Name: open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy
Uploaded: 2017-01-18T14:00:00
Duration: 9 min 30 s
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The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.

1. Préparation de la plaque multi-puits Tableau <ol><li> Préparer une solution de 75 uM de coumarine 6 dans de l&#39; éthanol (~ T permet 2,43 ns) pour des mesures de référence pour permettre la détermination de t 0. </li><li> Seed 150.000 cellules Cos dans quatre puits d&#39;une plaque à 6 puits et permettre de fixer pendant une nuit dans un milieu de culture (voir la liste des matériaux). </li><li> Transfecter un puits chacun avec mTq5A, mTq5V, mTq17V et mTq32V utilisant un réactif de transfection commerciale selon les instructions et la culture du fabricant pour 24 h. </li><li> Détacher les cellules en utilisant une solution commerciale de trypsine / EDTA, selon le protocole du fabricant. </li><li> 5000 cellules Cos pipetage en suspension dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) exprimant mTq5A dans chacun des puits A1-G3 d&#39;une épaisseur de 96 plaque multipuits # 1,5 à fond de verre qui a été préalablement traité avec de la poly-L-lysine. Répétez l&#39;opération pour mTq5V des cellules exprimant dans des puits A4-G6, mTq17V dans des puits A5-G9 et mTq32V dans les puits A10-G12. </li&gt; <li> Laisser bien H1 vide (pour fournir une mesure de toute arrière-plan statique de la plaque multipuits). </li><li> Introduire à la pipette 200 ul de HBSS uniquement dans H2 puits (pour fournir une mesure de tout signal de fond provenant du milieu de culture cellulaire). </li><li> Pipette 5000 cellules non transfectées dans HBSS en H3 bien (pour fournir la mesure de tout signal de fond de autofluorescence cellulaire). </li><li> Pipeter 200 ul de la solution de colorant coumarine 75 pM dans le puits H4 (pour fournir un contrôle sur toute variation de t 0 lors de l&#39;acquisition de plaque multipuits, par exemple, en raison de changements dans la température ambiante ou aux fluctuations de laser ou la synchronisation des circuits. </li></ol> 2. openFLIM-HCA Acquisition de données NOTE: Des informations détaillées disponibles sur le wiki openFLIM-HCA 33. <ol><li> Démarrer μManager et le plugin OpenFLIM-HCA </li><li> Sélectionnez le fichier de calibration pour la combinaison spécifique de l&#39;unité de générateur de retard ettaux de répétition laser sous «contrôle FLIM: Retard fichier de calibration de la boîte: Calibration Files&quot;. </li><li> Définissez le dossier où les données seront enregistrées sous la rubrique «Fichier: Définir le dossier de base&quot;. </li><li> Vérifiez que le trajet du faisceau d&#39;excitation pour faire en sorte que le couplage dans la fibre optique de distribution est stable et que le rendement de couplage est maximisée par l&#39;énergie transmise par la fibre de distribution à l&#39;aide d&#39;un compteur de mesure de puissance. Fluctuations inférieures à 5% sont acceptables. </li><li> Vérifiez que le GOI déclenchement est stable en affichant le signal de sortie du moniteur du GOI sur un oscilloscope déclenché par le signal d&#39;entrée de déclenchement GOI. </li><li> Contrôler l&#39;image de la substance luminescente GOI sur le capteur CCD en couvrant la photocathode du GOI, fixant son gain à 750 V et en se concentrant une des lentilles de relais de telle sorte que des images d&#39;événements de photons uniques rares (en raison de la lumière de fond qui fuient si le couvercle GOI ) enregistré sur le CCD sont aussi nettes que possible. </li><li> Vérifiez que l&#39;échantillonle champ de vision est uniformément éclairé par l&#39;imagerie d&#39;un échantillon fluorescent uniforme, telle qu&#39;une goutte de la solution de colorant de référence sur une lamelle couvre-objet, en utilisant une puissance suffisamment basse d&#39;excitation (&lt;1 uW) pour faire en sorte que le GOI ne soit pas saturé. </li><li> Sélectionnez le fichier de définition appropriée de la plaque, à savoir, sélectionnez l&#39; option pour les plaques à 96 puits ( &quot;Fichier: propriétés de charge des plaques»). </li><li> Utilisation de l&#39;μManager GUI, assurez -vous qu&#39;il n&#39;y a pas de cube diviseur de faisceau dichroïque dans le cadre de microscope en sélectionnant une position vide. </li><li> Sélectionnez manuellement une largeur de 4 ns de grille au GOI pour l&#39;ensemble de l&#39;expérience. </li><li> Acquérir IRF données d&#39;image: <ol><li> En utilisant l&#39;interface utilisateur graphique μManager, en sorte qu&#39;il n&#39;y ait pas d&#39; objectif de microscope dans la trajectoire du faisceau en sélectionnant une position vide. placer manuellement un bloc de faisceau anodisé noir au-dessus de la tourelle objectif pour empêcher tout échappement de lumière laser et de l&#39;angle pour minimiser toute réflexion de nouveau dans le cadre de microscope. </li> &lt;li&gt; Utilisation de l&#39;μManager GUI, régler les filtres de la CSUX (excitation, dichroïque, émission) de telle sorte que la fraction de lumière d&#39;excitation diffusée à partir du disque de Nipkow filature peut être imagée , mais d&#39; assurer l&#39;intensité est insuffisante pour saturer le système de 200 ms CCD de temps d&#39;intégration. Ceci afin d&#39;éviter l&#39;exposition de la photocathode GOI à trop de lumière, ce qui pourrait endommager la photocathode. </li><li> Utilisez la fonction Recherche de MaxPoint sur toute la gamme des retards couverts par la boîte de retard rapide programmable. Vérifiez le schéma de sortie affichée puis réglez la boîte manuelle de retard de cours en appuyant sur le bouton avant de sorte que le profil complet IRF se situe dans la plage de balayage de la boîte de délai rapide. </li><li> Réglez les paramètres d&#39;acquisition (de densité neutre, temps d&#39;exposition, l&#39; accumulation de trame) de sorte que le CCD est pas saturé dans la plus brillante du temps porte et le temps d&#39;intégration efficace est&gt; 200 ms. </li><li> Définir les étapes de retard de 25 ps sur le retard complet a sonnée ( «contrôle FLIM: boîte de délai rapide: Peupler retards&quot;). </li><li> Acquérir l&#39; image IRF en appuyant sur &quot;image snap FLIM&quot;. </li><li> Acquérir une image de fond en bloquant le laser ( «contrôle de chemin de lumière: densité neutre: bloqué&quot;), ce qui réduit le nombre de retards ( &quot;contrôle FLIM: boîte de délai rapide: réglage de retard actuel (ps)&quot;), laisser toutes les autres propriétés inchangées et appuyez sur &quot;Aligner l&#39; image FLIM&quot;. </li></ol></li><li> Acquérir des données de colorant de référence: <ol><li> Sélectionnez bien H4 en utilisant le μManager GUI ( &quot;contrôle de XYZ: Allez bien: H4&quot;). </li><li> Utilisation de l&#39;μManager GUI, sélectionnez les filtres (Excitation 434/17 nm, dichroïque, émission 482/25 nm) pour l&#39; imagerie mTqFP. </li><li> Utilisez la fonction Recherche de MaxPoint sur toute la gamme de la boîte de délai rapide et ensuite ajuster la boîte de retard grossier de sorte que le profil complet de décroissance est dans la plage de retard de la boîte de délai rapide. </li><li> Définissez le délaiau point d&#39;intensité maximale en changeant le «contrôle de FLIM: boîte de délai rapide: réglage de retard actuel (ps)&quot;. Réglez les paramètres d&#39;acquisition (de densité neutre, le temps d&#39;exposition) de sorte que la CCD ne soit pas saturé. </li><li> Définir les étapes de retard de 25 ps sur la gamme complète des retards ( &quot;de contrôle FLIM: boîte de délai rapide: Peupler retards). </li><li> Acquérir des données de colorant de référence en appuyant sur &quot;image snap FLIM&quot;. </li><li> Acquérir une image de la caméra CCD deuxième de fond en bloquant le laser d&#39;excitation (voir 2.11.7) </li></ol></li><li> Acquérir des données FLIM de l&#39;échantillon de plaque multipuits en utilisant le logiciel d&#39;acquisition μManager: <ol><li> Set qui les puits doivent être imagés et le nombre de FOV à acquérir par puits ( &quot;HCA Setup acquisition séquencée: positions XYZ»). </li><li> sélectionner manuellement un FOV de modèle contenant l&#39;échantillon à imager. Utilisez ce FOV pour déterminer le filtre de densité neutre optimale, largeur de grille au GOI ettemps d&#39;intégration de la caméra de manière à atteindre 75% de la plage dynamique de la caméra CCD. </li><li> Régler autofocus ( &quot;contrôle de XYZ: Autofocus»): Appuyez sur &quot;commande de mise au point de retour seulement», puis se concentrer manuellement sur les cellules ou structure d&#39;intérêt. Set &quot;Autofocus plage de recherche&quot; à 2000 pm et appuyez sur &quot;Entrée&quot;. Appuyez sur &quot;AF maintenant&quot; pour lancer une procédure de mise au point automatique. Une valeur de décalage sera affiché dans le champ &quot;FocusOffset (Autofocus)&quot;. </li><li> Entrez la valeur de décalage obtenue en 2.13.3 en «AF offset» et répétez la procédure de mise au point automatique à deux reprises ( &quot;AF maintenant&quot;) pour vérifier que la valeur de décalage est maintenant à zéro, ce qui indique le bon fonctionnement du système de mise au point automatique. </li><li> Utilisez la fonction &quot;AutoGate&quot; dans le logiciel d&#39;acquisition OpenFLIM-HCA pour choisir un échantillonnage logarithmique des points de retard. Alternativement, ils peuvent être sélectionnés manuellement, voir les référencesrence 36 pour plus de détails. </li><li> Set &quot;Accumulez Frames&quot; à une valeur que les rendements souhaités temps total d&#39;acquisition de données. L&#39;augmentation du nombre d&#39;images accumulées augmente le rapport signal sur bruit des données FLIM au détriment de augmente également le temps total d&#39;acquisition de données de FLIM. </li><li> Exécutez l&#39;acquisition de FLIM de la plaque multipuits en appuyant sur le bouton &quot;Démarrer séquence HCA&quot;. </li></ol></li><li> Acquérir une autre image de fond de CCD de la caméra en bloquant le laser d&#39;excitation (voir 2.11.7) avec des paramètres d&#39;acquisition identiques que ceux utilisés pour l&#39;acquisition de données FLIM. </li></ol> 3. openFLIM-HCA analyse des données utilisant FLIMfit <ol><li> Vérifiez que les fichiers auxiliaires nécessaires pour l&#39; analyse de données FLIM sont présents (ie, l&#39; IRF et la mesure du colorant de référence). </li><li> Chargez les données du puits vide (H1), le milieu de culture contenant bien (H2) et les puits contenant des cellules non marquées dans un milieu de culture (H3) dans FLIMfit( &quot;Fichier: données FLIM Load&quot;) pour vérifier s&#39;il y a des contributions de fond supérieur à 1% du signal provenant des cellules exprimant «donneur-seulement», à savoir, dans les puits A1-G3. </li><li> Préparer un fond (TVB) fichier variant dans le temps en chargeant le moyen bien avec la culture dans FLIMfit ( &quot;Fichier: données FLIM Load&quot;). Chargez les données caméra de fond acquises à l&#39; article 2.14 ( «Contexte: Charge de fond&quot;) et utiliser l&#39;option FLIMfit &quot;Outils: Créer TVB Intensity carte&quot; pour générer la TVB. Voir la référence 31 pour plus de détails sur la TVB. </li><li> Préparer le variant spatialement IRF Maj Carte en chargeant les données IRF acquises à l&#39;article 2.11 et de soustraire l&#39;arrière-plan de la caméra CCD acquise dans la section 2.11.7. Utilisez l&#39;option FLIMfit &quot;Outils: Créer IRF Maj carte&quot; pour calculer la variation de l&#39; espace IRF Maj Carte. Voir la référence [31] pour plus de détails sur la IRF Maj Carte. </li><li> Monter un monoexponentiel décroissance aux données de colorants de référence acquises à la section 2.12. Colorant de charge de référence et la carte IRF variant spatialement calculé à la section 3.4, paramètres d&#39; ajustement fixés ( &quot;Durée de vie: No. Exp: 1&quot;) avec t 0 set comme un paramètre ajusté ( &quot;Durée de vie: FIT IRF Shift: Aménagée&quot;). La valeur de t 0 obtenue est ensuite rapportée dans le tableau figurant à l&#39;onglet &quot;Paramètres&quot;. </li><li> Analyser les données FLIM en chargeant les données de FLIM expérimentales acquises dans la section 2.13, la variation spatiale IRF Carte calculée dans la section 3.4, l&#39;arrière - plan de la caméra acquise dans la section 2.14, le fichier TVB préparé dans la section 3.3 et tapez la valeur négative de t 0 obtenue dans la section 3.5 ( &quot;IRF: IRF changement: t 0&quot;). Montez ensuite les données expérimentales au modèle de décroissance souhaitée à l&#39; aide FLIMfit 36 selon les exigences de l&#39;expérience. </li></ol>

The authors have nothing to disclose. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Nous avons décrit un microscope à plaque multipuits automatisé conçu pour HCA en utilisant FLIM temps-dépendants. Cet instrument est contrôlé en utilisant un logiciel open source écrit en μManager avec la possibilité d&#39;enregistrer les données sur un serveur OMERO et l&#39;analyse des données de FLIM entrepris en utilisant FLIMfit 36, un programme open source écrit en MatLab et disponible en tant que client OMERO 32 L&#39;instrument μManager logiciel de contrôle, openFLIM-HCA, est disponible en ligne 33 avec une liste des composants du système 48 pour permettre aux chercheurs universitaires de construire leurs propres instruments FLIM HCA. Afin d&#39;acquérir des données de FLIM robustes, il est nécessaire d&#39;optimiser les paramètres d&#39;acquisition GOI et CCD et de tenir compte de toutes les variations de t 0. Comme décrit dans 3.8.2, le réglage de gain et une caméra CCD temps d&#39;intégration GOI devrait être réglé pour atteindre ~ 75% de la gamme dynamique de CCD. Uchanter plus élevés tensions GOI et plusieurs accumulations de cadre CCD à chaque retard de porte de temps augmente le rapport signal sur bruit 49 mais cela augmente le temps d&#39;acquisition de FLIM totale (depuis moins de photons de fluorescence sont acquises par trame avant les sature de la caméra CCD et donc le nombre d&#39;accumulations de cadre devrait être augmenté) et donc ce compromis devrait être décidée pour chaque expérience. L&#39;étalonnage du générateur de retard dépend de la fréquence de répétition du laser et il est donc nécessaire de faire en sorte que le fichier d&#39;étalonnage correct pour la vitesse de répétition utilisée est chargée dans le logiciel d&#39;acquisition. La procédure de calibrage de la boîte de retard peut être trouvé sur le wiki openFLIM-HCA 33. Si l&#39;autofluorescence cellulaire est faible par rapport au signal de fluorescence, nous utilisons le signal d&#39;un juste milieu de culture contenant bien de fournir le contexte variant dans le temps (TVB). Pour réduire au minimum la fluorescence de fond à partir du milieu de culture cellulaire, on évitedes milieux contenant du rouge de phénol. Si l&#39;auto-fluorescence cellulaire est importante, la TVB peut être dérivée de mesures des cellules non marquées. Cependant, dans ce cas, il faut prendre soin, car cela suppose que l&#39;arrière-plan d&#39;autofluorescence est le même pour chaque pixel de l&#39;image. Cette hypothèse ne sera pas valide si le autofluorescence varie considérablement d&#39;une cellule ou si le faisceau d&#39;excitation ou de la sensibilité de détection est pas uniforme sur le champ de vision. L&#39;acquisition d&#39;une image en utilisant IRF dispersés impulsions de lumière d&#39;excitation fournit le profil IRF temporelle qui est convolution avec le modèle de données dans le processus de montage et prévoit également une carte de la variation spatiale de l&#39;IRF à travers le champ de vision. FRI peut être mesurée par imagerie d&#39;un échantillon de la dispersion telle qu&#39;une suspension colloïdale, bien que, dans notre instrument, en utilisant une lumière d&#39;excitation diffusée à partir du disque de Nipkow fournit une mesure propre de l&#39;IRF. La détermination précise du moment of l&#39;IRF est important parce que les erreurs dans le délai entre l&#39;excitation et le temps de déclenchement peuvent avoir un impact significatif du processus d&#39;ajustement, en particulier lors du montage à des modèles complexes de décroissance exponentielle. L&#39;IRF a acquis en utilisant la lumière d&#39;excitation diffusée est pas exactement ce qui est nécessaire pour le processus d&#39;ajustement, car il est enregistré à la longueur d&#39;onde d&#39;excitation plutôt que la longueur d&#39;onde d&#39;émission de fluorescence, ce qui peut affecter son timing, bien que la variation spatiale de l&#39;IRF doit être le même aux deux longueurs d&#39;onde. En outre, l&#39;IRF dispersée peut être déplacé globalement en temps par rapport à la véritable IRF en raison d&#39;une longueur de trajet optique différente de l&#39;objet de diffusion, comme cela est le cas pour un IRF acquis à partir du disque Nipkow en FLIM optiquement sectionnée. Cette correction, t 0, ce qui est le décalage temporel global nécessaire qui devrait être appliqué à l&#39;IRF dispersés de lumière d&#39;excitation acquise, est calculée à partir des données de colorant de référence monoexponentielles comme indiqué dans Protocol étape 4.4. Les colorants suivants peuvent être utilisés pour différentes longueurs d&#39; onde d&#39;excitation: une coumarine 153 solution à 75 uM dans du methanol (4,3 ns τ ~ 50) peut être utilisé pour l&#39; excitation dans la gamme de 295-442 nm; une 6 solution à 75 uM coumarine dans l&#39; éthanol (2,43 ~ T pour ns 37) peuvent être utilisés pour l&#39; excitation dans la gamme 430-500 nm; et une solution à 75 uM de rhodamine B dans l&#39; eau (τ ~ 1,7 ns 37) peut être utilisé pour l&#39; excitation dans la gamme 488-575 nm. Nous notons que, bien qu&#39;il soit possible de FLIMfit utiliser un autre IRF pour chaque pixel du système, généralement , il est raisonnable de faire l&#39;hypothèse que l&#39;IRF variant spatialement a le même profil temporel pour chaque pixel de l&#39;image , mais présente une gamme des décalages temporels variant spatialement par rapport à la t globale 0. Nous décrivons ce que la carte de décalage IRF, qui est déterminée à partir de l&#39;IRF de la lumière diffusée. Ensemble, le profil IRF, t 0 et la carte IRF de décalage sont utilisés pour enen sorte que chaque pixel dans le champ de vision est équipée d&#39;un IRF approprié. Surtout, t 0 peut varier lentement au fil du temps de sorte qu&#39;il doit être mesurée avant toute acquisition de données FLIM. L&#39;utilisateur doit décider comment échantillonner profils de désintégration des fluorescence et est nécessaire pour définir la largeur des temps-portes et leurs retards relatifs après excitation. D&#39;une manière générale, il est souhaitable d&#39;utiliser des grandes largeurs de grille afin de maximiser le signal détecté et typiquement on utiliser des largeurs de grille fixées à 4 ns pour FLIM de cellules marquées aux protéines fluorescentes. Le nombre de temps à grille des retards devrait être suffisant pour échantillonner le profil fluorescent de décroissance (y compris une porte fixé pour mesurer le signal juste avant l&#39;impulsion d&#39;excitation) compte tenu de la complexité de l&#39;ajustement du modèle qui sera utilisé dans l&#39;analyse. La valeur optimale peut dépendre de la durée de vie et les amplitudes relatives des composants de désintégration. En général, 4 portes sont suffisantes pour monoexponentielle raccord désintègre alors 7 ou plusieurs portes peuventêtre utilisé pour d&#39;autres modèles de désintégration complexes. Nous notons que FLIM peut être implémentée en utilisant une gamme de techniques dans le domaine temporel ou dans le domaine fréquentiel et automatisé HCA FLIM de réseaux de plaques multipuits a été mis en œuvre d&#39; abord dans un (non-tronçonnage) grand champ microscope en utilisant des lectures domaine fréquentiel à vie de FRET 51. La première optique tronçonnage FLIM lecteur de plaques multipuits automatisé pour HCA utilisant grand champ time-gated imagerie 28 a ensuite été signalé. Par la suite, à grand champ (non-tronçonnage) domaine fréquentiel FLIM HCA a été appliqué à l&#39; écran pour modifications post traductionnelles (tyrosine phosphorylation) à travers une banque de gènes en utilisant FRET 52 et le temps-gated FLIM HCA a été appliqué à FRET tests de HIV-1 Gag 53 oligomérisation et de sumoylation de FOXM1 54 et Raichu RhoA et Rac1 biocapteurs 33. Il est également possible d&#39;utiliser TCSPC pour multipuits plaque FLIM 26 mais à ce jour il est apparu difficile de faire correspondre til débit de techniques exploitant la détection à grand champ. Une approche émergente qui pourrait résoudre ce problème est l&#39;utilisation de tableaux de simples détecteurs de comptage de photons tels que des tableaux de SPAD 55. Nous notons que les lectures de FRET utilisant des protéines fluorescentes doivent être traités avec prudence et que les valeurs absolues des paramètres obtenus à partir de FLIMfit ou tout autre logiciel d&#39;analyse FLIM dépendra des hypothèses associées à l&#39;ajustement du modèle. Par exemple, lorsque le donneur de FRET a une deuxième composante importante de décroissance, l&#39;utilisation d&#39;un modèle biexponentielle pour ajuster les données FRET FLIM peut entraîner la contribution de la composante décroissance plus rapide, généralement associé à la population FRETing apparaissant plus élevée qu&#39;elle ne le devrait. Il est donc souhaitable d&#39;utiliser des donneurs avec une durée de vie mono-exponentielle telle que mTq2FP. Même alors, des études récentes ont montré que l&#39;analyse FRET peut encore être affectée par les états sombres de protéines de fluorescence de l&#39;accepteur ou parhétérogénéité du facteur d&#39;orientation κ 2 en raison d&#39;une distribution de conformations fluorophores avec une variété d&#39;angles et les distances chromophores 56. Néanmoins, nous et d&#39;autres ont montré que la durée de vie de fluorescence des lectures de FRET produisent des résultats utiles qui sont en corrélation avec les mesures biochimiques et peuvent être utilisés pour dépister les interactions entre protéines ou de suivre la dynamique de biocapteurs. Ainsi , cette plate - forme HCA openFLIM peut être appliqué à une large gamme de dosages basés sur la durée de vie de fluorescence, FRET utilisant l&#39; autofluorescence cellulaire ou 8, ainsi que fournir des lectures quantitatives des sondes à base de colorants 25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="549">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">microscope frame&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">IX81</td>
			<td style="width:101px;">&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">optical autofocus</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">ZDC</td>
			<td>&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">motorized (x-y-z) microscope stage</td>
			<td style="width:64px;">Marzhauser</td>
			<td style="width:64px;">00-24-565-0000</td>
			<td>Stage with Corvus controlle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">excitation laser source</td>
			<td style="width:64px;">Fianium</td>
			<td style="width:64px;">SC400-4</td>
			<td>Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:320px;">gated optical intensifier&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">High Rate Imager (HRI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">delay generators</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>See agile delay generator and precision delay generator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">camera</td>
			<td style="width:64px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:64px;">ORCA-ER-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Nipkow disc scanner unit&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:64px;">CSU-X1&#160;</td>
			<td>http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Top hat diffuser</td>
			<td style="width:64px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:64px;">ED1-S20-MD</td>
			<td>Engineered diffusers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5V&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3850</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq17V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3847</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq32V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3848</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5A</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3849</td>
			<td>mTurquoise Amber construct</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">HEK293T</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>cell type used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">phenol red-free HBSS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>55021C-1000ML</td>
			<td>imaging media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">culture media</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td>DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">DMEM</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">FBS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">xTremeGene9</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>6.37E+09</td>
			<td>for transfection, follow online protocol from La Roche</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">trypsin/EDTA Solution</td>
			<td style="width:64px;">Thermo Fischer</td>
			<td style="width:64px;">R001100</td>
			<td>for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

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Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Nous présentons une open source haute analyse de contenu (HCA) en utilisant l&#39;instrument automatisé d&#39;imagerie de fluorescence à vie (FLIM) pour analyser les interactions entre protéines en utilisant Förster transfert d&#39;énergie par résonance (FRET) Affichages sur la base. L&#39; acquisition de données pour cet instrument openFLIM-HCA est contrôlé par un logiciel écrit en μManager et l&#39; analyse des données est effectuée en FLIMfit.

Open Source Content Haute Analyse Utilisant automatisé Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Research

JoVE Journal

Biology

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High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

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