Name: open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy
Uploaded: 2017-01-18T14:00:00
Duration: 9 min 30 s
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The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.

マルチウェルプレートアレイの作製<ol><li> トン0の決意を有効にするには、基準測定のために、エタノール中の75μMクマリン6（τ〜2.43ナノ秒）の溶液を調製します。 </li><li> 6ウェルプレートの4ウェルにシード15万Cos細胞および培養培地中で一晩付着することを可能にする（材料リストを参照してください）。 </li><li> mTq5A、mTq5V、mTq17VとmTq32Vは24時間、メーカーの指示や文化に応じて商用トランスフェクション試薬を用いて各ウェル1をトランスフェクト。 </li><li>製造業者のプロトコールに従って商業トリプシン/ EDTA溶液を用いて細胞を切り離し。 </li><li>ピペットハンクス平衡塩溶液（HBSS）中に懸濁させ5,000 Cos細胞は、以前に、ポリ-L-リジンで処理された＃1.5厚ガラス底96マルチウェルプレートのウェルA1-G3のそれぞれにmTq5Aを表します。 mTq5VをウェルA10-G12に井戸A5-G9とmTq32Vに井戸A4-G6、mTq17Vに細胞を発現させるために繰り返します。 </li&gt; <li>空H1（マルチウェルプレートから任意の静的なバックグラウンドの測定を提供するために）十分にしておきます。 </li><li> HBSSのピペット200μLだけよくH2に（細胞培養培地からのバックグラウンドシグナルの測定を提供します）。 </li><li>ウェルH3にピペットHBSSで5,000非トランスフェクト細胞（細胞の自己蛍光からのバックグラウンドシグナルの測定を提供します）。 </li><li>ピペットよくH4（へ75μMのクマリン色素溶液の200μLによる周囲温度の変化や、レーザーやタイミング回路の変動に、 例えば 、マルチウェルプレートの取得中トン 0の任意のバリエーションのチェックを提供します。 </li></ol> 2. openFLIM-HCAデータ集録注：詳細な情報はopenFLIM-HCAのwiki 33で検出されたことができます。 <ol><li> マイクロマネージャーとOpenFLIM-HCAのプラグインを起動します。 </li><li>遅延発生器ユニットの特定の組み合わせのための較正ファイルを選択して下のレーザー繰り返し率」FLIM制御：ディレイボックスのキャリブレーションファイル：キャリブレーションファイル」を参照してください。 </li><li> &quot;：セットベースフォルダファイル」データが下に保存するフォルダを設定します。 </li><li>配信光ファイバに結合することは安定しており、カップリング効率は、電力計を用いて送出ファイバを介して伝達される動力を測定することによって最大化されることを確実にするために、励起ビーム光路を確認します。 5％よりも低い変動が許容されます。 </li><li> GOIトリガーがGOI入力トリガ信号によってトリガオシロスコープ上GOIからモニタ出力信号を表示することにより、安定していることを確認してください。 </li><li> 750 Vにその利得を設定し、リレーレンズのいずれかを中心に、そのようなことはGOIの光電面を覆うことにより、CCDセンサへのGOI蛍光体のイメージングをチェックGOIカバーものの漏れるによる背景光に疎単一光子イベントの画像（ ）CCDに記録され、可能な限りシャープです。 </li><li>サンプルことを確認してください視野を均一GOIが飽和しないことを確実にするために十分に低い励起パワー（&lt;1μW）を用いて、このようなカバースリップ上で参照色素溶液の液滴として均一な蛍光試料を撮像して照射されます。 </li><li>適切なプレート定義ファイルを選択し、 すなわち、96ウェルプレートのための選択オプション（「 ファイル：ロード・プレートのプロパティ」）。 </li><li> マイクロマネージャー GUIを使用して、空の位置を選択することにより、顕微鏡のフレームには、ダイクロイックビームスプリッタキューブが存在しないことを確認してください。 </li><li>手動で全体の実験のためのGOIで4ナノ秒のゲート幅を選択します。 </li><li> IRFの画像データを取得： <ol><li> マイクロマネージャー GUIを使用して、空の位置を選択することにより、ビーム経路には顕微鏡の対物レンズがないことを確認してください。手動でそれが戻っ顕微鏡フレームに任意の反射を最小限に抑えるために、任意のレーザー光のエスケープと角度を防止するために、対物レンズタレット上記アルマイトブラックビームブロックを配置します。 </li> &lt;李&gt;はマイクロマネージャーのGUIを使用して、スピニングニポウディスクから散乱励起光の一部を撮像するが、強度が200のためのシステムを飽和させるのに十分でないことを確認することができるように、CSUX（ 励起、ダイクロイック、エミッション ）でフィルタを設定しますミリ秒のCCD積分時間。これは、光電面に損傷を与える可能性があまりにも多くの光にGOI光電面を露出させないようにすることです。 </li><li>プログラム可能な高速の遅延ボックスで覆われた遅延の全範囲にわたって検索maxpoint機能を使用してください。表示される出力図をチェックした後、完全IRFプロファイルが速い遅延ボックスのスキャン範囲内になるように前方にボタンを押すことで手動コース遅延ボックスを調整します。 </li><li>取得パラメータ（ ニュートラル密度、露出時間、フレーム蓄積 ）ので、CCDは明るい時間ゲートに飽和していないと効果的な積分時間が&gt; 200 msですを調整します。 </li><li>フル遅延を超える25ピコ秒の設定遅延ステップが鳴りました電子（「FLIMコントロール：高速遅延ボックス：遅延を移入」）。 </li><li> 「 スナップFLIMイメージ」を押すことにより、IRF画像を取得。 </li><li> 、変更されていない他のすべてのプロパティを残し、遅延（「 現在の遅延設定（PS）：高速遅延ボックスFLIMコントロール」）の数を減らす、（「 ブロック：：ニュートラル密度光路制御」）、レーザーを遮断することによって、背景画像を取得押して&quot; スナップFLIMイメージ」。 </li></ol></li><li>参照色素データを取得します： <ol><li> マイクロマネージャー GUIを（ &quot;：ウェルに行く：H4をXYZ制御」）を使用してもH4を選択します。 </li><li> mTqFPを撮像するためのマイクロマネージャーのGUIで、[フィルタ（励起17分の434 nmで、二色性、エミッション25分の482のnm）を使用。 </li><li>高速遅延ボックスの全範囲にわたって検索maxpoint機能を使用し、完全な減衰プロファイルが速い遅延ボックスの遅延範囲内にあるように、粗遅延ボックスを調整します。 </li><li>遅延時間を設定&quot;：高速遅延ボックス：現在の遅延設定（PS）FLIM制御」を変更することにより、最大強度のポイントに。 CCDが飽和しないように、取得パラメータ（ ニュートラル密度、露出時間）を調整します。 </li><li>フル遅延範囲にわたって25ピコ秒の設定遅延ステップ（「FLIMコントロール：高速遅延ボックス：遅延を移入 ）。 </li><li> 「 スナップFLIMイメージ」を押すことにより、参照色素データを取得します。 </li><li>励起レーザを遮断することによって第2の背景のCCDカメラ画像を取得する（2.11.7を参照） </li></ol></li><li> マイクロマネージャー収集ソフトウェアを使用してマルチウェルプレートサンプルのFLIMデータを取得します： <ol><li>ウェルが画像化されるべきであり、FOVの数はウェルあたりに取得されるように設定し（「セットアップHCAに配列決定取得：XYZ位置」）。 </li><li>手動で画像化されるべきサンプルを含む模範FOVを選択します。最適な減光フィルタ、GOIのゲート幅を決定するために、このFOVを使用し、CCDカメラのダイナミックレンジの75％に達するように、カメラの積分時間。 </li><li>設定オートフォーカス（「XYZ制御：オートフォーカス」）：プレス「 戻るフォーカス制御のみ」は 、その後、手動で目的の細胞または構造に焦点を当てます。 2000ミクロンと&quot;Enter&quot;キーを押しますと、「 オートフォーカスサーチ範囲」に設定します。オートフォーカス手順を開始するを押して、「 今AF」。オフセット値は、フィールド「FocusOffset（オートフォーカス）」に表示されます。 </li><li>オートフォーカスシステムの正しい機能を示す、「AFオフセット」に2.13.3で得られたオフセット値を入力し、オフセット値が現在ゼロであることを確認する（「AF今」）を2回オートフォーカス手順を繰り返します。 </li><li>遅延ポイントの対数サンプリングを選択するOpenFLIM-HCA収集ソフトウェアに「AutoGate」機能を使用してください。あるいは、これらを手動で選択することができ、参照する参照詳細については、36をレンス。 </li><li>収量は、総データ取得時間を希望する値に「 累積フレーム」に設定します。蓄積されたフレームの数を増加させることも増加合計FLIMデータ取得時間を犠牲にFLIMデータの信号対雑音比を増加させます。 </li><li> 「HCAのシーケンスを開始する」ボタンを押して、マルチウェルプレートのFLIMの取得を実行します。 </li></ol></li><li> FLIMデータ取得のために使用されるような同一の取得設定で（2.11.7を参照）励起レーザを遮断することによって、さらに背景CCDカメラ画像を取得します。 </li></ol> 3. openFLIM-HCAデータ分析FLIMfitを使用しました <ol><li> FLIMデータ分析のために、その必要な補助的なファイルが存在するチェック（ すなわち 、IRFと参照色素測定）。 </li><li>空のウェル（H1）からデータをロードし、よく含む培養液（H2）と培養液中でよく含む非標識細胞（H3）FLIMfitへ（「 ファイル：FLIMデータのロード 」）をウェルA1-G3で、すなわち 、「ドナーのみ」を発現する細胞からの信号の1％よりも大きい任意のバックグラウンドの寄与があるかどうかをチェックします。 </li><li> FLIMfit（ &quot;：FLIMデータを読み込みファイル」）に培養液で十分にロードすることによって、時間的に変化する背景（TVB）ファイルを準備します。セクション2.14で取得したカメラの背景データ読み込み（ &quot;背景：ロード・背景」）とFLIMfitオプション &quot; ツール：TVB強度マップの作成 」 を使用TVBを生成します。 TVBについて詳しくは、31を参照して参照してください。 </li><li> 2.11節で取得したIRFデータをロードすることにより、空間的に変化するIRFシフトマップを準備し、セクション2.11.7で取得したCCDカメラのバックグラウンドを差し引きます。 FLIMfitオプション &quot; ツール：IRFは、地図をシフト作成 」を使用し、空間的に変化するIRFシフトマップを計算します。 IRFの変速マップについての詳細は参考文献[31]を参照してください。 </li><li> monoexponenを取り付け2.12節で取得した参照色素データへのシャル崩壊。負荷基準色素およびセクション3.4で計算された空間的に変化するIRFマップ、設定フィットパラメータ（「生涯：第経験：1 &quot;）フィットパラメータとしてトンで0セット（「寿命：FIT IRFシフト：フィット」）。得られたT 0の値は、「 パラメータ 」タブに示される表に報告されています。 </li><li>セクション3.4で計算された空間的に変化するIRF地図、セクション2.14で取得したカメラの背景、得られたT 0の負の値に3.3節と型で製造さTVBファイル、セクション2.13で取得した実験FLIMデータをロードすることにより、FLIMデータを分析セクション3.5で（「IRF：IRFシフト：トン0 &quot;）。その後、実験の要件に応じてFLIMfit 36を用いて所望の減衰モデルに実験データをフィット。 </li></ol>

The authors have nothing to disclose. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

我々は、時間ゲートFLIMを用いてHCAために設計された自動化されたマルチウェルプレート、顕微鏡を記載しています。この機器はOMEROサーバーにデータを保存するオプションとFLIMfit 36、MATLABで書かれたオープンソースのプログラムを使用して行われてFLIMデータ分析とマイクロマネージャーで書かれたオープンソースのソフトウェアを使用して制御し、OMEROクライアントとして利用可能な32 マイクロマネージャー楽器れます制御ソフトウェア、openFLIM-HCAは 、自分のFLIMのHCAの楽器を構築するために学術研究者を有効にするには、システムコンポーネント48のリストと33オンラインで入手できます。 ロバストFLIMデータを取得するためには、GOIとCCD取得設定を最適化し、T 0における任意の変化を考慮する必要があります。 3.8.2で説明したように、GOIゲイン設定とCCDカメラの積分時間〜CCDのダイナミックレンジの75％に達するように設定されるべきです。 U各時点でゲート遅延が対雑音比49に信号を増加させるが、これは、より少ない蛍光光子をCCDカメラが飽和する前に、フレームごとに取得しているため、合計FLIM取得時間（とようにフレームの蓄積の数を増加させ、より高いGOI電圧および複数のCCDフレームの蓄積を歌います増加させるべきである）ので、このトレードオフは、各実験のために決定されるべきです。遅延発生器の較正は、レーザ繰り返し率に依存し、使用される繰り返し率の正しい較正ファイルを取得ソフトウェアにロードされていることを確認する必要があります。遅延ボックスを較正するための手順はopenFLIM-HCAのwiki 33で見つけることができます。 細胞の自己蛍光は、蛍光シグナルと比較して低い場合、我々は、時間的に変化するバックグラウンド（TVB）を提供するために十分に含むだけ培地からの信号を使用します。細胞培養培地からのバックグラウンド蛍光を最小化するために、我々は避けますフェノールレッドを含む培地。細胞の自己蛍光が有意である場合、TVBは、非標識細胞の測定から導出することができます。これは自家蛍光の背景が画像内の画素ごとに同じであることを前提としていたようしかし、この場合には注意が払わなければなりません。自家蛍光が細胞間または励起ビームまたは検出感度が視野にわたって均一でない場合、大幅に変化した場合、この仮定は有効になりません。 散乱励起光パルスを用いIRF画像の取得は、フィッティングプロセスでのデータモデルで畳み込まれている一時的なIRFのプロファイルを提供し、また、視野全体でIRFの空間的変化のマップを提供します。 IRFは、ニポウディスクはIRFのクリーンな測定を提供するから散乱励起光を使用して、我々の機器では、このようなコロイド懸濁液もののとして散乱試料を撮像して測定することができます。タイミングOの正確な決意複雑な指数関数的減衰モデルに当てはめる場合は特に励起と時間ゲートとの間の時間遅延の誤差が大きく、フィッティングプロセスに影響を与える可能性があるため、IRF fが重要です。 IRFは、IRFの空間的変動は、同じであるべきであるが、そのタイミングに影響を与えることができ、それは励起波長ではなく、蛍光発光波長で記録されるので、嵌合プロセスのために必要とされないまさに散乱励起光を用いて取得しました両方の波長で。光学切片化FLIMでニポウディスクから取得したIRFの場合のように加えて、散乱IRFはグローバルに起因散乱物体からの異なる光路長に真IRFに時間的にシフトされてもよいです。 Protocに示すように取得された散乱励起光IRFに適用されるべき必要なグローバル時間的なシフトでこの補正、T 0は 、次指数参照色素データから計算されますオールステップ4.4。下記の染料は、異なる励起波長のために使用することができます：メタノール中の75μMのクマリン153溶液（τ〜4.3ナノ秒50）は範囲295から442 nmの励起のために使用することができます。エタノール中75μMのクマリン6溶液（τ〜2.43ナノ秒37）範囲430から500 nmの励起のために使用することができます。水に75μMローダミンB溶液（τ〜1.7ナノ秒37）範囲488から575 nmの励起のために使用することができます。我々は、システムの各画素に対して異なるIRFを使用するFLIMfitに可能であるが、通常、空間的に変化するIRFは、画像内の画素毎に同じ時間プロファイルを有するが、範囲を示すという仮定を行うことが妥当であることに注意します空間的にグローバルトン0からの相対時間的オフセットを変化させます。私たちは、散乱光のIRFから決定されたIRFの変速マップ、としてこれを記述します。一緒に、IRFプロファイル、 時刻t 0およびIRFシフトマップには専用に使用されていますFOV内の各ピクセルは、適切なIRFが装着されていることを確認してください。それは任意のFLIMデータ収集前に測定されるべきであるので、重要なことに、T 0は、時間の経過とともに徐々に変化することができます。 ユーザーは、蛍光減衰プロファイルをサンプリングする方法を決定する必要があり、励起後の時間ゲートおよびそれらの相対的な遅延の幅を設定する必要があります。一般的には、検出信号を最大にするために、広いゲート幅を使用し、典型的には、我々は、蛍光タンパク質で標識された細胞のFLIM 4ナノ秒に設定し、ゲート幅を使用することが望ましいです。時間ゲート遅延の数は、分析に使用されるフィッティングモデルの複雑さ所与の（単に励起パルス前の信号を測定するように設定つのゲートを含む）蛍光減衰プロファイルをサンプリングするのに十分であるべきです。最適値は、寿命及び減衰成分の相対振幅に依存することができます。一般的には、4ゲートは、フィッティング単一指数のために十分である7以上のゲートがかもしれないが減衰しますより複雑な崩壊モデルに使用されます。 私たちは、FLIMは、時間領域または周波数領域技術の範囲を使用して実装することができ、マルチウェルプレートアレイの自動FLIMのHCAが最初にFRET 51の周波数ドメイン寿命の読み出しを使用して（非切片）広視野顕微鏡で実装されたことに注意してください。広視野時間ゲートイメージング28を利用HCAための最初の自動光学セクショニングFLIMマルチウェルプレートリーダーは次に、報告されました。続いて、広視野（非切片）周波数領域FLIMのHCAは、FRET 52を用いて、遺伝子ライブラリー全体の翻訳後修飾（チロシンリン酸化）をスクリーニングするために適用し、時間ゲートFLIMのHCAは、HIV-1のGagのFRETアッセイするために適用されていますオリゴマー化53およびFOXM1 54のSUMO化のとライチュウのRhoAおよびRac1のバイオセンサー33の。マルチウェルプレートFLIM 26 TCSPCを使用することも可能であるが、今日まで、それはTに一致するように挑戦的証明されています彼は広視野検出を利用した技術のスループット。この問題に対処することができ一新興のアプローチは、SPADアレイ55のような単一の光子計数検出器のアレイを使用することです。 我々は、蛍光タンパク質を用いたFRETのいずれかの読み出しは慎重にとFLIMfitから得られたパラメータまたは任意の他のFLIM解析ソフトウェアの絶対値はフィッティングモデルに関連付けられた仮定に依存することに扱われるべきであることに注意してください。 FRETドナーが重要な第2の減衰成分を有する例については、FRET FLIMデータに合わせてbiexponentialモデルの使用は、典型的には、それが必要以上FRETing集団は高い現れると関連付けられ速い減衰成分の寄与をもたらすことができます。このようなmTq2FPモノ指数寿命のドナーを使用することが望ましいです。それでも、最近の研究は、FRET分析は依然としてアクセプタ蛍光タンパク質またはによって暗い状態により影響され得ることを示しています発色団の角度と距離56の様々な蛍光体の立体構造の分布に方向係数κ2の不均一。それにもかかわらず、我々などがFRETの蛍光寿命の読み出しは、生化学的測定値と相関し、タンパク質相互作用をスクリーニングするために、又はバイオセンサのダイナミクスを追跡するために使用することができる有用な結果を生み出す行うことが示されています。したがって、このopenFLIM HCAプラットフォームは、FRETまたは細胞の自己蛍光8を利用して 、同様に染料ベースのプローブ25の定量的な読み出しを提供する蛍光寿命に基づくアッセイの広い範囲に適用することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="549">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">microscope frame&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">IX81</td>
			<td style="width:101px;">&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">optical autofocus</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">ZDC</td>
			<td>&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">motorized (x-y-z) microscope stage</td>
			<td style="width:64px;">Marzhauser</td>
			<td style="width:64px;">00-24-565-0000</td>
			<td>Stage with Corvus controlle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">excitation laser source</td>
			<td style="width:64px;">Fianium</td>
			<td style="width:64px;">SC400-4</td>
			<td>Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:320px;">gated optical intensifier&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">High Rate Imager (HRI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">delay generators</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>See agile delay generator and precision delay generator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">camera</td>
			<td style="width:64px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:64px;">ORCA-ER-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Nipkow disc scanner unit&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:64px;">CSU-X1&#160;</td>
			<td>http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Top hat diffuser</td>
			<td style="width:64px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:64px;">ED1-S20-MD</td>
			<td>Engineered diffusers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5V&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3850</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq17V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3847</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq32V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3848</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5A</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3849</td>
			<td>mTurquoise Amber construct</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">HEK293T</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>cell type used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">phenol red-free HBSS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>55021C-1000ML</td>
			<td>imaging media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">culture media</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td>DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">DMEM</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">FBS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">xTremeGene9</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>6.37E+09</td>
			<td>for transfection, follow online protocol from La Roche</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">trypsin/EDTA Solution</td>
			<td style="width:64px;">Thermo Fischer</td>
			<td style="width:64px;">R001100</td>
			<td>for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

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Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

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Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

高コンテンツ、オープンソースソフトウェアでサポートされているユニバーサル顕微鏡データからの蛍光マーカー、個々の細胞定量のワークフロー

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

の発達過程を追跡し、定量化<em&gt; C。エレガンス</em&gt;オープンソースのツールを使用しました

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

ハイコンテンツ顕微鏡を用いた細胞レドックスプロファイリング

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapperと超解像顕微鏡のためのオープンソースの単一粒子分析

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...