Name: open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy
Uploaded: 2017-01-18T14:00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.

1. Voorbereiding van de multi-putjesplaat Array <ol><li> Bereid een oplossing van 75 uM Cumarine 6 in ethanol (τ ~ 2,43 ns) voor referentie metingen om de bepaling van t 0 in te schakelen. </li><li> Seed 150.000 Cos cellen in vier putjes van een plaat met 6 putjes en laat &#39;s nachts hechten in kweekmedium (zie Materials List). </li><li> Transfecteren een goed elk met mTq5A, mTq5V, mTq17V en mTq32V met behulp van een commercieel transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant en cultuur voor 24 uur. </li><li> Los cellen met een commercieel trypsine / EDTA oplossing volgens protocol van de fabrikant. </li><li> Pipetteer 5000 Cos cellen gesuspendeerd in Hank&#39;s gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) tot expressie mTq5A in elk van de putjes A1-G3 of a # dikte 1,5 glazen bodem 96 multi-putjesplaat die eerder behandeld is met poly-L-lysine. Herhaal dit voor mTq5V tot expressie brengen in putten A4-G6, mTq17V in putten A5-G9 en mTq32V in putten A10-G12. </li&gt; <li> Laat goed H1 leeg (de meting van de statische achtergrond voorzien van de multi-putjesplaat). </li><li> Pipetteer 200 ul HBSS slechts in duidelijk H2 (meting van elke achtergrondsignaal uit het celkweekmedium verschaffen). </li><li> Pipette 5000 niet-getransfecteerde cellen in HBSS in goed H3 (de meting van elke achtergrond signaal van cellulaire autofluorescentie te bieden). </li><li> Pipetteer 200 ul van 75 uM Cumarine kleurstofoplossing in duidelijk H4 (na controle van elke variant van t 0 daarvan gedurende de multi-putjesplaat verkrijgen, bijvoorbeeld als gevolg van veranderingen in de omgevingstemperatuur of schommelingen in laser of timing circuit. </li></ol> 2. openFLIM-HCA Data Acquisition OPMERKING: Gedetailleerde informatie vindt u op de openFLIM-HCA wiki 33. <ol><li> Start μManager en de OpenFLIM-HCA Plugin </li><li> Selecteer de kalibratiebestand voor de specifieke combinatie van delay generatoreenheid enlaser herhalingsfrequentie onder &quot;FLIM control: Vertraging box kalibratiebestand: Calibration Files&quot;. </li><li> Stel de map waar de gegevens op grond worden opgeslagen &quot;File: Set Base Folder&quot;. </li><li> Controleer de excitatie balk pad naar die koppeling in de levering van optische vezels zorgen voor stabiel is en dat de koppeling efficiëntie wordt gemaximaliseerd door het meten van de macht overgedragen door levering vezel met behulp van een power meter. Schommelingen van minder dan 5% zijn aanvaardbaar. </li><li> Controleer dat de Indiase overheid triggering is stabiel door het weergeven van de monitor uitgangssignaal van de Indiase overheid zich op een oscilloscoop veroorzaakt door de Indiase overheid ingang trigger signaal. </li><li> Controleer de beeldvorming van de Indiase overheid fosfor op de CCD-sensor door het bedekken van de fotokathode van de Indiase overheid, het vaststellen van zijn winst tot 750 V en zich te concentreren een van de relais lenzen zodanig dat beelden van schaars single photon gebeurtenissen (als gevolg van achtergrondlicht lekkende hoewel de Indiase overheid deksel ) opgenomen op de CCD zijn zo scherp mogelijk. </li><li> Controleer dat het monstergezichtsveld wordt uniform belicht door het afbeelden van een uniform fluorescent monster, zoals een daling van de referentie kleurstofoplossing op een dekglaasje met een voldoende laag excitatievermogen (&lt;1 uW) ervoor zorgen dat de Indiase overheid niet verzadigd. </li><li> Selecteer het juiste bord definitie bestand, dat wil zeggen, kies optie voor 96-well platen ( &quot;File: Load Plate eigenschappen&quot;). </li><li> Met de μManager GUI zorgen dat er geen dichroïsche bundelsplitser kubus in de microscoop bij selecteren een lege positie. </li><li> selecteert u handmatig een poort breedte van 4 ns bij de Indiase overheid voor het hele experiment. </li><li> Verwerven IRF beeldgegevens: <ol><li> Met de μManager GUI zorgen dat er geen microscoopobjectief in de stralengang door het selecteren van een lege positie. Handmatig plaats een zwart geanodiseerd balk blok boven de doelstelling revolver om eventuele laserlicht ontsnappen en de hoek van het aan een reflectie terug in de microscoop kader minimaliseren voorkomen. </li> &lt;li&gt; De μManager GUI Stel de filters in de CSUX (Excitatie, Dichroic, Emission) zodat de fractie van excitatielicht verspreid van de draaiende Nipkowschijf kan worden afgebeeld, maar zorgen de intensiteit niet voldoende is om het systeem te verzadigen van een 200 ms CCD integratie tijd. Dit is om te voorkomen dat het blootstellen van de Indiase overheid fotokathode te veel licht, dat de fotokathode kunnen beschadigen. </li><li> Gebruik de Find maxpoint functie over het volledige bereik van de vertragingen die onder de programmeerbare snel vertraging doos. Controleer de uitvoer diagram weergegeven en pas de handleiding cursus vertraging vak door op de forward-knop, zodat de volledige IRF profiel binnen het scan bereik van de snelle vertraging doos. </li><li> Pas de acquisitie parameters (neutrale dichtheid, Belichtingstijd, Frame accumulatie), zodat de CCD wordt niet verzadigd in de helderste tijd-poort en de effectieve integratie tijd&gt; 200 ms. </li><li> Stel vertraging stappen van 25 ps over de volle vertraging beldee ( &quot;FLIM control: Fast vertraging doos Bevolk vertragingen&quot;). </li><li> Image IRF verwerven door het &quot;image Snap FLIM&quot; te drukken. </li><li> Een achtergrondafbeelding te verwerven door het blokkeren van de laser ( &quot;Light control pad: Neutraal dichtheid: geblokkeerd&quot;), het verminderen van het aantal vertragingen ( &quot;FLIM control: Fast vertraging doos: Actueel vertraging instelling (ps)&quot;), laat alle andere eigenschappen onveranderd en druk op &quot;Snap FLIM imago&quot;. </li></ol></li><li> Verwerven verwijzing dye gegevens: <ol><li> Selecteer goed H4 met behulp van de μManager GUI ( &quot;XYZ control: Ga goed: H4&quot;). </li><li> Met behulp van de μManager GUI selecteert u filters (excitatie 434/17 nm, Dichroic, Emission 482/25 nm) voor het afbeelden van mTqFP. </li><li> Gebruik de Find maxpoint functie over het gehele bereik van de snelle vertraging doos en pas vervolgens de grove vertraging doos, zodat de volledige verval profiel binnen de vertraging bereik van de snelle vertraging doos. </li><li> Stel de vertragingtot op het punt van de maximale intensiteit door het veranderen &quot;FLIM control: Fast vertraging doos: Actueel vertraging instelling (ps)&quot;. Pas de verwervingsparameters (neutrale dichtheid Blootstellingstijd), zodat de CCD niet verzadigd. </li><li> Stel vertraging stappen van 25 ps over de volle vertraging bereik ( &quot;FLIM control: Fast vertraging doos Bevolk vertragingen). </li><li> Verwerven verwijzing kleurstof data door &quot;image Snap FLIM&quot; te drukken. </li><li> afbeelding van een CCD-camera tweede achtergrond te verwerven door het blokkeren van de excitatie laser (zie 2.11.7) </li></ol></li><li> Verwerven FLIM gegevens van de multi- plaat monster met behulp van de μManager acquisitie software: <ol><li> Set die putten moeten worden afgebeeld en het aantal FOV per putje ( &quot;: XYZ posities Setup HCA gefaseerde overname&quot;) te verwerven. </li><li> Selecteer handmatig een voorbeeld FOV met het monster af te beelden. Gebruik deze FOV naar de optimale neutrale dichtheid filter, gate breedte aan de Indiase overheid te bepalen enintegratietijd van de camera om 75% van het dynamische bereik van de CCD-camera bereikt. </li><li> Stel autofocus ( &quot;XYZ control: Autofocus&quot;): Druk op &quot;alleen Return nadruk control&quot;, en vervolgens handmatig scherp op de cellen of de structuur van belang. Stel &quot;Autofocus search range&quot; tot 2000 pm en druk op &quot;Enter&quot;. Druk op &quot;AF nu&quot; om een autofocus procedure in te leiden. Een offset waarde wordt weergegeven in het veld &quot;FocusOffset (autofocus)&quot;. </li><li> Voer de offset waarde verkregen in 2.13.3 in &quot;AF offset&quot; en twee keer herhaal de autofocus procedure ( &quot;AF now&quot;) om te controleren of de offset waarde is nu nul is, met vermelding van de correcte werking van het autofocussysteem. </li><li> Gebruik de functie &quot;autogate&quot; in de OpenFLIM-HCA acquisitie software om een logaritmische bemonstering van de vertraging punten te kiezen. Als alternatief kunnen deze handmatig worden geselecteerd, kunt u verwijzenENCE 36 voor meer informatie. </li><li> Stel &quot;Verzamel Frames&quot; naar een waarde die de opbrengsten gewenste totale data-acquisitie tijd. Verhoging van het aantal geaccumuleerde frames toeneemt signaal-ruisverhouding van de FLIM gegevens ten koste van ook toenemende totale FLIM data acquisitie tijd. </li><li> Voer de FLIM overname van de multiwell plaat door op de &quot;Start HCA sequentie&quot; knop. </li></ol></li><li> Acquire image een verdere achtergrond CCD-camera door het blokkeren van de excitatie laser (zie 2.11.7) met identieke overname instellingen zoals gebruikt voor de aankoop FLIM data. </li></ol> 3. openFLIM-HCA Data Analysis Met behulp FLIMfit <ol><li> Controleer of de nodige ondersteunende bestanden voor het FLIM data-analyse aanwezig zijn (dat wil zeggen, IRF en referentie-dye meting). </li><li> Laad de gegevens van de lege put (H1), het putje met kweekmedium (H2) en putje met ongelabelde cellen in kweekmedium (H3) in FLIMfit( &quot;Bestand: Load FLIM data&quot;) om te controleren of er geen achtergrond bijdragen groter is dan 1% van het signaal van de cellen die &#39;enige donor-&quot;, dat wil zeggen, in putten A1-G3. </li><li> Maak een achtergrond file-tijdsafhankelijke (TVB) door het laden van het goed met kweekmedium in FLIMfit ( &quot;File: Load FLIM data&quot;). Laad de camera achtergrond data verkregen in paragraaf 2.14 ( &quot;Achtergrond: Load Background&quot;) en gebruik de FLIMfit optie &quot;Tools: Maak TVB Intensity Map&quot; om de TVB te genereren. Zie referentie 31 voor meer informatie over de TVB. </li><li> Bereid de ruimtelijk variërende IRF Shift kaart door het laden van de IRF data verkregen in paragraaf 2.11 en aftrekken van de CCD-camera achtergrond verworven in paragraaf 2.11.7. Gebruik de FLIMfit optie &quot;Tools: Maak IRF Shift Map&quot; voor de berekening van het ruimtelijk variërende IRF Shift Map. Zie referentie [31] voor meer informatie over de IRF Shift Map. </li><li> Monteer een monoexponentieel verval met de referentie kleurstof data verkregen in paragraaf 2.12. Load verwijzing kleurstof en het ruimtelijk variërende IRF Map berekend in paragraaf 3.4, stelt fit parameters ( &quot;Lifetime: No Exp: 1&quot;) met t 0 set als een ingerichte parameter ( &quot;Lifetime: FIT IRF Shift: Gepaste&quot;). De waarde van t 0 verkregen wordt vervolgens gerapporteerd in de tabel op het tabblad &quot;Parameters&quot;. </li><li> Analyseer de FLIM gegevens door het laden van de experimentele FLIM data verkregen in paragraaf 2.13, het ruimtelijk variërende IRF Map berekend in paragraaf 3.4, de camera achtergrond verworven in paragraaf 2.14, de TVB dossier opgesteld in paragraaf 3.3 en typ de negatieve waarde van t 0 verkregen in paragraaf 3.5 ( &quot;IRF: IRF shift: t 0&quot;). Monteer vervolgens de experimentele data aan de gewenste vervalmodel behulp FLIMfit 36 volgens de eisen van het experiment. </li></ol>

The authors have nothing to disclose. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

We hebben beschreven een geautomatiseerde multiwell plaat microscoop ontworpen voor het gebruik van HCA-time gated FLIM. Dit instrument wordt gecontroleerd met behulp van open source software geschreven in μManager met de mogelijkheid van het opslaan van de gegevens naar een OMERO server en de FLIM data-analyse wordt uitgevoerd met behulp van FLIMfit 36, een open source programma geschreven in Matlab en verkrijgbaar als OMERO client 32 De μManager instrument besturingssoftware, openFLIM-HCA, is online 33 verkrijgbaar met een overzicht van de systeemcomponenten 48 tot academische onderzoekers in staat te stellen hun eigen FLIM HCA instrumenten te bouwen. Om robuuste FLIM gegevens te verwerven, is het noodzakelijk om de Indiase overheid en CCD overname instellingen te optimaliseren en rekening te houden met variaties van t 0. Zoals beschreven in 3.8.2, moet het GOI versterkingsinstelling en CCD-camera integratietijd worden bereikt ~ 75% van de CCD dynamisch bereik. Uzing hogere GOI spanningen en meerdere CCD lijst accumulaties op elk tijdstip poortvertraging verhoogt de signaal-ruisverhouding 49 maar dit verhoogt de totale FLIM acquisitietijd (omdat er minder fluorescentiefotonen per frame wordt verkregen voordat de CCD camera verzadigde en zo het aantal lijst voorkomens te verhogen) en dus deze afweging moeten worden vastgesteld voor elk experiment. De kalibratie van de vertraging generator is afhankelijk van de laser herhalingsfrequentie en het is daarom noodzakelijk om ervoor te zorgen dat de juiste kalibratie-bestand voor de herhalingsfrequentie gebruikt in de acquisitie software is geladen. De procedure voor het kalibreren van de vertraging box kan worden gevonden op de openFLIM-HCA wiki 33. Als de cellulaire autofluorescentie is laag in vergelijking met het fluorescentiesignaal, gebruiken we het signaal van een putje met alleen kweekmedium in de tijd variërende achtergrond (TVB) verschaffen. Op de achtergrond fluorescentie van de cel kweekmedium te minimaliseren, vermijden wemedium dat fenolrood. Als de cellulaire autofluorescentie significant is, wordt de TVB kan worden gemeten met de ongelabelde cellen. In dit geval moet worden, omdat dit veronderstelt dat de autofluorescentie achtergrond is hetzelfde voor elke pixel in het beeld. Deze veronderstelling is niet geldig indien de autofluorescentie varieert aanzienlijk tussen een cel of indien de excitatiebundel of detectiegevoeligheid niet uniform over het gezichtsveld. De overname van een IRF beeld met behulp van verstrooid excitatielicht impulsen biedt het tijdelijke IRF profiel dat is convolved met het datamodel in de fitting proces en biedt ook een kaart van de ruimtelijke variatie van de IRF over het gezichtsveld. De IRF kan worden gemeten door beeldvorming een verstrooiing monster zoals een colloïdale suspensie hoewel in ons instrument, middels verstrooid excitatielicht van de Nipkow schijf zorgt voor een zuivere meting van de IRF. Nauwkeurige bepaling van de timing of de IRF is belangrijk omdat fouten in de tijd tussen de excitatie en de tijd-gating belangrijke invloed kunnen het passingsproces, met name bij het aanbrengen van complexe exponentieel verval modellen. De IRF verkregen door verstrooid excitatielicht niet precies wat nodig is voor de montage proces, omdat het is opgenomen in de excitatiegolflengte plaats bij de golflengte fluorescentie-emissie, die de timing kunnen beïnvloeden, hoewel de ruimtelijke variatie van de IRF even hoog is aan beide golflengten. Bovendien kan de verstrooide IRF globaal worden verschoven in tijd ten opzichte van de ware IRF door een uiteenlopende optische weglengte van de verstrooiing object, zoals het geval is voor een IRF verkregen van de Nipkow schijf optisch doorsnede FLIM. Deze correctie, t 0, die de vereiste globale temporele verschuiving die moet worden toegepast op de verkregen verstrooid excitatielicht IRF, wordt berekend uit het referentie monoexponential kleurstof gegevens zoals aangegeven in Protocol stap 4.4. De volgende kleurstoffen kunnen worden gebruikt voor verschillende golflengten: een 75 uM Cumarine 153 in methanol (τ ~ 4,3 ns 50) kan worden gebruikt voor excitatie in het bereik 295-442 nm; een 75 pM Cumarine 6 in ethanol (τ ~ 2,43 ns 37) kan worden gebruikt voor excitatie in het bereik van 430-500 nm; en 75 uM Rhodamine B-oplossing in water (τ ~ 1,7 ns 37) kan worden gebruikt voor excitatie in het bereik 488-575 nm. Wij merken op dat hoewel in FLIMfit een andere IRF gebruiken voor elke pixel van het systeem mogelijk, meestal is het redelijk om te veronderstellen dat de ruimtelijk variërende IRF dezelfde tijdsprofiel voor elke pixel in de afbeelding, maar vormt een reeks ruimtelijk variërende tijd offsets ten opzichte van de globale t0. We beschrijven dit als het IRF shift kaart, die wordt bepaald uit het verstrooide licht IRF. Samen vormen de IRF profiel, t 0 en IRF shift kaart zijn gebruikt enzorgen dat elk pixel in de FOV is voorzien van een geschikte IRF. Belangrijk is, kunnen t 0 langzaam variëren in de tijd, dus het moet worden gemeten voordat FLIM data-acquisitie. De gebruiker moet beslissen hoe de fluorescentievervaltijd profielen bemonsteren en moet de breedte van de tijd-poorten en hun relatieve vertraging na excitatie ingesteld. In het algemeen is het wenselijk om brede poortbreedten om het gedetecteerde signaal te maximaliseren en typisch gebruik gemaakt poortbreedten ingesteld op 4 ns FLIM cellen gelabeld met fluorescentie eiwitten. Het aantal time-poortvertragingen moet voldoende zijn om de fluorescentie verval profiel (inclusief een poort ingesteld op het signaal gemeten vlak voor de excitatiepuls) Omdat fitting model dat wordt gebruikt in de monsteranalyse zijn. De optimale waarde kan afhangen van de levensduur en de relatieve amplitudes van de verval componenten. Over het algemeen 4 poorten voldoende voor montage monoexponential vervalt terwijl 7 of meer poorten kunnenworden gebruikt voor meer complexe modellen verval. We merken op dat FLIM kan worden geïmplementeerd met behulp van een reeks van tijd-domein of frequentiedomeinen technieken en geautomatiseerde FLIM HCA van multi-putjesplaat arrays werd voor het eerst in een (niet-snijden) geïmplementeerd wide-field microscoop met frequentiedomein levensduur uitlezing van FRET 51. De eerste geautomatiseerde optische sectie FLIM multiwell plaatlezer voor HCA het gebruik van wide-field-time-gated imaging 28 werd vervolgens gemeld. Vervolgens werd groothoek (niet snijden) frequentiedomein FLIM HCA toegepast om te screenen op posttranslationele modificaties (tyrosinefosforylering) over een genbibliotheek behulp FRET 52 en time-gated FLIM HCA is toegepast om testen van HIV-1 Gag FRET oligomerisatie 53 en sumoylation van FOXM1 54 en Raichu RhoA en Rac1 biosensoren 33. Het is ook mogelijk om TCSPC gebruiken multi-putjesplaat FLIM 26 maar tot op heden het moeilijk is gebleken t overeenkomenHij doorvoer technieken benutten van wide-field detectie. Een nieuwe benadering die deze oplossing zou kunnen het gebruik van arrays van single photon counting detectors zoals SPAD arrays 55. We merken dat uitlezingen van FRET met fluorescerende eiwitten moeten met voorzichtigheid worden behandeld en dat de absolute waarden van parameters verkregen FLIMfit of andere FLIM analysesoftware zal afhangen van de aannames in verband met de fitting model. Wanneer bijvoorbeeld het FRET donor aanzienlijk verval tweede component, kan het gebruik van een bi-exponentieel model om de FRET FLIM gegevens aanpassen gevolg van de bijdrage van de sneller bederf component, die gewoonlijk met de FRETing bevolking verschijnen hoger dan de bedoeling was. Het is daarom wenselijk om donoren te gebruiken met een mono-exponentiële levensduur zoals mTq2FP. Zelfs dan, recente studies hebben aangetoond dat FRET analyse nog kunnen worden beïnvloed door duistere toestanden van acceptor fluorescentie eiwitten of doorheterogeniteit van de oriëntatiefactor κ 2 door een verdeling van fluorofoor conformaties met verschillende chromofoor hoeken en afstanden 56. Toch hebben wij en anderen aangetoond dat fluorescentielevensduur uitlezingen van FRET produceren wel nuttige resultaten die correleren met biochemische metingen en kan worden gebruikt om te screenen op eiwit interacties of dynamiek van biosensoren volgen. Waardoor deze openFLIM HCA platform kan worden toegepast op een breed scala van fluorescentie-levensduur gebaseerde testen met gebruikmaking FRET of cellulaire autofluorescentie 8, alsmede het verschaffen van kwantitatieve uitlezing van op kleurstof gebaseerde probes 25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="549">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">microscope frame&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">IX81</td>
			<td style="width:101px;">&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">optical autofocus</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">ZDC</td>
			<td>&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">motorized (x-y-z) microscope stage</td>
			<td style="width:64px;">Marzhauser</td>
			<td style="width:64px;">00-24-565-0000</td>
			<td>Stage with Corvus controlle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">excitation laser source</td>
			<td style="width:64px;">Fianium</td>
			<td style="width:64px;">SC400-4</td>
			<td>Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:320px;">gated optical intensifier&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">High Rate Imager (HRI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">delay generators</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>See agile delay generator and precision delay generator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">camera</td>
			<td style="width:64px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:64px;">ORCA-ER-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Nipkow disc scanner unit&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:64px;">CSU-X1&#160;</td>
			<td>http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Top hat diffuser</td>
			<td style="width:64px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:64px;">ED1-S20-MD</td>
			<td>Engineered diffusers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5V&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3850</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq17V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3847</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq32V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3848</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5A</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3849</td>
			<td>mTurquoise Amber construct</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">HEK293T</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>cell type used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">phenol red-free HBSS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>55021C-1000ML</td>
			<td>imaging media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">culture media</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td>DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">DMEM</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">FBS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">xTremeGene9</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>6.37E+09</td>
			<td>for transfection, follow online protocol from La Roche</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">trypsin/EDTA Solution</td>
			<td style="width:64px;">Thermo Fischer</td>
			<td style="width:64px;">R001100</td>
			<td>for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

Watch this Scientific Journal Video about Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We presenteren een open source hoog gehalte analyse (HCA) instrument gebruik te maken van geautomatiseerde fluorescentie lifetime imaging (FLIM) voor het testen van eiwit interacties met behulp van Förster resonance energy transfer (FRET) op basis van uitlezingen. Data-acquisitie voor deze openFLIM-HCA instrument wordt bestuurd door software geschreven in μManager en data-analyse wordt uitgevoerd in FLIMfit.

Open Source High Content Analysis Door gebruik te maken van de automaten Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Een Neuronale en astrocyte co-cultuur assay voor High Content Analysis van neurotoxiciteit

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse Imaging van mitose Na siRNA transfectie

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryo&#39;s met behulp van een epifluorescerende Microscoop en Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Snelle analyse en verkenning van fluorescentiemicroscopie Afbeeldingen

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Semi-geautomatiseerde beeldvorming van Tissue-specifieke fluorescentie in zebravis embryo&#39;s

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Hogedruk Invriezen en Quick Freeze Vervanging van plantaardige weefsels voor Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Workflow voor High-inhoud, individuele cel Kwantificering van fluorescente merkers van Universal Microscoop gegevens, Ondersteund door Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking en kwantificeren van ontwikkelingsprocessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Het gebruik van open-source tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Cellular Redox Profiling Met High-Content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open-source Single-deeltje Analyse voor Super-resolutie microscopie met VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...