Name: open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy
Uploaded: 2017-01-18T14:00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.

1. הכנת מערך צלחת multiwell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסה של 75 מיקרומטר Coumarin 6 באתנול (τ ~ 2.43 NS) למדידות התייחסות לאפשר קביעת t 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 150,000 תאים Cos לארבע בארות צלחת 6 היטב ולאפשר לצרף לילה במדיום תרבות (ראה רשימת חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect אחד טוב כל אחד עם mTq5A, mTq5V, mTq17V ו mTq32V באמצעות מגיב transfection מסחרי בהתאם להוראות והתרבות של היצרן עבור 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק תאים באמצעות פתרון מסחרי טריפסין / EDTA על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים פיפטה 5,000 Cos המרחפים מאוזן של האנק מלח פתרון (HBSS) להביע mTq5A לתוך כל אחד בארות A1-G3 של צלחת multiwell 96 זכוכית בעל תחתית עובי 1.5 # אשר טופלו קודם לכן עם פולי- L- ליזין. חזור על הפעולה עבור mTq5V לבטא בתאי לתוך בארות A4-G6, mTq17V לתוך בארות A5-G9 ו mTq32V לתוך בארות A10-G12. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר גם H1 ריק (כדי לספק מדידה של כל רקע סטטי מצלחת multiwell). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 200 μL של HBSS רק לתוך H2 היטב (כדי לספק מדידה של כל אות רקע ממדיום תרבית התאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 5,000 תאים שאינם transfected ב HBSS לתוך H3 היטב (כדי לספק מדידה של כל אות הרקע מ autofluorescence הסלולר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 200 μL של פתרון צבע 75 מיקרומטר Coumarin לתוך היטב H4 (לספק המחאה על כל וריאציה של t 0 במהלך רכישת צלחת multiwell, למשל, עקב שינויים בטמפרטורת סביבה או לתנודות מעגלי ליזר או עיתוי. </li></ol> 2. קליטת נתונים openFLIM-HCA הערה: מידע מפורט ניתן למצוא בוויקי openFLIM-HCA 33. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל μManager ואת תוסף OpenFLIM-HCA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בקובץ הכיול עבור שילוב הספציפי של יחידת גנרטור עיכובשיעור החזרה לייזר תחת &quot;שליטה FLIM: קובץ כיול תיבת עיכוב: קבצים כיול&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את התיקייה שבה הנתונים יישמרו תחת &quot;קובץ: תיקיות בסיס גדר&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את נתיב קרן עירור על מנת להבטיח כי צימוד לתוך הסיב האופטי משלוח יציב וכי יעילות צימוד מוגדל על ידי מדידת הכוח המועבר באמצעות סיבים משלוח באמצעות מד כוח. תנודות נמוכות מ -5% כשרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק כי הממשלה ישראל מפעילה הנה יציבה מוצג אות פלט מסך ממחשב הממשלה ישראל על אוסילוסקופ מופעלת על ידי אות הדק קלט ממשלת ישראל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את ההדמיה של זרחן ממשלת ישראל על חיישן CCD על ידי כיסוי photocathode של הממשלה ישראל, קביעת הרווח שלה ל -750 V והתמקדות אחת עדשות הממסר כך תמונות של אירועי פוטון יחידים דלילים (בשל אור הרקע הדולף למרות עטיפת ממשלת ישראל ) רשם על CCD חד ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק כי המדגםשדה הראייה הוא מואר באופן אחיד על ידי הדמית מדגם ניאון אחיד, כגון ירידה של הפתרון לצבוע הפניה על coverslip, באמצעות כוח עירור נמוך מספיק (&lt;1 μW) על מנת להבטיח כי הממשלה ישראל לא רוויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את קובץ הגדרת הצלחת המתאים, כלומר, בחר באפשרות עבור 96-גם צלחות ( &quot;קובץ: תכונות פלייט טען&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות GUI μManager, להבטיח שאין קוביית קרן splitter dichroic בפריים מיקרוסקופ על ידי בחירת עמדה ריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באופן ידני רוחב השער של 4 ns על ממשלת ישראל לצורך הניסוי כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכש את נתוני תמונת IRF: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות GUI μManager, להבטיח כי אין מטרת מיקרוסקופ בנתיב הקרן על ידי בחירת עמדה ריקה. באופן ידני למקם בלוק קרן אנודייז שחור מעל הצריח האובייקטיבי כדי למנוע בריחת ליזר אור וזווית אותו כדי למזער את השתקפות חזרה לתוך מסגרת מיקרוסקופ. </li> &lt;li&gt; שימוש GUI μManager, להגדיר את המסננים CSUX (עירור, Dichroic, פליטה) כך את החלק היחסי של אור עירור מפוזרים מן גלגל ניפקו ספינינג ניתן הדמיה אך להבטיח את עוצמת אינה מספיקה כדי להרוות את המערכת עבור 200 ms CCD זמן אינטגרציה. זאת על מנת למנוע חשיפה של photocathode ממשלת ישראל כדי יותר מדי אור, אשר עלולים להזיק photocathode. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בפונקציה מצא MaxPoint על מלוא הטווח של העיכובים המכוסים על ידי תיבת העיכוב לתכנות המהירה. בדוק בתרשים הפלט מוצג ולאחר מכן להתאים את תיבת עיכוב כמובן ידנית על ידי לחיצה על כפתור קדימה כך שהפרופיל IRF מלא נמצא בטווח הסריקה של תיבת עיכוב מהר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את פרמטרי הרכישה (צפיפות ניטראלית, זמן חשיפה, הצטברות מסגרת) כך CCD אינו רווי בזמן-שער מבריקי זמן שילוב היעיל הוא&gt; 200 ms. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעדי עיכוב סט 25 ps על העיכוב המלא צלצלדואר ( &quot;שליטת FLIM: תיבת עיכוב מהירה: אכלס עיכובים&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סריקתתמונה IRF ידי לחיצה על &quot;תמונה הצמד FLIM&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכש תמונת רקע על ידי חסימת הליזר ( &quot;שליטת נתיב אור: צפיפות ניטראלית: חסום&quot;), צמצום מספר העיכובים ( &quot;שליטת FLIM: תיבת עיכוב מהירה: הגדרת עיכוב נוכחית (PS)&quot;), לעזוב את כל תכונות האחרות ללא שינוי עיתונות &quot;תמונת FLIM Snap&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכש את הנתונים לצבוע אסמכתא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר היטב H4 באמצעות GUI μManager ( &quot;שליטה XYZ: עבור אל היטב: H4&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות GUI μManager, מסננים בחר (עירור 434/17 ננומטר, Dichroic, פליטה 482/25 ננומטר) הדמיה mTqFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בפונקציה מצא MaxPoint על מלוא הטווח של תיבת העיכוב מהר ולאחר מכן להתאים את תיבת העיכוב הגסה ולכן פרופיל הריקבון המלא נמצא בטווח העיכוב של תיבת העיכוב מהר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכוון את זמן ההשהיהעד כדי בעוצמה מקסימלית על ידי שינוי &quot;שליטה FLIM: תיבת עיכוב מהיר: הגדרת עיכוב נוכחי (PS)&quot;. כוון את פרמטרי הרכישה (צפיפות ניטראלית, זמן חשיפה) כך CCD אינו רווי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעדי עיכוב סט 25 ps פני טווח עיכוב המלא ( &quot;שליטת FLIM: תיבת עיכוב מהירה: אכלס עיכובים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכש את הנתונים לצבוע התייחסות ידי לחיצה על &quot;תמונת הצמד FLIM&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונת מצלמת CCD שני רקע ידי חסימת ליזר העירור (ראה 2.11.7) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכש את נתוני FLIM של מדגם צלחת multiwell באמצעות תוכנת רכישת μManager: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סט אשר בארות צריכות להיות צלמו ומספר FOV להירכש לכל טוב ( &quot;רכישת רצף HCA התקנה: עמדות XYZ&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידני לבחור FOV מופת המכיל המדגם להיות צלם. השתמש FOV זה כדי לקבוע את מסנן צפיפות ניטרלי אופטימלי, רוחב השער על ממשלת ישראל ועלאינטגרציה הזמן של המצלמה כדי להגיע 75% של הטווח הדינמי של מצלמת CCD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס אוטומטי גדר ( &quot;שליטת XYZ: מיקוד אוטומטי&quot;): לחץ על &quot;מוקד שליטה השבות בלבד&quot;, ולאחר מכן להתמקד באופן ידני על התאים או המבנה של עניין. גדר &quot;טווח חיפוש מיקוד אוטומטי&quot; עד 2000 מיקרומטר ולחץ &quot;Enter&quot;. לחץ &quot;AF עכשיו&quot; ליזום הליך אוטומטי. ערך הסטה יופיע בשדה &quot;FocusOffset (מיקוד אוטומטי)&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את הערך לקזז שהושג 2.13.3 לתוך &quot;AF לקזז&quot; לחזור על תהליך הפוקוס האוטומטי פעמים ( &quot;AF עכשיו&quot;) כדי לבדוק שהערך לקזז עכשיו אפס, המציין לתפקוד תקין של מערכת הפוקוס האוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפונקצית &quot;AutoGate&quot; בתוכנת רכישת OpenFLIM-HCA לבחור דגימת לוגריתמים של נקודות הדיחוי. לחלופין, ניתן אלה ייבחרו באופן ידני, ראה להפנותence 36 לקבלת פרטים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדר &quot;צבור מסגרות&quot; לערך תשואות רצויות זמן רכישת נתונים כולל. הגדלת מספר המסגרות שנצברה מגבירה יחס אות לרעש של נתוני FLIM על החשבון גם זמן רכישת נתוני FLIM הכולל גובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את רכישת FLIM של הצלחת multiwell ידי לחיצה על &quot;רצף HCA התחל&quot; כפתור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונת מצלמת CCD רקע נוספת על ידי חסימת עירור הליזר (ראה 2.11.7) עם הגדרות רכישה זהות כפי שמוצג לרכישת נתוני FLIM. </li></ol> 3. ניתוח נתונים openFLIM-HCA שימוש FLIMfit <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק קבצים נלווים הדרושים לניתוח נתונים FLIM נוכחים (כלומר, IRF ומדידה לצבוע הפניה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טענו את הנתונים מן הבאר הריקה (H1), מדיום התרבות המכיל גם (H2) לבין התאים ללא תווית המכילים גם במדיום התרבות (H3) לתוך FLIMfit( &quot;קובץ: נתוני FLIM טען&quot;) כדי לבדוק אם ישנן תרומות רקע גדול מ -1% של האות מ תאי מבטאים &quot;תורם בלבד&quot;, כלומר, בבארות A1-G3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן קובץ רקע משתנה בזמן (TVB) על ידי טעינת מדיום תרבות עם היטב לתוך FLIMfit ( &quot;קובץ: נתוני FLIM טען&quot;). טען את נתוני רקע המצלמה רכשו בסעיף 2.14 ( &quot;רקע: רקע טען&quot;) ולהשתמש &quot;כלים: צור מפת צפיפות TVB&quot; אפשרות FLIMfit כדי ליצור את TVB. ראה התייחסות 31 לקבלת פרטים נוספים על TVB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מפת Shift מרחבית משתנית IRF ידי טעינת נתוני IRF רכשו בסעיף 2.11 ולחסר ברקע מצלמת CCD רכש בסעיף 2.11.7. השתמש באפשרות FLIMfit &quot;כלים: צור IRF Shift מפה&quot; כדי לחשב את מרחבית משתנה IRF Shift מפה. ראה התייחסות [31] לפרטים נוספים על מפת Shift IRF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים monoexponential ריקבון לנתונים לצבוע התייחסות רכשו בסעיף 2.12. לצבוע הפניה טען ומפת משתנים IRF מרחבית מחושב בסעיף 3.4, פרמטרים לנכון להגדיר ( &quot;לכל החיים: מס &#39;Exp: 1&quot;) עם t 0 סט כפרמטר מצויד ( &quot;לכל החיים: Shift IRF FIT: מצויד&quot;). שווי t 0 השיגו מדווח אז בטבלה מוצגת בלשונית &quot;הפרמטרים&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את נתוני FLIM ידי טעינת נתוני FLIM ניסיוני רכשו בסעיף 2.13, מפת מרחבית משתנית IRF מחושבת בסעיף 3.4, ברקע המצלמה רכש בסעיף 2.14, קובץ TVB מוכן בסעיף 3.3 ולהקליד את הערך השלילי של t 0 מתקבל בסעיף 3.5 ( &quot;IRF: משמרת IRF: t 0&quot;). ואז להתאים את נתוני הניסוי למודל ריקבון הרצוי באמצעות FLIMfit 36 בהתאם לדרישות של הניסוי. </li></ol>

The authors have nothing to disclose. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

תיארנו מיקרוסקופ צלחת multiwell אוטומטי המיועד HCA באמצעות FLIM מגודרת אמת. מכשיר זה נשלט באמצעות תוכנת קוד פתוח שנכתב μManager עם אפשרות של שמירת הנתונים לשרת OMERO ועל ניתוח נתונים FLIM המתבצע באמצעות 36 FLIMfit, תוכנת קוד פתוח שנכתב ב- Matlab וזמין כלקוח OMERO 32 המכשיר μManager תוכנות שליטה, openFLIM-HCA, זמינה 33 מקוונים עם רשימה של רכיבי מערכת 48 כדי לאפשר לחוקרים אקדמיים לבנות מכשירי HCA FLIM משלהם. על מנת להשיג נתוני FLIM חזקים, יש צורך לייעל את גדרות רכישת ממשלת ישראל ו CCD, ולהביא בחשבון של הבדלים כלשהם t 0. כמתואר 3.8.2, מצלמת הגדרת רווח ממשלת ישראל ו CCD זמן האינטגרציה צריך להיות מוגדר להגיע ~ 75% של הטווח הדינמי CCD. Uלשיר מתחי הצטברויות מסגרת CCD מרובות ממשלה ישראל גבוהים בכל עיכוב שער הזמן מגדיל את יחס האות לרעש 49 אבל זה מאריך את זמן רכישת FLIM הכולל (מאז פוטוני קרינה פחות נרכשים לכל מסגרת לפני מרווית מצלמת CCD ולכן מספר הצטברויות מסגרת צריך להיות מוגבר) וכך trade-off זה יש להכריע עבור כל ניסוי. הכיול של הגנרטור עיכוב תלוי שיעור החזרת ליזר וזה לכן, יש להבטיח כי קובץ הכיול הנכון עבור שיעור ההחזרה בשימוש הוא נטען לתוך תוכנת הרכישה. הליך כיול תיבת העיכוב ניתן למצוא בוויקי openFLIM-HCA 33. אם autofluorescence הסלולר הוא נמוך לעומת אות הקרינה, אנו משתמשים האות מ מדיום תרבות רק המכיל היטב כדי לספק את הרקע משתנה בזמן (TVB). כדי למזער קרינת רקע ממדיום תרבית תאים, נמנענומדיה המכילה פנול אדום. אם autofluorescence הסלולר הוא משמעותי, אז TVB עשויה להיגזר מדידות של תאים ללא תווית. עם זאת, בטיפול במקרה זה יש לנקוט, כמו זה מבוסס על ההנחה כי הרקע autofluorescence הוא זהה עבור כל פיקסל בתמונה. הנחה זו לא תהיה תקפה אם autofluorescence משתנה באופן משמעותי על פני תא או שקורה העירור או רגישות זיהוי אינו אחיד על פני שדה הראייה. רכישת תמונה IRF באמצעות פולסים אור עירור מפוזרים מספק את פרופיל IRF הזמני כי הוא ומפותל עם מודל הנתונים בתהליך הולם וגם מספק מפה של וריאציה המרחבית של IRF פני שדה הראייה. IRF, ניתן למדוד על ידי הדמית מדגם פיזור כגון השעית colloidal אם כי, המכשיר שלנו, באמצעות אור העירור המפוזר מן הגלגל נפק מספק מדידה נקיה של IRF. קביעה מדויקת של עיתוי of IRF, חשוב כי טעויות השהיית הזמן בין העירור והזמן-gating יכולות להשפיע בצורה משמעותית את התהליך ההולם, במיוחד כאשר הולם מורכבי מודלי דעיכה מעריכית. IRF, רכש באמצעות אור העירור מפוזר לא בדיוק מה שדרוש עבור התהליך ההולם כי היא רשמה על גל העירור ולא על גל פליטת קרינה, אשר יכול להשפיע על עיתויה, למרות הווריאציה המרחבית של IRF צריכה להיות זהה בשני אורכי הגל. בנוסף, IRF המפוזר עשויים להיות מוזז גלובלי יחסית בזמן אל IRF הנכון בשל מרחק אופטי שונה מאובייקט הפיזור, כפי שנהוג עבור IRF רכשה מן הגלגל נפק ב FLIM המחולק אופטי. תיקון זה, t 0, המהווה את המשמרת הזמנית העולמית הדרושה שאמורים להיות מיושמת על IRF אור העירור המפוזרת רכש, מחושב מנתוני monoexponential לצבוע התייחסות כמצוין Protocol צעד 4.4. הצבעים הבאים יכולים לשמש עבור אורכי גל עירור שונים: 75 מיקרומטר Coumarin 153 פתרון מתנול (τ ~ 4.3 ns 50) יכול לשמש עירור בטווח 295-442 ננומטר; פתרון מיקרומטר Coumarin 6 75 באתנול (τ ~ 2.43 ns 37) יכול לשמש עירור בטווח 430-500 ננומטר; ופתרון Rhodamine B 75 מיקרומטר במים (τ ~ 1.7 ns 37) יכול לשמש עירור ננו בטווח 488-575. נציין כי, למרות שזה אפשרי FLIMfit להשתמש IRF שונה עבור כל פיקסל של המערכת, בדרך כלל סביר להפוך את ההנחה כי משתנה IRF מרחבית יש אותו הפרופיל זמני עבור כל פיקסל בתמונה אבל מציג מגוון של משתנה קיזוז זמני מרחבית ביחס t 0 העולמי. אנו מתארים זה כמפת משמרת IRF, אשר נקבעה בהתאם IRF האור המפוזרת. יחד, פרופיל IRF, t 0 ומפת IRF המשמרת משמשים enפיקסל בטוח שכל ב FOV מצויד IRF המתאים. חשוב לציין, t 0 יכול להשתנות באיטיות לאורך זמן כך זה צריך להימדד לפני כל רכישת נתונים FLIM. המשתמש צריך להחליט כיצד לטעום את פרופילי ריקבון פלואורסצנטי נדרש להגדיר את הרוחב של שערים בזמן והעיכובים היחסיים לאחר עירור. באופן כללי, רצוי להשתמש רוחב שער רחב על מנת למקסם את האות זוהה ובדרך כלל אנו משתמשים רוחב שער מוגדר כ -4 ns עבור FLIM של תאים שכותרתו עם חלבוני קרינה. מספר עיכובי זמן שער צריך להיות מספיק כדי לטעום את פרופיל ריקבון הניאון (כולל שער אחד להגדיר למדוד את האות רק לפני דופק העירור) בהתחשב במורכבות של מודל ראוי כי תשמש בניתוח. הערך האופטימלי יכול לסמוך על הגלגולים ואמפליטודות יחסיים של מרכיבי הריקבון. באופן כללי, 4 שערים מספיקים monoexponential הולם דועך תוך 7 או יותר שערים רשאילשמש מודלי ריקבון מורכבים יותר. נציין כי FLIM יכול להיות מיושם באמצעות מגוון של טכניקות תחום תחום בזמן או תדירות HCA FLIM האוטומטית של מערכי צלחת multiwell יושמה לראשונה מזה readouts (לא חתך) רחב בתחום מיקרוסקופ באמצעות חיים במישור תדר של סריג 51. קורא צלחת multiwell FLIM חתך האופטי האוטומטי הראשון עבור HCA ניצול רחב בתחום הדמית זמן מגודר 28 נמסר אז. בהמשך, רחב בתחום HCA FLIM תחום תדר (לא חתך) יושמה למסך פוסט שינויי translational (זירחון טירוזין) על פני ספרייה גן באמצעות סריג 52 ו HCA FLIM מגודר זמן הוחל על סריג מבחנים של HIV-1 Gag oligomerization 53 ושל SUMOylation של FOXM1 54 ושל Raichu RhoA ו biosensors Rac1 33. כמו כן ניתן להשתמש TCSPC עבור FLIM צלחת multiwell 26 אבל עד כה הוא הוכיח מאתגר להתאים tהוא התפוקה של טכניקות ניצול גילוי רחב בתחום. גישה המתעוררים אחד שיכול לטפל בבעיה זו היא השימוש במערכים של גלאי ספירת פוטון יחידים כגון מערכי SPAD 55. נציין כי כל מונה המציין הסריג באמצעות חלבוני ניאון ומחייב זהירות כי הערכים המוחלטים של פרמטרים המתקבלים FLIMfit או כל תוכנה לניתוח FLIM אחרת יהיה תלויים בהנחות המשויך למודל ההולם. לדוגמא, שם תורם הסריג יש מרכיב ריקבון שני משמעותי, השימוש במודל biexponential כדי להתאים את נתוני FLIM הסריג יכול לגרום תרומה של רכיב הריקבון מהר, הקשורות בדרך כלל אוכלוסיית FRETing להופיע במיקום גבוהה יותר ממה שהוא צריך. לכן רצוי להשתמש תורמים עם חיים שלמים מונו מעריכים כגון mTq2FP. גם אז, מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי ניתוח סריג עדיין יכול להיות מושפע מדינות אפלות של חלבוני קרינת acceptor או על ידיההטרוגניות של גורם אורינטצית κ 2 עקב חלוקה של תצורות fluorophore עם מגוון רחב של זוויות כרומופור ומרחיקה 56. אף על פי כן, אנו ואחרים הראינו שקריאות חי קרינה של סריג לעשות להניב תוצאות שימושיות המתואמים עם מדידות ביוכימיות יכול לשמש מסך עבור אינטראקציות חלבון או לעקוב דינמיקה של חיישנים ביולוגיים. לפיכך פלטפורמת HCA openFLIM זה יכול להיות מיושמת על מגוון רחב של מבחני קרינה מבוסס חי ניצול סריג או הסלולר autofluorescence 8, כמו גם מתן readouts כמוני של בדיקות מבוססות צבען 25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="549">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">microscope frame&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">IX81</td>
			<td style="width:101px;">&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">optical autofocus</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">ZDC</td>
			<td>&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">motorized (x-y-z) microscope stage</td>
			<td style="width:64px;">Marzhauser</td>
			<td style="width:64px;">00-24-565-0000</td>
			<td>Stage with Corvus controlle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">excitation laser source</td>
			<td style="width:64px;">Fianium</td>
			<td style="width:64px;">SC400-4</td>
			<td>Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:320px;">gated optical intensifier&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">High Rate Imager (HRI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">delay generators</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>See agile delay generator and precision delay generator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">camera</td>
			<td style="width:64px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:64px;">ORCA-ER-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Nipkow disc scanner unit&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:64px;">CSU-X1&#160;</td>
			<td>http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Top hat diffuser</td>
			<td style="width:64px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:64px;">ED1-S20-MD</td>
			<td>Engineered diffusers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5V&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3850</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq17V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3847</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq32V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3848</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5A</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3849</td>
			<td>mTurquoise Amber construct</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">HEK293T</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>cell type used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">phenol red-free HBSS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>55021C-1000ML</td>
			<td>imaging media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">culture media</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td>DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">DMEM</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">FBS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">xTremeGene9</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>6.37E+09</td>
			<td>for transfection, follow online protocol from La Roche</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">trypsin/EDTA Solution</td>
			<td style="width:64px;">Thermo Fischer</td>
			<td style="width:64px;">R001100</td>
			<td>for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

Watch this Scientific Journal Video about Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

אנו מציגים ניתוח תוכן בקוד פתוח גבוה (HCA) מכשיר ניצול הדמית חי קרינה אוטומטי (FLIM) עבור assaying אינטראקציות חלבון באמצעות תהודת העברת אנרגית פורסטר (סריג) readouts המבוסס. רכישת נתונים עבור מכשיר openFLIM-HCA זו נשלטת על ידי תוכנות שנכתבו ב μManager וניתוח נתונים מבוצע FLIMfit.

ניתוח תוכן גבוה קוד פתוח ניצול מיקרוסקופי הדמית חי קרינה האוטומטית

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

ראפיד ניתוח וחקירה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

הקפאה בלחץ גבוהה טנדם ומהיר הקפאת חילוף של צמח רקמות למיקרוסקופים אלקטרונים חודרים

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

זרימת עבודה עבור גבוהה תוכן, כימות תא יחידה של פלורסנט סמנים מUniversal מיקרוסקופים נתונים, הנתמכים על ידי תוכנות קוד פתוחות

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב<em&gt; C. elegans</em&gt; שימוש בכלי קוד פתוח

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

התאוששות נייד באמצעות פרופילים תוכן גבוהה מיקרוסקופית

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...