Name: open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy
Uploaded: 2017-01-18T14:00:00
Duration: 9 min 30 s
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The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.

1. Preparazione dei pozzetti Piastra Array <ol><li> Preparare una soluzione di 75 mM cumarina 6 in etanolo (t ~ 2,43 ns) per misure di riferimento per consentire la determinazione di t 0. </li><li> Seed 150.000 cellule Cos in quattro pozzetti di una piastra ben 6 e permettono di collegare durante la notte in un terreno di coltura (vedi Lista dei materiali). </li><li> Trasfezione un bene ciascuno con mTq5A, mTq5V, mTq17V e mTq32V utilizzando un reagente di trasfezione commerciale in base alle istruzioni del produttore e la cultura per 24 h. </li><li> Staccare cellule utilizzando una soluzione di tripsina / EDTA commerciale secondo il protocollo del produttore. </li><li> cellule pipette 5.000 Cos sospesi in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) esprimenti mTq5A in ciascuno dei pozzetti A1-G3 di spessore 96 piastra multipozzetto # 1.5 fondo di vetro che è stato precedentemente trattato con poli-L-lisina. Ripetere l&#39;operazione per mTq5V cellule che esprimono in pozzi A4-G6, mTq17V in pozzi A5-G9 e mTq32V in pozzi A10-G12. </li&gt; <li> Lascia ben H1 vuoto (per fornire la misura di qualsiasi sfondo statico dal piatto pozzetti). </li><li> Pipettare 200 ml di HBSS solo in ben H2 (per fornire la misurazione di un segnale di fondo dal mezzo di coltura cellulare). </li><li> Pipetta 5.000 cellule non transfettate in HBSS in ben H3 (per fornire la misura di qualsiasi segnale di fondo da autofluorescenza cellulare). </li><li> Pipettare 200 ml di 75 mM soluzione colorante cumarina nella ben H4 (per fornire un controllo su qualsiasi variante di t 0 durante l&#39;acquisizione piastra di pozzetti, ad esempio, a causa di cambiamenti di temperatura ambiente o alle fluttuazioni dei circuiti di laser o di temporizzazione. </li></ol> 2. openFLIM-HCA acquisizione dati NOTA: Informazioni dettagliate sono trovate sul openFLIM-HCA wiki 33. <ol><li> Avviare μManager e il plugin OpenFLIM-HCA </li><li> Selezionare il file di calibrazione per la specifica combinazione di gruppo generatore di ritardo efrequenza di ripetizione del laser sotto &quot;controllo FLIM: Ritardo file di calibrazione scatola: Calibration Files&quot;. </li><li> Impostare la cartella in cui i dati verranno salvati in &quot;File: Set Cartella Base&quot;. </li><li> Controllare il percorso del fascio di eccitazione per garantire che l&#39;accoppiamento nella fibra ottica consegna è stabile e che l&#39;efficienza di accoppiamento è massimizzato potenza trasmessa attraverso la fibra consegna usando un misuratore di potenza misura. Fluttuazioni inferiori al 5% sono accettabili. </li><li> Controllare che il governo indiano scatenante è stabile, visualizzando il segnale di uscita del monitor dal GOI su un oscilloscopio innescata dal segnale di trigger di ingresso GOI. </li><li> Controllare l&#39;imaging del fosforo GOI sul sensore CCD coprendo il fotocatodo del GOI, impostando il suo guadagno a 750 V e messa a fuoco una delle lenti a relè in modo tale che le immagini di sparse singoli eventi di fotoni (a causa di luce di fondo che perde però il coperchio GOI ) registrato sul CCD sono nitide come possibile. </li><li> Controllare che il campionecampo di vista è uniformemente illuminata da imaging di un campione fluorescente uniforme, come una goccia della soluzione di colorante di riferimento su un vetrino, con una potenza di eccitazione sufficientemente bassa (&lt;1? W) per assicurare che il GOI non è saturo. </li><li> Selezionare il file di definizione piatto del caso, vale a dire, selezionare l&#39;opzione per piastre a 96 pozzetti ( &quot;file: le proprietà di carico su piastra&quot;). </li><li> Utilizzando l&#39;interfaccia grafica μManager, assicurarsi che non vi è alcuna dicroica cubo fascio splitter nella stativo selezionando una posizione vuota. </li><li> selezionare manualmente una larghezza di porta di 4 ns al governo indiano per l&#39;intero esperimento. </li><li> Acquisire IRF dati di immagine: <ol><li> Utilizzando l&#39;interfaccia grafica μManager, assicurarsi che non vi è alcun obiettivo microscopio nel percorso del fascio selezionando una posizione vuota. inserire manualmente un blocco trave anodizzato nero sopra la torretta obiettivo di impedire qualsiasi fuga di luce laser e l&#39;angolo di minimizzare qualsiasi riflessione di nuovo nel telaio microscopio. </li> &lt;li&gt; Utilizzo della GUI μManager, impostare i filtri in CSUX (eccitazione, dicroico, Emission) tale che la frazione di luce di eccitazione dispersa dal disco Nipkow filatura può essere ripreso, ma garantire l&#39;intensità non è sufficiente a saturare il sistema per un 200 ms CCD tempo di integrazione. Questo per evitare di esporre il fotocatodo governo indiano per troppa luce, che potrebbe danneggiare il fotocatodo. </li><li> Utilizzare la funzione Find MaxPoint su tutta la gamma dei ritardi coperti dalla casella ritardo veloce programmabile. Controllare lo schema di uscita visualizzato e quindi regolare la casella ritardo corso manuale premendo il pulsante avanti in modo che il profilo completo IRF sia all&#39;interno del campo di scansione della scatola ritardo veloce. </li><li> Regolare i parametri di acquisizione (densità neutra, tempo di esposizione, l&#39;accumulo di Frame) in modo che il CCD non è saturo in più brillanti tempo-gate e il tempo di integrazione efficace è&gt; 200 ms. </li><li> Impostare passi ritardo di 25 ps oltre la piena ritardo squillatoe ( &quot;Controllo FLIM: scatola di ritardo veloce: Popolare ritardi&quot;). </li><li> Acquisire immagine IRF premendo il tasto &quot;Snap immagine FLIM&quot;. </li><li> Acquisire un&#39;immagine di sfondo bloccando il laser ( &quot;controllo del percorso della luce: densità neutra: bloccato&quot;), riducendo il numero di ritardi ( &quot;controllo FLIM: scatola di ritardo veloce: impostazione del ritardo corrente (PS)&quot;), lasciare tutte le altre proprietà inalterato e premere il tasto &quot;Snap immagine FLIM&quot;. </li></ol></li><li> Acquisire dati tintura di riferimento: <ol><li> Selezionare ben H4 utilizzando il μManager GUI ( &quot;controllo XYZ: Vai bene: H4&quot;). </li><li> Utilizzando la μManager GUI, selezionare i filtri (eccitazione 434/17 nm, Dichroic, Emissione 482/25 nm) per l&#39;imaging mTqFP. </li><li> Utilizzare la funzione Find MaxPoint su tutta la gamma completa di scatola ritardo veloce e quindi regolare la scatola ritardo grossolano in modo che il profilo completo decadimento è all&#39;interno della gamma ritardo della scatola ritardo veloce. </li><li> Impostare il ritardofino al punto di massima intensità, cambiando il &quot;controllo FLIM: scatola di ritardo veloce: impostazione del ritardo corrente (PS)&quot;. Regolare i parametri di acquisizione (densità neutra, il tempo di esposizione) in modo che il CCD non è saturo. </li><li> Impostare passi ritardo di 25 ps oltre la gamma completa di ritardo ( &quot;controllo FLIM: scatola di ritardo veloce: Popolare ritardi). </li><li> Acquisire i dati di tintura di riferimento premendo il tasto &quot;Snap immagine FLIM&quot;. </li><li> Acquisire la seconda immagine di sfondo una camera CCD, bloccando il laser di eccitazione (vedi 2.11.7) </li></ol></li><li> Acquisire i dati FLIM del campione piastra di pozzetti utilizzando il software di acquisizione μManager: <ol><li> Set che pozzetti devono essere esposte e il numero di FOV da acquisire per bene ( &quot;Setup HCA acquisizione in sequenza: posizioni XYZ&quot;). </li><li> selezionare manualmente un FOV esemplare contenente il campione da acquisire. Utilizzare questa FOV per determinare il filtro a densità neutra ottimale, larghezza porta al GOI etempo di integrazione della telecamera in modo da raggiungere il 75% del range dinamico della telecamera CCD. </li><li> Impostare autofocus ( &quot;controllo XYZ: Autofocus&quot;): Premere &quot;solo controllo del fuoco di ritorno&quot;, e poi messa a fuoco manuale sulle cellule o strutture di interesse. Impostare &quot;intervallo di ricerca Autofocus&quot; a 2000 micron e premere &quot;Invio&quot;. Premere il tasto &quot;AF ora&quot; per iniziare una procedura di messa a fuoco automatica. Un valore di offset verrà visualizzato nel campo &quot;FocusOffset (Autofocus)&quot;. </li><li> Inserire il valore di offset ottenuto in 2.13.3 in &quot;Offset AF&quot; e ripetere la procedura di messa a fuoco automatica per due volte ( &quot;AF ora&quot;) per verificare che il valore di offset è ora pari a zero, che indica il corretto funzionamento del sistema di messa a fuoco automatica. </li><li> Utilizzare la funzione &quot;AutoGate&quot; nel software di acquisizione OpenFLIM-HCA di scegliere un campione logaritmica dei punti di ritardo. In alternativa, questi possono essere selezionati manualmente, vedere riferimentoENCE 36 per maggiori dettagli. </li><li> Impostare &quot;Accumulate Frames&quot; per un valore che i rendimenti desiderati tempo totale di acquisizione dei dati. Aumentando il numero di fotogrammi accumulati aumenta rapporto segnale-rumore dei dati FLIM a spese di anche aumentare il tempo totale di acquisizione dati FLIM. </li><li> Eseguire l&#39;acquisizione FLIM della piastra pozzetti premendo il pulsante &quot;Start sequenza HCA&quot;. </li></ol></li><li> Acquisire ulteriori immagini della telecamera uno sfondo CCD, bloccando il laser di eccitazione (vedi 2.11.7) con le impostazioni di acquisizione identici ed usati per l&#39;acquisizione dei dati FLIM. </li></ol> 3. Analisi dei dati openFLIM-HCA Utilizzando FLIMfit <ol><li> Controllare che i necessari file ausiliari per l&#39;analisi dei dati FLIM sono presenti (ad esempio, IRF e la misurazione della tintura di riferimento). </li><li> Caricare i dati dal pozzetto vuoto (H1), il mezzo pozzetto contenente coltura (H2) e la ben contenenti cellule non marcate in mezzo di coltura (H3) in FLIMfit( &quot;File: caricare i dati FLIM&quot;) per verificare se vi siano contributi di fondo più grande di 1% del segnale dalle cellule che esprimono &quot;donatore-only&quot;, vale a dire, in pozzetti A1-G3. </li><li> Preparare un file variabile nel tempo di fondo (TVB) caricando il medium bene con la cultura in FLIMfit ( &quot;File: caricare i dati FLIM&quot;). Caricare i dati della macchina fotografica di fondo acquisiti nella sezione 2.14 ( &quot;Background: Load Background&quot;) e utilizzare i &quot;Tools: Crea TVB intensità Mappa&quot; FLIMfit per generare la TVB. Vedi riferimento 31 per maggiori dettagli sulla TVB. </li><li> Preparare la spazialmente variabile IRF correzione di mappa caricando i dati acquisiti IRF nel paragrafo 2.11 e sottrarre il fondo telecamera CCD acquisito nella sezione 2.11.7. Utilizzare l&#39;opzione FLIMfit &quot;Strumenti: Creare IRF correzione di mappa&quot; per calcolare la variabile spazialmente IRF cambio mappa. Vedere di riferimento [31] per maggiori dettagli sulla IRF cambio mappa. </li><li> Montare un monoexponenziale decadimento ai dati colorante di riferimento acquisiti nella sezione 2.12. Colorante carico di riferimento e la spazialmente variabile mappa IRF calcolata nella sezione 3.4, impostare i parametri in forma ( &quot;Durata: No. Exp: 1&quot;) con t 0 set come parametro attrezzata ( &quot;Durata: FIT IRF Spostamento: Fornitura&quot;). Il valore di t 0 ottenuto viene poi riportato nella tabella mostrata nella scheda &quot;Parametri&quot;. </li><li> Analizzare i dati FLIM caricando i dati FLIM sperimentali acquisiti nel paragrafo 2.13, la spazialmente variabile IRF Mappa calcolato nella sezione 3.4, sullo sfondo macchina fotografica acquisita nel punto 2.14, il file TVB preparato in sezione 3.3 e digitare il valore negativo di t 0 ottenuto nella sezione 3.5 ( &quot;IRF: IRF spostamento: t 0&quot;). Poi inserire i dati sperimentali al modello di decadimento desiderato utilizzando FLIMfit 36 a seconda delle esigenze dell&#39;esperimento. </li></ol>

The authors have nothing to disclose. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Abbiamo descritto un microscopio piastra di pozzetti automatizzato progettato per HCA usando FLIM tempo-dipendenti. Questo strumento è controllato tramite il software open source scritto in μManager con la possibilità di salvare i dati su un server OMERO e l&#39;analisi dei dati FLIM essere effettuata utilizzando FLIMfit 36, un programma open source scritto in MATLAB e disponibile come client OMERO 32 Lo strumento μManager software di controllo, openFLIM-HCA, è disponibile on-line 33 con un elenco dei componenti del sistema 48 per consentire ai ricercatori accademici di costruire i propri strumenti FLIM HCA. Al fine di acquisire i dati FLIM robuste, è necessario ottimizzare le impostazioni di acquisizione GOI e CCD e di tener conto di eventuali variazioni in t 0. Come descritto in 3.8.2, il guadagno e la fotocamera CCD tempo di integrazione governo indiano deve essere impostato per raggiungere ~ 75% della gamma dinamica del CCD. Ucantare più elevate tensioni GOI e più accumuli telaio CCD ad ogni ritardo cancello volta aumenta il rapporto segnale-rumore 49, ma questo aumenta il tempo di acquisizione FLIM totale (da un minor numero di fotoni di fluorescenza vengono acquisiti per fotogramma prima che i saturi telecamera CCD e quindi il numero di accumuli telaio dovrebbe essere aumentato) e quindi questo trade-off dovrebbe essere deciso per ogni esperimento. La taratura del generatore ritardo dipende dalla frequenza di ripetizione del laser ed è quindi necessario garantire che il file di calibrazione corretto per la frequenza di ripetizione utilizzato viene caricato nel software di acquisizione. La procedura per calibrare la casella di ritardo può essere trovato sul openFLIM-HCA wiki 33. Se l&#39;autofluorescenza cellulare è bassa rispetto al segnale di fluorescenza, si usa il segnale da un supporto di cultura giusta pozzetto contenente fornire lo sfondo tempo-variante (TVB). Per minimizzare fluorescenza di fondo dal mezzo di coltura cellulare, evitiamosupporti contenenti rosso fenolo. Se l&#39;autofluorescenza cellulare è significativo, allora il TVB può essere derivato da misurazioni delle cellule non marcate. Tuttavia, in questo caso bisogna fare attenzione, come questo presuppone che lo sfondo autofluorescenza è la stessa per ogni pixel dell&#39;immagine. Questo presupposto non sarà valida se l&#39;autofluorescenza varia significativamente una cella o se il fascio di eccitazione o la sensibilità di rilevamento non è uniforme nel campo di vista. L&#39;acquisizione di un&#39;immagine IRF utilizzando impulsi di luce di eccitazione sparsi fornisce il profilo IRF temporale che è convoluta con il modello di dati nel processo di montaggio e fornisce anche una mappa della variazione spaziale della IRF attraverso il campo di vista. L&#39;IRF può essere misurata l&#39;imaging di un campione di dispersione quale una sospensione colloidale anche se, nel nostro strumento, usando luce di eccitazione dispersa dal disco Nipkow fornisce una misurazione più pulita del IRF. determinazione accurata della tempistica of la IRF è importante perché gli errori nel tempo di ritardo tra l&#39;eccitazione e il tempo-gating possono influire in modo significativo il processo di adattamento, in particolare quando il montaggio di modelli di decadimento esponenziale complessi. L&#39;IRF ha acquisito utilizzando la luce di eccitazione diffusa non è esattamente ciò che è necessario per il processo di adattamento, perché è registrato alla lunghezza d&#39;onda di eccitazione piuttosto che alla lunghezza d&#39;onda di emissione di fluorescenza, che può influenzare la sua tempistica, anche se la variazione spaziale della IRF dovrebbe essere la stessa ad entrambe le lunghezze d&#39;onda. Inoltre, l&#39;IRF disperso può essere spostata a livello globale in tempo relativo alla vera IRF causa di un cammino ottico divergente dall&#39;oggetto dispersione, come nel caso di un IRF acquisito dal disco Nipkow in FLIM otticamente sezionata. Tale correzione, t 0, che è lo spostamento temporale globale necessaria da applicare alla acquisito sparsi IRF luce di eccitazione, è calcolata dai dati colorante riferimento monoesponenziali come indicato in ProtoCpasso olo 4.4. I seguenti coloranti possono essere utilizzati per diverse lunghezze d&#39;onda di eccitazione: a 75 pM cumarina 153 soluzione in metanolo (τ ~ 4,3 ns 50) può essere usata per l&#39;eccitazione nell&#39;intervallo 295-442 nm; un 75 mM cumarina 6 soluzione in etanolo (t ~ 2,43 ns 37) possono essere utilizzati per l&#39;eccitazione nell&#39;intervallo 430-500 nm; e 75 mM soluzione rodamina B in acqua (τ ~ 1,7 ns 37) può essere usata per l&#39;eccitazione nell&#39;intervallo 488-575 nm. Notiamo che, sebbene sia possibile in FLIMfit utilizzare un diverso IRF per ciascun pixel del sistema, di solito è ragionevole fare l&#39;ipotesi che la spazialmente variabili IRF ha lo stesso profilo temporale per ogni pixel dell&#39;immagine, ma presenta una gamma di spazialmente variabile offset temporali relativi alla t globale 0. Descriviamo questo come la variazione di mappa IRF, che è determinata dalla IRF luce diffusa. Insieme, il profilo IRF, t 0 e la mappa spostamento IRF vengono usati per enAssicurarsi che ogni pixel nel FOV è dotata di un IRF appropriata. È importante sottolineare che, t 0 può variare lentamente nel tempo e quindi dovrebbe essere misurato prima di ogni acquisizione dati FLIM. L&#39;utente deve decidere come per assaggiare i profili di decadimento di fluorescenza ed è necessario per impostare la larghezza dei termini cancelli ed i loro relativi ritardi dopo l&#39;eccitazione. In generale, è auspicabile utilizzare ampie larghezze di gate per massimizzare il segnale rilevato e tipicamente usiamo larghezze di gate impostati a 4 ns per FLIM di cellule marcate con proteine ​​fluorescenza. Il numero di ritardi di tempo-gate dovrebbe essere sufficiente per campionare il profilo di decadimento fluorescente (compresa una porta impostato per misurare il segnale appena prima dell&#39;impulso di eccitazione) data la complessità del montaggio di modello che verrà utilizzato nell&#39;analisi. Il valore ottimale può dipendere dalle vite e ampiezze relative delle componenti di decadimento. In generale, 4 porte sono sufficienti per monoesponenziale montaggio decade mentre 7 o più porte puòessere utilizzato per più modelli di decadimento complessi. Notiamo che FLIM può essere implementato utilizzando una serie di tecniche nel dominio del tempo o nel dominio della frequenza e HCA FLIM automatizzata di matrici piastra pozzetti è stata implementata prima di una (non sezionamento) in tutto il campo ottico con letture a vita nel dominio della frequenza di FRET 51. La prima ottica sezionamento FLIM lettore di piastre pozzetti automatizzato per HCA l&#39;utilizzo in tutto il campo di tempo-dipendenti di imaging 28 è stato poi riportato. Successivamente, a grande campo (non sezionamento) nel dominio della frequenza FLIM HCA è stato applicato per lo screening per le modifiche post-traslazionali (tirosin-fosforilazione) attraverso una libreria gene utilizzando FRET 52 e il tempo-dipendenti FLIM HCA è stato applicato a preoccuparsi saggi di HIV-1 gag oligomerizzazione 53 e di SUMOylation di FoxM1 54 e di Raichu RhoA e Rac1 biosensori 33. E &#39;anche possibile utilizzare TCSPC per piastra di pozzetti FLIM 26, ma fino ad oggi si è dimostrato difficile da abbinare tegli throughput tecniche che sfruttano il rilevamento a grande campo. Un approccio emergente che potrebbe affrontare questo problema è l&#39;uso di matrici di rivelatori singoli conteggio di fotoni come array SPAD 55. Notiamo che eventuali letture di FRET utilizzando proteine fluorescenti devono essere trattati con cautela e che i valori assoluti dei parametri ottenuti da FLIMfit o qualsiasi altro software di analisi FLIM dipenderà dalle ipotesi associati al modello raccordo. Per esempio, dove il donatore FRET ha una significativa componente secondo decadimento, l&#39;uso di un modello biesponenziale per adattarsi ai dati FRET FLIM può comportare il contributo della componente più veloce decadimento, tipicamente associati con la popolazione FRETing appare superiore a quello che dovrebbe. E &#39;quindi desiderabile impiegare donatori con una vita mono-esponenziale, come mTq2FP. Anche allora, recenti studi hanno dimostrato che l&#39;analisi FRET può ancora essere influenzata da stati scure di proteine ​​accettore di fluorescenza o dieterogeneità del fattore orientamento κ 2 a causa di una distribuzione di conformazioni fluoroforo con una varietà di angoli cromofori e distanze 56. Tuttavia, noi e altri hanno dimostrato che le letture di fluorescenza a vita di FRET producono risultati utili che correlano con le misurazioni biochimiche e possono essere utilizzati per lo screening per le interazioni proteina o di seguire la dinamica di biosensori. Così questa piattaforma HCA openFLIM può essere applicata a una vasta gamma di test di durata a base di fluorescenza utilizzando FRET o autofluorescenza cellulare 8, oltre a fornire letture quantitativi di sonde a base di coloranti 25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="549">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">microscope frame&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">IX81</td>
			<td style="width:101px;">&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">optical autofocus</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">ZDC</td>
			<td>&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">motorized (x-y-z) microscope stage</td>
			<td style="width:64px;">Marzhauser</td>
			<td style="width:64px;">00-24-565-0000</td>
			<td>Stage with Corvus controlle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">excitation laser source</td>
			<td style="width:64px;">Fianium</td>
			<td style="width:64px;">SC400-4</td>
			<td>Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:320px;">gated optical intensifier&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">High Rate Imager (HRI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">delay generators</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>See agile delay generator and precision delay generator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">camera</td>
			<td style="width:64px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:64px;">ORCA-ER-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Nipkow disc scanner unit&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:64px;">CSU-X1&#160;</td>
			<td>http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Top hat diffuser</td>
			<td style="width:64px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:64px;">ED1-S20-MD</td>
			<td>Engineered diffusers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5V&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3850</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq17V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3847</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq32V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3848</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5A</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3849</td>
			<td>mTurquoise Amber construct</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">HEK293T</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>cell type used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">phenol red-free HBSS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>55021C-1000ML</td>
			<td>imaging media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">culture media</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td>DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">DMEM</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">FBS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">xTremeGene9</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>6.37E+09</td>
			<td>for transfection, follow online protocol from La Roche</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">trypsin/EDTA Solution</td>
			<td style="width:64px;">Thermo Fischer</td>
			<td style="width:64px;">R001100</td>
			<td>for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

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Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Vi presentiamo un alto contenuto strumento open source di analisi (HCA) che utilizza l&#39;imaging di fluorescenza vita automatizzato (FLIM) per saggiare le interazioni delle proteine ​​che utilizzano Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) letture basate. L&#39;acquisizione dei dati per questo strumento openFLIM-HCA è controllato da un software scritto in μManager e l&#39;analisi dei dati viene effettuata in FLIMfit.

Open Source alto contenuto di analisi Utilizzando Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Ricerca

Biologia

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