve flim data flerrumspladen prøve ved hjælp af μManager erhvervelse software: <ol><li> Set som brønde skal afbildes, og antallet af FOV skal erhverves per brønd ( &quot;Setup HCA sekventeret erhvervelse: XYZ positioner&quot;). </li><li> manuelt vælge en eksemplarisk FOV indeholdende prøven, der skal afbildes. Brug denne FOV at bestemme den optimale gråfilter, gate bredde ved den indiske regering ogintegrationstid på kameraet for at nå 75% af det dynamiske område for CCD-kameraet. </li><li> Set autofokus ( &quot;XYZ kontrol: Autofokus&quot;): Tryk på &quot;Return fokus kun kontrol&quot;, og derefter manuelt fokusere på cellerne eller struktur af interesse. Indstil &quot;Autofokus søgning rækkevidde&quot; til 2000 um og tryk på &quot;Enter&quot;. Tryk på &quot;AF nu&quot; for at indlede en autofokus procedure. En offset værdi vil dukke op i feltet &quot;FocusOffset (Autofokus)&quot;. </li><li> Indtast offset værdi opnået i 2.13.3 i &quot;AF offset&quot; og gentag autofokus procedure to gange ( &quot;AF nu&quot;) for at kontrollere, at offset værdi nu nul, hvilket indikerer fungerer korrekt autofokus systemet. </li><li> Brug &quot;autogate&quot; -funktionen i købet OpenFLIM-HCA software til at vælge en logaritmisk sampling af forsinkelsen point. Alternativt kan disse vælges manuelt, se henvisening 36 for flere detaljer. </li><li> Indstil &quot;Akkumuler Frames&quot; til en værdi, som udbytter ønskede samlede datafangst tid. Forøgelse af antallet af akkumulerede rammer øger signal-støjforhold af de flim data på bekostning af også stigende total FLIM datafangst tid. </li><li> Kør købet af flerbrøndspladen FLIM ved at trykke på &quot;Start HCA sekvens&quot; knappen. </li></ol></li><li> Anskaf en yderligere baggrund CCD-kamera billede ved at blokere excitation laser (se 2.11.7) med identiske indstillinger erhvervelse, som anvendes til erhvervelse af flim data. </li></ol> 3. openFLIM-HCA dataanalyse Brug FLIMfit <ol><li> Kontroller, at de nødvendige hjælpefunktioner filer til FLIM dataanalyse er til stede (dvs. IRF og reference farvestof måling). </li><li> Indlæse data fra den tomme brønd (H1), den brønd, der indeholder dyrkningsmedium (H2) og brønd indeholdende umærkede celler i dyrkningsmedium (H3) i FLIMfit( &quot;Fil: Load FLIM data&quot;) for at kontrollere, om der er nogen baggrund bidrag større end 1% af signalet fra cellerne &quot;donor-only&quot; udtrykker, dvs i brønde A1-G3. </li><li> Forbered en tidsvarierende baggrund (TVB) fil ved at indlæse den godt med dyrkningsmedium i FLIMfit ( &quot;File: Load FLIM data&quot;). Indlæse kamera baggrundsdata erhvervet i afsnit 2.14 ( &quot;Baggrund: Load baggrund&quot;) og bruge FLIMfit option &quot;Funktioner: Opret TVB Intensitet Map&quot; til at generere TVB. Se reference 31 for flere detaljer på TVB. </li><li> Forbered rumligt varierende IRF Shift Kort ved at indlæse de IRF data indhentet i afsnit 2.11 og trække CCD-kameraet baggrund erhvervet i afsnit 2.11.7. Brug FLIMfit option &quot;Funktioner: Opret IRF Shift Map&quot; til at beregne den rumligt varierende IRF Shift kort. Se reference [31] for flere detaljer på IRF Shift Map. </li><li> Monter en monoexponenoplys- henfald til henvisning farvestof data indhentet i afsnit 2.12. Load henvisning farvestof og det rumligt varierende IRF Kort beregnet i afsnit 3.4, der er fit parametre ( &quot;Lifetime: Nej Exp: 1&quot;) med t 0 sæt som en monteret parameter ( &quot;Lifetime: FIT IRF Shift: Fitted&quot;). Værdien af t 0 opnåede derefter rapporteret i tabellen i fanen &quot;Parametre&quot;. </li><li> Analyser flim data ved at indlæse de eksperimentelle flim data indhentet i afsnit 2.13, det rumligt varierende IRF Kort beregnet i afsnit 3.4, kameraet baggrund erhvervet i afsnit 2.14, TVB-fil udarbejdet i afsnit 3.3 og type i den negative værdi af t 0 opnået i afsnit 3.5 ( &quot;IRF: IRF shift: t 0&quot;). Så passer de eksperimentelle data til den ønskede henfald model ved hjælp af FLIMfit 36 i henhold til kravene i eksperimentet. </li></ol>

The authors have nothing to disclose. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Vi har beskrevet en automatiseret flerbrøndspladen mikroskop designet til HCA hjælp tid-gated FLIM. Dette instrument er kontrolleret ved hjælp af open source-software skrevet i μManager med mulighed for at gemme data til en Omero server og analysen flim data, der udføres ved hjælp af FLIMfit 36, et open source program skrevet i MatLab og fås som Omero klient 32 μManager instrument kontrol software, openFLIM-HCA, er tilgængelig online 33 med en liste over de systemkomponenter 48 for at muliggøre akademiske forskere til at konstruere deres egne FLIM HCA instrumenter. For at erhverve robuste Flim data, er det nødvendigt at optimere den indiske regering og CCD erhvervelse og at tage hensyn til eventuelle variationer i t 0. Som beskrevet i 3.8.2, bør GOI forstærkningsindstilling og CCD kamera integrationstiden indstilles til at nå ~ 75% af CCD dynamikområde. Usynge højere GOI spændinger og flere CCD frame ophobninger på hvert tidspunkt portforsinkelse øger signal-støjforholdet 49, men dette øger den samlede erhvervelse FLIM tid (da færre fluorescensfotoner erhverves pr frame før CCD-kameraet mættede fedtsyrer og så antallet af frame ophobninger bør øges) og så denne afvejning bør besluttes for hvert forsøg. Kalibreringen af ​​forsinkelsesgeneratoren afhænger laseren repetitionshastighed og det er derfor nødvendigt at sikre, at den korrekte kalibrering filen for gentagelseshastighed anvendes indlæses i købet software. Proceduren for kalibrering af forsinkelsen boksen kan findes på openFLIM-HCA wiki 33. Hvis det cellulære autofluorescens er lav sammenlignet med fluorescenssignalet, bruger vi signalet fra en brønd indeholdende lige dyrkningsmedium til tilvejebringelse af tidsvarierende baggrund (TVB). For at minimere baggrundsfluorescens fra celledyrkningsmediet, undgår vimedier indeholdende phenolrødt. Hvis det cellulære autofluorescens er betydelig, så TVB kan afledes af målinger af umærkede celler. Men i dette tilfælde skal man være omhyggelig, da dette forudsætter, at autofluorescens baggrund er den samme for hver pixel i billedet. Denne antagelse er ikke gyldig, hvis autofluorescens varierer betydeligt på tværs af en celle, eller hvis excitation strålen eller afsløring følsomhed er ikke ensartet over synsfeltet. Erhvervelsen af ​​et IRF billede ved hjælp spredte excitation lysimpulser giver den tidsmæssige IRF profil, der er foldet med datamodellen i tilpasningsprocessen og tilvejebringer også et kort over den rumlige variation af IRF tværs af synsfeltet. IRF kan måles ved at afbilde en spredning prøve, såsom en kolloid suspension, selv efter vores instrument, ved anvendelse af excitation spredte lys fra Nipkow disk giver en renere måling af IRF. Nøjagtig bestemmelse af timingen of IRF er vigtig, fordi fejl i tidsforsinkelse mellem excitation og tidslig udelukkelse væsentligt kan påvirke tilpasningsprocessen, især når montering på komplekse eksponentielle henfald modeller. IRF erhvervet ved hjælp af spredt excitationslys er ikke præcis, hvad der er nødvendigt for tilpasningsprocessen, fordi den er optaget på excitationsbølgelængden snarere end ved fluorescens emission bølgelængde, som kan påvirke dens timing, selvom den rumlige variation af IRF bør være den samme ved begge bølgelængder. Desuden kan det spredte IRF være globalt forskudt i tid i forhold til den sande IRF grundet en forskellig optisk vejlængde fra spredningen objekt, som det er tilfældet for en IRF erhvervet fra Nipkow disk i optisk snit FLIM. Denne korrektion, t 0, hvilket er det påkrævede globale tidsmæssige skift, der skal anvendes til den erhvervede spredt excitationslyset IRF, beregnes ud fra de monoeksponentiel henvisning farvestof data som angivet i Protocol trin 4.4. Følgende farvestoffer kan anvendes til forskellige excitationsbølgelængder: en 75 uM Coumarin 153-opløsning i methanol (τ ~ 4,3 ns 50) kan anvendes til excitation i området fra 295 til 442 nm; en 75 uM Coumarin 6 opløsning i ethanol (T ~ 2,43 ns 37) kan anvendes til excitation i området fra 430 til 500 nm; og en 75 uM Rhodamin B-opløsning i vand (τ ~ 1,7 ns 37) kan anvendes til excitation i området fra 488 til 575 nm. Vi bemærker, at selv om det er muligt i FLIMfit at bruge en anden IRF for hver pixel af systemet, normalt er det rimeligt at gøre den antagelse, at det rumligt varierende IRF har samme tidsmæssige profil for hver pixel i billedet, men præsenterer en række af rumligt varierende tidsmæssige forskydninger i forhold til den globale t 0. Vi beskriver dette som IRF shift kort, som bestemmes fra det spredte lys IRF. Sammen er IRF profil, t 0 og IRF skift kortet bruges til ensikre, at hver pixel i FOV er udstyret med en passende IRF. Vigtigt er det, kan t 0 variere langsomt over tid, så det bør måles før enhver erhvervelse FLIM data. Brugeren skal beslutte, hvordan at prøve de fluorescens henfald profiler og er forpligtet til at indstille bredden af ​​den tid, porte og deres relative forsinkelser efter excitation. I almindelighed er det ønskeligt at anvende Broadgate bredder for at maksimere det detekterede signal og typisk bruger vi gate bredder sat til 4 ns for FLIM af celler mærket med fluorescens-proteiner. Antallet af tid-gate forsinkelser bør være tilstrækkelig til at prøve den fluorescerende henfald profil (herunder en gate indstilles til at måle signalet lige før excitationspulsen) i betragtning af kompleksiteten af ​​fitting model, der vil blive anvendt i analysen. Den optimale værdi kan afhænge af de levetider og relative amplituder af henfaldet komponenter. Generelt 4 porte er tilstrækkelige til montering monoeksponentiel henfalder mens 7 eller flere porte kanbruges til mere komplekse henfald modeller. Vi bemærker, at FLIM kan implementeres ved hjælp af en vifte af tid-domæne eller frekvens domæne teknikker og automatiseret FLIM HCA af flerbrøndspladen arrays blev først implementeret i en (ikke-sektionering) wide-field mikroskopet med frekvensdomænet levetid udlæsninger af FRET 51. Den første automatiserede optiske sektionering FLIM flerbrøndspladen læser til HCA udnytte bredt felt tid-gated billeddannelse 28 blev derefter rapporteret. Efterfølgende blev wide-field (ikke-sektionering) frekvensdomænet FLIM HCA ansøgt til at screene for post-translationelle modifikationer (tyrosinphosphoryleringssteder) på tværs et gen bibliotek ved hjælp FRET 52 og tid-gated FLIM HCA er blevet anvendt til at ærgre analyser af HIV-1 Gag oligomerisering 53 og af SUMOylation af FOXM1 54, Raichu RhoA og Rac1 biosensorer 33. Det er også muligt at anvende TCSPC for flerbrøndspladen FLIM 26, men til dato har det vist sig svært at matche than gennemløb af teknikker udnytter afsløring bredt felt. Et spirende strategi, der kunne løse dette problem er brugen af arrays af enkelt foton optælling detektorer såsom SPAD arrays 55. Vi bemærker, at eventuelle udlæsninger af FRET ved hjælp af fluorescerende proteiner skal behandles med forsigtighed, og at de absolutte værdier af parametre opnået fra FLIMfit eller anden FLIM analyse software vil afhænge af antagelserne vedrørende montering model. For eksempel hvor FRET donor har en væsentlig anden henfald komponent, kan anvendelsen af ​​en bieksponentiel model til at passe til FRET Flim data resultere i bidraget fra den hurtigere henfald komponent, typisk forbundet med FRETing befolkning optræder højere end det burde. Det er derfor ønskeligt at anvende donorer med en mono-eksponentiel levetid såsom mTq2FP. Selv da, har nylige undersøgelser vist, at FRET-analyse stadig kan påvirkes af mørke tilstande af acceptor fluorescens proteiner eller vedheterogenitet af orienteringen faktor κ 2 på grund af en fordeling af fluoroforen konformationer med en bred vifte af chromoforgrupper vinkler og afstande 56. Ikke desto mindre har vi og andre vist, at fluorescenslevetid udlæsninger af FRET do producere nyttige resultater, der korrelerer med biokemiske målinger og kan anvendes til at screene for protein-interaktioner eller følge dynamikken i biosensorer. Således denne openFLIM HCA platformen kan anvendes til en bred vifte af fluorescenslevetid assays anvender FRET eller cellulær autofluorescens 8, samt tilvejebringer kvantitative udlæsninger af farvestofbaserede prober 25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="549">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">microscope frame&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">IX81</td>
			<td style="width:101px;">&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">optical autofocus</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">ZDC</td>
			<td>&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">motorized (x-y-z) microscope stage</td>
			<td style="width:64px;">Marzhauser</td>
			<td style="width:64px;">00-24-565-0000</td>
			<td>Stage with Corvus controlle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">excitation laser source</td>
			<td style="width:64px;">Fianium</td>
			<td style="width:64px;">SC400-4</td>
			<td>Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:320px;">gated optical intensifier&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">High Rate Imager (HRI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">delay generators</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>See agile delay generator and precision delay generator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">camera</td>
			<td style="width:64px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:64px;">ORCA-ER-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Nipkow disc scanner unit&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:64px;">CSU-X1&#160;</td>
			<td>http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Top hat diffuser</td>
			<td style="width:64px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:64px;">ED1-S20-MD</td>
			<td>Engineered diffusers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5V&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3850</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq17V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3847</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq32V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3848</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5A</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3849</td>
			<td>mTurquoise Amber construct</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">HEK293T</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>cell type used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">phenol red-free HBSS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>55021C-1000ML</td>
			<td>imaging media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">culture media</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td>DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">DMEM</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">FBS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">xTremeGene9</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>6.37E+09</td>
			<td>for transfection, follow online protocol from La Roche</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">trypsin/EDTA Solution</td>
			<td style="width:64px;">Thermo Fischer</td>
			<td style="width:64px;">R001100</td>
			<td>for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

Watch this Scientific Journal Video about Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Vi præsenterer et open source højt indhold analyse (HCA) instrument udnytter automatiseret fluorescens levetid imaging (FLIM) til analyse protein interaktioner ved hjælp Förster resonans (FRET) baserede udlæsninger. Erhvervelse Data til denne openFLIM-HCA instrument styres af software skrevet i μManager og foretages analyse af data i FLIMfit.

Open Source High Content Analysis hjælp Automated Fluorescens Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Hurtig analyse og udforskningen af ​​fluorescensmikroskopi Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Semi-automatiske Imaging af Vævsspecifik Fluorescens i zebrafisk embryoner

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Højtryks-Frysning og Quick Freeze Substitution af plantevævene for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Workflow til High-indhold, individuel celle Kvantificering af fluorescerende markører fra Universal Microscope data, støttet af Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Sporing og kvantificere udviklingsprocesser i<em&gt; C. elegans</em&gt; Brug Open source Værktøj

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Cellular Redox Profiling ved hjælp af højindholdsmikroskopi

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open source Single-partikel Analyse for Super-resolution Microscopy med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...