Name: open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy
Uploaded: 2017-01-18T14:00:00
Duration: 9 min 30 s
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The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.

1. Herstellung der Multiwell-Platte Array <ol><li> Eine Lösung aus 75 &amp; mgr; M Cumarin 6 in Ethanol (τ ~ 2,43 ns) für Referenzmessungen ermöglichen die Bestimmung von t 0. </li><li> Seed 150.000 Cos-Zellen in vier Vertiefungen einer 6-Well-Platte und lassen Sie über Nacht in Kulturmedium zu befestigen (siehe Materialliste). </li><li> Transfizieren ein gut jeder mit mTq5A, mTq5V, mTq17V und mTq32V Kommerzielle Transfektionsreagenz Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers und Kultur für 24 Stunden. </li><li> Zellen abzulösen Kommerzielle Trypsin / EDTA-Lösung nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Pipette 5000 Zellen Cos suspendiert in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) mTq5A in jede der Vertiefungen A1-G3 eines # 1.5 Dicke Glasboden 96 Multiwell-Platte exprimiert, das mit Poly-L-lysin behandelt zuvor wurde. Wiederholen Sie dies für mTq5V Zellen in die Vertiefungen A4-G6, mTq17V in die Vertiefungen A5-G9 und mTq32V in die Vertiefungen A10-G12 Ausdruck zu bringen. </li&gt; <li> Lassen Sie gut H1 leer (Messung aller statischen Hintergrund aus der Multi-Well-Platte zur Verfügung zu stellen). </li><li> Pipette 200 ul HBSS nur in gut H2 (Messung von jedem Hintergrundsignal aus dem Zellkulturmedium zu schaffen). </li><li> Pipette 5000 nicht transfizierten Zellen in HBSS in gut H3 (Messung von jedem Hintergrundsignal von zellulären Autofluoreszenz zur Verfügung zu stellen). </li><li> Pipette 200 &amp; mgr; l der 75 &amp; mgr; M Cumarin - Farbstoff - Lösung in gut H4 (eine Kontrolle über jede Variation von t 0 in der Multiwell - Platte Erfassung zu schaffen, beispielsweise aufgrund von Änderungen der Umgebungstemperatur oder Schwankungen in Laser oder Zeitschaltung. </li></ol> 2. openFLIM-HCA Datenerfassung Hinweis: Detaillierte Informationen über die openFLIM-HCA Wiki 33 finden kann. <ol><li> Starten Sie μManager und die OpenFLIM-HCA - Plugin </li><li> Wählen Sie die Kalibrierungsdatei für die spezifische Kombination von Verzögerungsgeneratoreinheit undLaser-Wiederholungsrate unter &quot;FLIM Kontrolle: Verzögerung Box Kalibrierungsdatei: Kalibrierung von Dateien&quot;. </li><li> Stellen Sie den Ordner , in dem die Daten unter gespeichert werden &quot;Datei: Set Basisordner&quot;. </li><li> Anregungsstrahlengang überprüfen, dass die Kopplung in die Förder optische Faser, um sicherzustellen, ist stabil und dass die Kopplungseffizienz wird durch die Messung übertragenen Leistung durch Lieferung Faser mit einem Leistungsmesser maximiert. Schwankungen von weniger als 5% sind akzeptabel. </li><li> Überprüfen Sie, ob die indische Regierung Auslösung durch die indische Regierung Eingangstriggersignal ausgelöst auf den Monitor-Ausgangssignal von dem GOI Anzeige Oszilloskop stabil ist. </li><li> Überprüfen Sie die Abbildung des GOI Phosphor auf den CCD-Sensor durch die Photokathode der GOI abdeckt, Einstellung seiner Verstärkung auf 750 V und einer der Übertragungslinsen konzentrieren, so dass Bilder von spärlich Einzelphotonenereignisse (aufgrund von Hintergrundlicht, obwohl die indische Regierung Abdeckung undicht ) auf der CCD erfasst sind so scharf wie möglich ist. </li><li> Überprüfen Sie, ob die ProbeSichtfeld wird durch Abbilden eines gleichförmigen Leuchtstoffprobe, wie beispielsweise ein Abfall der Referenzfarbstofflösung auf einem Deckglas, mit einer ausreichend niedrigen Anregungsleistung (&lt;1 &amp; mgr; W), um sicherzustellen, dass das GOI nicht gesättigt gleichmäßig beleuchtet. </li><li> Wählen Sie die entsprechende Platte Definitionsdatei, also wählen Sie die Option für 96-Well - Platten ( &quot;File: Lastplatteneigenschaften&quot;). </li><li> Mit Hilfe der μManager GUI, stellen Sie sicher , dass es keine dichroitische Strahlteilerwürfel im Mikroskoprahmen durch eine leere Position auswählen. </li><li> Wählen Sie manuell die indische Regierung für das gesamte Experiment eine Gate-Breite von 4 ns bei. </li><li> Erwerben Sie IRF Bilddaten: <ol><li> Mit Hilfe der μManager GUI, stellen Sie sicher , dass es keine Mikroskopobjektiv in den Strahlengang durch eine leere Position auswählen. Stellen Sie manuell eine schwarz eloxierte Strahlblock oberhalb des Objektivrevolvers jede Laserlicht Entkommen und Winkel zu verhindern, dass es jede Reflexion zurück in das Mikroskop Rahmen zu minimieren. </li> &lt;li&gt; Mit dem μManager GUI, setzen Sie die Filter in der CSUX (Erregungs, Dichroic, Emission) , so dass der Anteil der von der Spinn Nipkow - Scheibe verstreut Anregungslicht abgebildet werden kann , sondern sicherstellen , dass die Intensität nicht ausreicht, um das System für eine 200 zu sättigen ms CCD Integrationszeit. Dies ist zu vermeiden, dass die indische Regierung Fotokatode Belichtungslicht zu viel, was die Fotokatode beschädigen könnten. </li><li> Verwenden Sie das Such maxpoint Funktion über den gesamten Bereich der durch die programmierbare schnelle Verzögerung Feld abgedeckt Verzögerungen. Überprüfen Sie das Ausgabediagramm dargestellt und passen Sie dann die manuelle Kurs Verzögerung Feld durch die Vorwärts-Taste drücken, so dass die volle IRF Profil innerhalb der Scanbereich des schnellen Verzögerung Box ist. </li><li> Passen Sie die Aufnahmeparameter (Neutraldichte, Belichtungszeit, Frame Akkumulation) , so dass die CCD nicht in der hellsten Zeit-Tor gesättigt und die effektive Integrationszeit&gt; 200 ms. </li><li> Stellen Sie Verzögerung Schritten von 25 ps über die volle Verzögerung klingeltee ( &quot;FLIM Kontrolle: Fast Verzögerung Box: Bestücken Verzögerungen&quot;). </li><li> Erwerben Sie IRF Bild von &quot;Snap - FLIM Bild&quot; drücken. </li><li> Erwerben Sie ein Hintergrundbild durch den Laser blockiert ( &quot;Light Bahnsteuerung: Neutraldichte: gesperrt&quot;), die Verringerung der Anzahl der Verzögerungen ( &quot;FLIM Kontrolle: Fast Verzögerung Feld: aktuelle Verzögerungseinstellung (ps)&quot;), lassen Sie alle anderen Eigenschaften unverändert und drücken Sie &quot;Snap - FLIM Bild&quot;. </li></ol></li><li> Erwerben Referenzfarbstoff Daten: <ol><li> Gut H4 Wählen Sie mit der μManager GUI ( &quot;XYZ Steuerung: Zum gut: H4&quot;). </li><li> Mit Hilfe der μManager GUI, wählen Sie Filter (Erregungs 434/17 nm, Dichroic, Emission 482/25 nm) für mTqFP Bildgebung. </li><li> Verwenden Sie das Such maxpoint Funktion über den gesamten Bereich der schnellen Verzögerung Box und dann die Grobverzögerungsfeld einstellen , so dass die volle Abklingprofil innerhalb der Verzögerungsbereich des schnellen Verzögerung Box ist. </li><li> Stellen Sie die Verzögerungbis zu dem Punkt der maximalen Intensität von &quot;FLIM Kontrolle: Fast Verzögerung Feld: Aktuelle Verzögerungseinstellung (ps)&quot; zu ändern. Anpassen der Erfassungsparameter (Neutraldichte, Belichtungszeit) , so dass die CCD nicht gesättigt ist. </li><li> Stellen Sie Verzögerung Schritten von 25 ps über die volle Verzögerungsbereich ( &quot;FLIM - Steuerung: Schnelle Verzögerung Box: Bestücken Verzögerungen). </li><li> Erwerben Referenzfarbstoff Daten durch &quot;Snap - FLIM Bild&quot; drücken. </li><li> Erwerben Sie einen zweiten Hintergrund CCD-Kamerabild durch die Anregungslaser blockiert (siehe 2.11.7) </li></ol></li><li> Erwerben Sie FLIM Daten der Multi - Well - Platte Probe die μManager Erfassungs - Software verwenden: <ol><li> Set , die Brunnen sollte und die Anzahl der FOV abgebildet werden pro Well ( &quot;Setup HCA sequenzierten Erwerb: XYZ - Positionen&quot;) erworben werden. </li><li> Wählen Sie manuell ein FOV Exemplar mit der Probe abgebildet werden. Verwenden Sie diese FOV, um zu bestimmen, die optimale Neutraldichtefilter, Gate-Breite bei der indischen Regierung undIntegrationszeit der Kamera, um 75% des dynamischen Bereichs der CCD-Kamera zu erreichen. </li><li> Set Autofokus ( &quot;XYZ Steuerung: Autofokus&quot;): Drücken Sie &quot;Return Fokussteuerung nur&quot;, und konzentrieren uns dann manuell auf die Zellen oder die Struktur von Interesse. Stellen Sie &quot;AF - Suchbereich&quot; bis 2000 um und drücken Sie &quot;Enter&quot;. Drücken Sie &quot;AF jetzt&quot; eine Autofokus - Verfahren einzuleiten. Ein Offset - Wert wird im Feld &quot;FocusOffset (Autofokus)&quot; angezeigt. </li><li> Geben Sie den in 2.13.3 erhaltenen Offset - Wert in die &quot;AF - Offset&quot; und wiederholen Sie den Autofokus - Vorgang zweimal ( &quot;AF jetzt&quot;) zu prüfen, ob der Offset - Wert nun Null ist, korrekte Funktion des Autofokus - System anzeigt. </li><li> Verwenden Sie die &quot;Autogate&quot; -Funktion in der OpenFLIM-HCA - Erfassungssoftware eine logarithmische Abtastung der Verzögerung Punkte zu wählen. siehe Alternativ können diese manuell ausgewählt werden, sieheENCE 36 für weitere Details. </li><li> Set &quot;Accumulate Frames&quot; auf einen Wert , dass die Renditen Gesamtdatenerfassungszeit gewünscht. Erhöhen der Anzahl der akkumulierten Rahmen erhöht Signal-Rausch-Verhältnis der FLIM Daten auf Kosten der Gesamt auch FLIM Datenerfassungszeit zu erhöhen. </li><li> Führen Sie die FLIM Erwerb der Multiwell - Platte durch die &quot;Start HCA - Sequenz&quot; Taste drücken. </li></ol></li><li> Erwerben Sie eine weitere Bildkamera Hintergrund CCD durch die Anregungslaser blockiert (siehe 2.11.7) mit identischen Erwerb Einstellungen wie für die FLIM Datenerfassung. </li></ol> 3. openFLIM-HCA Datenanalyse FLIMfit Verwendung <ol><li> Überprüfen Sie, dass notwendige Zusatzdateien für FLIM Datenanalyse vorhanden sind (dh IRF und Referenzfarbstoff - Messung). </li><li> Laden der Daten aus dem leeren Vertiefung (H1), wobei die Vertiefung mit Kulturmedium (H2) und die Vertiefung mit unmarkierten Zellen in Kulturmedium (H3) in FLIMfit( &quot;File: Laden FLIM - Daten&quot;) zu überprüfen , ob es irgendwelche Hintergrundbeiträge von mehr als 1% des Signals aus den Zellen &quot;Spender-only&quot; zum Ausdruck, das heißt, in den Vertiefungen A1-G3. </li><li> Bereiten Sie eine zeitlich veränderlichen Hintergrund (TVB) Datei durch die gut mit Kultur laden Medium in FLIMfit ( &quot;File: Laden FLIM Daten&quot;). Legen Sie die Kamera Hintergrunddaten in Abschnitt erworben 2,14 ( &quot;Hintergrund: Hintergrund laden&quot;) und verwenden Sie die FLIMfit Option &quot;Tools: Erstellen TVB Intensitätskarte&quot; , um den TVB erzeugen. Siehe 31 für weitere Einzelheiten über den TVB verweisen. </li><li> Bereiten Sie die räumlich variierende IRF Shift-Karte durch die IRF-Daten in Abschnitt erworben Laden 2.11 und subtrahieren Sie die CCD-Kamera Hintergrund in Abschnitt 2.11.7 erworben. Verwenden Sie die FLIMfit Option &quot;Tools: Erstellen IRF Umschalt Map&quot; , die räumlich zu berechnen unterschiedlichen IRF Karte verschieben. Siehe Referenz [31] für nähere Informationen auf der IRF Shift-Map. </li><li> Setzen Sie einen monoexponenTiAl Zerfall zu den 2.12 in Abschnitt erfassten Daten Referenzfarbstoff. Lastreferenzfarbstoff und die räumlich berechnet unterschiedlichen IRF Karte in Abschnitt 3.4, setzen Fitparameter ( &quot;Lebensdauer: Nein . Exp: 1&quot;) mit t 0 - Set als Einbauparameter ( &quot;Lebensdauer: FIT IRF Shift: Ausgestattet&quot;). Der Wert von t 0 erhalten wird , dann in der Tabelle in der Registerkarte &quot;Parameter&quot; angezeigt berichtet. </li><li> Analysieren Sie die FLIM Daten , die durch die experimentellen FLIM Daten in Abschnitt erworben Laden 2.13, die räumlich variierende IRF Karte in Abschnitt berechnet 3.4, die Kamera Hintergrund in Abschnitt erworben 2.14 erstellte die TVB - Datei in Abschnitt 3.3 und geben Sie den negativen Wert von t 0 erhalten in Abschnitt 3.5 ( &quot;IRF: IRF Verschiebung: t 0&quot;). Dann passen die experimentellen Daten an das Modell gewünschten Zerfall unter Verwendung FLIMfit 36 entsprechend den Anforderungen des Experiments. </li></ol>

The authors have nothing to disclose. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Wir haben ein automatisiertes Multiwellplatte Mikroskop für HCA mit zeitgesteuerten FLIM entworfen beschrieben. Dieses Instrument ist Open - Source - Software mit der Option in μManager geschrieben gesteuert unter Verwendung der Daten zu einem OMERO Server zu speichern und die Analyse FLIM Daten unternommen 36 FLIMfit Verwendung ist, ein Open - Source - Programm geschrieben in Matlab und erhältlich als OMERO Client 32 μManager Instrument Steuerungssoftware, openFLIM-HCA, ist eine Online - 33 mit einer Liste der Systemkomponenten 48 verfügbaren akademischen Forschern zu ermöglichen , ihre eigenen FLIM HCA Instrumente zu bauen. Um robuste FLIM Daten zu erfassen, ist es notwendig , die indische Regierung und CCD Erwerb Einstellungen zu optimieren und 0 Berücksichtigung etwaiger Änderungen in t zu nehmen. Wie in 3.8.2 beschrieben, sollte die indische Regierung Verstärkungseinstellung und CCD-Kamera Integrationszeit ~ 75% des CCD-Dynamikbereich zu erreichen eingestellt werden. Usingen höhere GOI Spannungen und mehrere CCD - Rahmen Akkumulationen in jedem Zeitgatterverzögerung erhöht das Signal - Rausch - Verhältnis 49 jedoch erhöht dies die Gesamt FLIM Erfassungszeit (da weniger Fluoreszenzphotonen pro Rahmen vor der CCD - Kamera sättigt erfasst werden und so die Anzahl der Rahmen Akkumulationen erhöht werden) und so diese Trade-off für jedes Experiment werden sollte, entschieden sollte. Die Kalibrierung des Verzögerungsgenerators hängt von der Laserwiederholungsrate, und es ist daher notwendig, dass die richtige Kalibrierungsdatei für die Wiederholungsrate, um sicherzustellen, verwendet wird, in die Akquisitionssoftware geladen. Das Verfahren zur Kalibrierung der Verzögerung Box kann auf der openFLIM-HCA Wiki 33 gefunden werden. Wenn das zellulare Autofluoreszenz auf das Fluoreszenzsignal gering im Vergleich ist, verwenden wir das Signal von einem gut enthält nur Kulturmedium mit der zeitveränderlichen Hintergrund (TVB) bereitzustellen. In den Hintergrundfluoreszenz aus dem Zellkulturmedium zu minimieren, vermeidenMedien Phenolrot enthält. Wenn das zellulare Autofluoreszenz signifikant ist, dann kann der TVB aus Messungen der unmarkierten Zellen abgeleitet werden. Allerdings muss in diesem Fall darauf geachtet werden, wie dies setzt voraus, daß der Hintergrund-Autofluoreszenz der gleiche für jedes Pixel in dem Bild ist. Diese Annahme wird ungültig, wenn der Autofluoreszenz signifikant in einer Zelle oder wenn der Anregungsstrahl oder Erfassungsempfindlichkeit variiert nicht gleichmäßig über das Sichtfeld. Der Erwerb eines IRF Bildimpulsen gestreute Anregungslicht liefert die zeitliche IRF-Profil, das mit dem Datenmodell in den Anpassungsprozess und bietet auch eine Karte der räumlichen Variation des IRF über das Sichtfeld convolved wird. Das IRF kann durch Abbilden einer Streuprobe, wie eine kolloidale Suspension, obwohl in unserem Instrument gemessen werden, unter Verwendung von Anregungslicht gestreut von der Nipkow-Scheibe eine sauberere Messung des IRF bietet. Eine genaue Bestimmung des Zeitpunkts of die IRF ist wichtig, weil Fehler in der Zeitverzögerung zwischen der Anregung und zeit Gating signifikant die Anpassungsprozess auswirken können, insbesondere bei der Montage zu komplexen exponentiellen Zerfallsmodellen. Das IRF erworben gestreutem Erregungslicht nicht genau das, was für den Anpassungsprozess benötigt wird, weil es bei der Anregungswellenlänge aufgezeichnet wird, und nicht auf der Fluoreszenzemissionswellenlänge, die ihre Zeitsteuerung beeinflussen können, auch wenn die räumliche Variation des IRF gleich sein sollten bei beiden Wellenlängen. Zusätzlich kann die Streu IRF global kann in der Zeit relativ zu dem wahren IRF aufgrund einer unterschiedlichen optischen Weglänge von dem Streuobjekt verschoben, wie es der Fall für eine IRF ist von der Platte Nipkow erworben in optisch unterteilten FLIM. Diese Korrektur, t 0, was die erforderliche globale zeitliche Verschiebung ist, die auf die erworbenen gestreuten Anregungslicht IRF angewendet werden soll, wird aus den monoexpotentielles Referenzfarbstoff Daten berechnet , wie in Protocol Schritt 4.4. Die folgenden Farbstoffe können für verschiedene Anregungswellenlängen verwendet werden: eine 75 &amp; mgr; M Cumarin 153 - Lösung in Methanol (τ ~ 4,3 ns 50) kann im Bereich von 295 bis 442 nm für die Anregung verwendet werden; eine 75 &amp; mgr; M Cumarin 6 -Lösung in Ethanol (τ ~ 2,43 ns 37) kann im Bereich von 430-500 nm für die Anregung verwendet werden; und einer 75 &amp; mgr; M Rhodamin B - Lösung in Wasser (τ ~ 1,7 ns 37) für eine Anregung im Bereich von 488 bis 575 nm verwendet werden. Wir bemerken , dass, obwohl es in FLIMfit möglich ist, in der Regel eine andere IRF für jedes Pixel des Systems zu verwenden , ist es sinnvoll, die Annahme zu machen , daß das räumlich variierende IRF den gleichen zeitlichen Verlauf für jedes Pixel in dem Bild hat stellt aber eine Reihe unterschiedlicher räumlich zeitlichen Verschiebungen relativ zum globalen t 0. Wir bezeichnen dies als die IRF Schaltkarte, die aus dem Streulicht IRF bestimmt wird. Zusammen sind das IRF - Profil, t 0 und die IRF Verschiebung Karte en verwendetsicher, dass jedes Pixel in dem FOV mit einem geeigneten IRF angebracht ist. Wichtig ist, dass t 0 langsam im Laufe der Zeit variieren , so dass es vor jedem FLIM Datenerfassung gemessen werden soll. Der Benutzer sollte entscheiden, wie die Fluoreszenzabklingkurve Profile zur Probe und wird benötigt, um die Breite der Zeitfenster und ihre relativen Verzögerungen nach der Anregung zu setzen. Im allgemeinen ist es wünschenswert, breite Gatebreiten verwenden, um das detektierte Signal zu maximieren und typischerweise verwenden wir Gate-Breiten auf 4 ns für FLIM von mit Fluoreszenzproteine ​​markierten Zellen. Die Anzahl der Zeit-Gate-Verzögerungen sollte ausreichen, um das fluoreszierende Abklingprofil Probe (einschließlich ein Tor gesetzt, das Signal unmittelbar vor dem Anregungsimpuls zu messen) die Komplexität der Anpassungsmodell gegeben, die in der Analyse verwendet werden. Der optimale Wert kann auf die Lebensdauer und die relativen Amplituden der Zerfallskomponenten abhängen. In der Regel 4 Tore für die Montage monoexpotentielles ausreichend sind, zerfällt während 7 oder mehr Tore könnenwerden für komplexere Zerfallsmodelle verwendet. Wir stellen fest , dass FLIM mit einer Reihe von durchgeführt werden kann im Zeitbereich oder Frequenzbereich Techniken und automatisierte FLIM HCA von Multi - Well - Platte - Arrays wurde zum ersten Mal in einem (nicht Schnitte) Weitfeldmikroskop Frequenzbereich Lebensdauer Ablesungen von FRET 51 umgesetzt. Die erste automatische optische Schnitte FLIM Multi - Well - Plattenleser für HCA Weitfeldzeit Gated Imaging - 28 verwendet wurde dann berichtet. Anschließend Weitfeld (nicht Sektionieren) Frequenzbereich FLIM HCA angewendet wurde für posttranslationale Modifikationen (Tyrosin - Phosphorylierung) in einer Genbank zu screenen FRET unter Verwendung von 52 und mit Zeitfenster FLIM HCA wurde angewendet , um FRET - Assays von HIV-1 Gag 53 Oligomerisierung und von SUMO von FOXM1 54 und von Raichu RhoA und Rac1 Biosensoren 33. Es ist auch möglich TCSPC für Multi - Well - Platte FLIM 26 aber bisher zu verwenden , hat es sich als herausfordernd t entsprechener Durchsatz von Techniken Weitfelderkennung nutzen. Ein Schwellen Ansatz, dieses Problem zu beheben könnte , ist die Verwendung von Arrays von Einzelphotonenzählung Detektoren wie SPAD - Arrays 55. Wir nehmen zur Kenntnis , dass alle Ablesungen von FRET Fluoreszenzproteine verwenden , sollten aus FLIMfit oder einer anderen FLIM - Analyse - Software erhalten , mit Vorsicht und dass die absoluten Werte der Parameter behandelt werden , wird sich auf die mit dem passenden Modell zugeordnet Annahmen abhängen. Zum Beispiel, in dem der FRET-Donor eine signifikante zweite Zerfallskomponente hat, die Verwendung eines biexponentiellen Modell die FRET FLIM Daten passen in den Beitrag der schnelleren Zerfall Komponente zur Folge haben, in der Regel mit der FRETing Bevölkerung erscheinen, verbunden sind höher als es sollte. Es ist daher wünschenswert Donatoren mit einer monoexponentiellen Lebensdauer wie mTq2FP zu verwenden. Schon damals haben neuere Studien gezeigt, dass FRET-Analyse noch durch dunkle Zustände der Akzeptor-Fluoreszenzproteine ​​beeinflusst werden kann oder durchHeterogenität der Orientierungsfaktor κ 2 aufgrund einer Verteilung von Fluorophor Konformationen mit einer Vielzahl von Chromophor Winkel und Abstände 56. Dennoch haben wir und andere gezeigt, dass die Fluoreszenzlebensdauer Ablesungen von FRET brauchbare Ergebnisse produzieren zu tun, die mit biochemischen Messungen korrelieren und kann verwendet werden für Protein-Interaktionen zu screenen oder Dynamik von Biosensoren zu folgen. Somit ist dieses openFLIM HCA Plattform kann auf eine Vielzahl von Fluoreszenzlebensdauer basierende Tests angewendet werden FRET oder zelluläre Autofluoreszenz unter Verwendung von 8, sowie die Bereitstellung quantitative Ablesungen von farbstoffbasierten Sonden 25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="549">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">microscope frame&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">IX81</td>
			<td style="width:101px;">&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">optical autofocus</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">ZDC</td>
			<td>&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">motorized (x-y-z) microscope stage</td>
			<td style="width:64px;">Marzhauser</td>
			<td style="width:64px;">00-24-565-0000</td>
			<td>Stage with Corvus controlle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">excitation laser source</td>
			<td style="width:64px;">Fianium</td>
			<td style="width:64px;">SC400-4</td>
			<td>Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:320px;">gated optical intensifier&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">High Rate Imager (HRI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">delay generators</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>See agile delay generator and precision delay generator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">camera</td>
			<td style="width:64px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:64px;">ORCA-ER-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Nipkow disc scanner unit&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:64px;">CSU-X1&#160;</td>
			<td>http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Top hat diffuser</td>
			<td style="width:64px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:64px;">ED1-S20-MD</td>
			<td>Engineered diffusers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5V&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3850</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq17V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3847</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq32V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3848</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5A</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3849</td>
			<td>mTurquoise Amber construct</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">HEK293T</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>cell type used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">phenol red-free HBSS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>55021C-1000ML</td>
			<td>imaging media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">culture media</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td>DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">DMEM</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">FBS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">xTremeGene9</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>6.37E+09</td>
			<td>for transfection, follow online protocol from La Roche</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">trypsin/EDTA Solution</td>
			<td style="width:64px;">Thermo Fischer</td>
			<td style="width:64px;">R001100</td>
			<td>for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

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Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Wir präsentieren eine Open-Source hohe Content-Analyse (HCA) Instrument unter Verwendung von automatisierten Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) zur Untersuchung von Protein-Interaktionen mit Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) basiert Ablesungen. Die Datenerfassung für dieses openFLIM-HCA Instrument wird von der Software in μManager geschrieben gesteuert und Datenanalyse wird in FLIMfit unternommen.

Open Source High Content Analyse Unter Verwendung Automatische Fluorescence Lifetime Imaging Mikroskopie

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Forschung

Biologie

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop und Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Schnelle Analyse und Exploration von Fluoreszenzmikroskopie Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem-Hochdruck-Schnell Einfrieren und Gefriersubstitution von Pflanzengeweben für die Transmissionselektronenmikroskopie

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Workflow für Hoch Inhalt, einzelne Zell Quantifizierung der Fluoreszenzmarker von Universal Mikroskop Daten, Unterstützung von Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking und Quantifizierung von Entwicklungsprozessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Verwendung von Open-Source-Werkzeuge

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Cellular Redox Profiling mit hochauflösender Mikroskopie

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open-Source-Einzelpartikelanalyse für Super Resolution Mikroskopie mit VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...