Name: open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy
Uploaded: 2017-01-18T14:00:00
Duration: 9 min 30 s
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The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.

멀티 웰 플레이트 배열 1. 준비 <ol><li> 기준 측정 t 0의 결정을 사용하는 에탄올 75 μm의 쿠마린 6 (τ ~ 2.43 NS)의 용액을 준비합니다. </li><li> 종자 15 만 왜냐하면의 6 웰 플레이트의 네 우물에 세포 배양 배지에서 하룻밤 첨부 할 수 있습니다 (자료 목록 참조). </li><li> mTq5A, mTq5V, mTq17V 및 mTq32V 24 시간 동안 제조업체의 지침과 문화에 따라 상업 형질 전환 시약을 사용하여 잘 하나 하나를 형질. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 트립신 / EDTA 용액을 이용하여 세포를 분리. </li><li> 이전에 폴리 -L- 라이신 처리 된 # 1.5 두께의 유리 바닥 (96) 멀티 웰 플레이트의 각 웰 A1-G3에 mTq5A을 표현 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)에 현탁 피펫 5,000 왜냐하면 세포. mTq5V이 우물의 A4-G6에 세포를 표현하기위한 반복, 우물 A10-G12에 웰 A5-G9과 mTq32V에 mTq17V. </li&gt; <li> 빈 H1합니다 (멀티 웰 플레이트에서 모든 정적 배경의 측정을 제공하기 위해) 잘 둡니다. </li><li> HBSS 피펫 200 μL 만 아니라 H2로 (세포 배양 배지에서 모든 백그라운드 신호 측정을 제공하기 위해). </li><li> 피펫은 HBSS 5,000 비 형질 전환 세포가 잘 H3로 (휴대폰 형광도에서 어떤 배경 신호의 측정을 제공한다). </li><li> 잘 H4에 75 μM 쿠마린 염료 용액의 피펫 200 μL은 (때문에 주위 온도의 변화 또는 레이저 또는 타이밍 회로의 변동에, 예를 들어 멀티 웰 플레이트 수집, 동안 t 0의 변화에 수표를 제공합니다. </li></ol> 2. openFLIM-HCA 데이터 수집 참고 : 자세한 정보는 openFLIM-HCA 위키 (33)에서 볼 수 있습니다. <ol><li> 시작 μManager과 OpenFLIM-HCA 플러그인 </li><li> 딜레이 생성기 유닛의 특정 조합에 대한 교정 파일을 선택하고&quot;지연 상자 교정 파일 : 교정 파일 FLIM 제어&quot;에서 레이저의 반복률. </li><li> &quot;설정 자료 폴더 파일&quot;데이터가 아래에 저장 될 폴더를 설정합니다. </li><li> 전달 광파이버 그 결합을 확인하기 위해 여기 빔의 경로를 확인하면 안정적이고 커플 링 효율이 파워 미터를 이용하여 전송 광섬유를 통해 전송 된 전력을 측정함으로써 최대화된다. 5 %보다 낮은 변동이 허용됩니다. </li><li> 트리거 GOI이 GOI 입력 트리거 신호에 의해 트리거 오실로스코프에 GOI에서 모니터 출력 신호를 표시하여 안정되어 있는지 확인합니다. </li><li> 750 V로 게인을 설정하고 릴레이 렌즈 중 하나를 중심으로하도록 GOI의 광 음극을 포함하여 CCD 센서 상에 GOI 형광체의 영상을 확인 GOI 커버 불구하고 누출에 의한 배경 광에 드문 드문 단일 광자 이벤트 이미지 ( )이 CCD에 기록 가능한 한 날카로운. </li><li> 샘플 있는지 확인시야 균일 이러한 커버 슬립의 참조 염료 용액 방울로 균일 한 형광 샘플을 촬상 GOI 포화되지 않도록 충분히 낮은 여기 전력 (&lt;1 μW)을 사용하여 조명된다. </li><li> 해당 판 정의 파일을 선택, 즉, 96 웰 플레이트 옵션을 선택 ( &quot;파일 :로드 플레이트 속성&quot;). </li><li> μManager GUI를 사용하여, 빈 위치를 선택하여 현미경 프레임에는 다이크로 익 빔 스플리터 큐브가 없다는 것을 보장한다. </li><li> 수동으로 전체 실험에 ​​대한 GOI에서 4 NS의 게이트 폭을 선택합니다. </li><li> IRF 화상 데이터를 취득 : <ol><li> μManager GUI를 사용하여, 빈 위치를 선택하여 상기 빔 경로에 현미경 대물이 없어야합니다. 수동으로 다시 현미경 프레임에 임의의 반사를 최소화하는 레이저 광 탈출 각도 않도록 대물 터릿 위에 흑색 알루마이트 빔 블록을 배치했다. </li> &lt;리&gt;는 μManager GUI를 사용하여, 회전 Nipkow 디스크로부터 산란 된 여기 광의 일부는 촬상하지만 강도가 200 시스템을 포화 불충분 보장 될 수 있도록 CSUX (여진 이색, 배기 가스)의 필터를 설정 MS CCD 통합 시간. 이 광 음극에 손상을 줄 수 있습니다 너무 많은 빛에 GOI 광 음극 노출되지 않도록하는 것입니다. </li><li> 프로그램 가능한 빠른 지연 상자에 포함 지연의 전체 범위 찾기 maxpoint 기능을 사용하십시오. 표시되는 출력도를 확인하고 전체 IRF 프로파일이 빠른 지연 상자의 스캔 범위 내에 있도록 앞으로 버튼을 눌러 수동 코스 지연 상자를 조정합니다. </li><li> 인수 매개 변수 (중립 밀도, 노출 시간, 프레임 축적) 때문에 CCD는 밝은 시간 문에 포화되지 않고, 효과적인 통합 시간이&gt; 200 밀리를 조정합니다. </li><li> 전체 지연 이상 25 P의 설정 지연 단계를 울렸다전자 ( &quot;FLIM 제어 : 빠른 지연 상자 : 지연을 채 웁니다&quot;). </li><li> &quot;스냅 FLIM 이미지&quot;를 눌러 IRF 이미지를 획득. </li><li> 레이저 차단하여 배경 이미지를 획득 ( &quot;빛 경로 제어를 중립 밀도 : 차단&quot;), 지연의 수 ( &quot;FLIM 제어 : 빠른 지연 상자 : 현재 지연 설정 (PS)을&quot;) 감소, 변경되지 않은 다른 모든 속성을 떠나 를 눌러 &quot;스냅 FLIM 이미지&quot;. </li></ol></li><li> 기준 염료 데이터를 획득 : <ol><li> 잘 μManager GUI를 사용하여 H4 선택 ( &quot;XYZ 제어 : 잘 이동 : H4&quot;참조). </li><li> mTqFP 이미징을위한 μManager GUI를 선택 필터 (여진 17분의 434 nm의, 다이크로 익, 배출 25분의 482의 나노 미터)를 사용. </li><li> 빠른 지연 상자의 전체 범위 찾기 maxpoint 기능을 사용하여 전체 붕괴 프로파일이 빠른 지연 상자의 지연 범위 내에 있도록 다음 코스 지연 상자를 조정합니다. </li><li> 지연을 설정&quot;빠른 지연 상자 : 현재 지연 설정 (PS) FLIM 제어&quot;를 변경하여 최대 강도의 지점. 은 CCD가 포화되지 않도록 수집 매개 변수 (감광, 노출 시간)을 조정한다. </li><li> 전체 지연 범위에서 25 PS의 설정 지연 단계 ( &quot;FLIM 제어 : 빠른 지연 상자를 지연 채우기). </li><li> &quot;스냅 FLIM 이미지&quot;를 누르면 기준 염료 데이터를 획득. </li><li> 여기 레이저를 차단함으로써 제 2 배경 CCD 카메라 화상을 취득 (2.11.7 참조) </li></ol></li><li> μManager 수집 소프트웨어를 이용하여 멀티 웰 플레이트의 샘플 데이터를 획득 FLIM : <ol><li> 우물이 몇 군데해야 설정 및 FOV의 숫자가 아니라 ( &quot;XYZ 위치를 설정 HCA 시퀀스 인수&quot;)에 따라 획득 할 수 있습니다. </li><li> 수동으로 샘플을 포함하는 모형의 FOV가 몇 군데를 선택합니다. GOI에서 최적의 감광 필터, 게이트 폭을 결정하기 위해이 FOV를 사용카메라 일체형 시간 CCD 카메라의 동적 범위의 75 %에 도달하도록. </li><li> 설정 자동 초점 ( &quot;XYZ 제어 : 자동 초점&quot;)을 눌러 &quot;반환 초점 제어 만은&quot;다음 수동으로 세포 또는 관심의 구조에 초점을 맞 춥니 다. 2000 μm의하고 Enter 키를 누르십시오 &quot;입력&quot;을 &quot;자동 초점 검색 범위&quot;를 설정합니다. 보도는 &quot;AF는 이제&quot;자동 초점 절차를 시작합니다. 오프셋 값은 필드 &quot;FocusOffset (자동 초점)&quot;에 표시됩니다. </li><li> 자동 초점 시스템의 올바른 작동을 나타내는, &quot;AF 오프셋&quot;에 2.13.3에서 얻은 오프셋 값을 입력하고 오프셋 값이 지금 제로 있는지 확인하기 위해 ( &quot;AF 지금&quot;)의 두 배 자동 초점 절차를 반복합니다. </li><li> 지연 포인트의 로그 샘플링을 선택합니다 OpenFLIM-HCA 수집 소프트웨어의 &quot;AutoGate&quot;기능을 사용합니다. 또한, 이러한 수동으로 선택할 수 있습니다, 참조 참조자세한 내용은 36 줬어. </li><li> 수율은 총 데이터 수집 시간을 요구하는 값으로 &quot;누산 프레임&quot;을 설정합니다. 축적 된 프레임의 수를 증가 시키면 증가 총 FLIM 데이터 획득 시간의 희생 FLIM 데이터의 신호 대 잡음 비를 증가시킨다. </li><li> 은 &quot;HCA 시퀀스 시작&quot;버튼을 눌러 멀티 웰 플레이트의 FLIM 수집을 실행합니다. </li></ol></li><li> FLIM 데이터 수집에 사용되는 바와 같이 동일한 인수 설정 여진 레이저 (2.11.7 참조)를 차단하여 상기 배경 CCD 카메라 화상을 취득. </li></ol> 3. openFLIM-HCA 데이터 분석 FLIMfit 사용 <ol><li> FLIM 데이터 분석이 필요한 보조 파일이 존재 확인 (즉, IRF 참조 염료 측정). </li><li> 빈도 (H1)에서 데이터를로드, 잘 포함하는 배지 (H2)와 문화 매체에 잘 포함 된 레이블이없는 세포 (H3) FLIMfit에( &quot;파일 :로드 FLIM 데이터&quot;) 웰 A1-G3에, 즉, &quot;기증자 전용&quot;발현하는 세포에서보다 큰 1 % 신호의 배경 기여가 있는지 확인합니다. </li><li> ( &quot;로드 FLIM 데이터 파일&quot;) FLIMfit에 잘 문화 매체를로드하여 시간에 따라 변화하는 배경 (TVB) 파일을 준비합니다. 섹션 2.14에서 획득 한 카메라 배경 데이터로드 ( &quot;배경 :로드 배경을&quot;)와 FLIMfit 옵션 &quot;도구 : TVB의 강도지도 만들기&quot;를 사용 TVB를 생성합니다. TVB에 대한 자세한 사항 31을 참조하십시오. </li><li> 섹션 2.11에서 획득 한 IRF 데이터를로드하여 공간적으로 변화하는 IRF 시프트지도를 준비하고 절 2.11.7에서 취득 된 CCD 카메라 배경을 뺍니다. FLIMfit 옵션 &quot;도구 : IRF 만들기지도를 Shift 키&quot;를 사용 공간 IRF지도 시프트 변하는 계산합니다. IRF 시프트지도에 대한 세부 사항에 대한 기준 [31]을 참조하십시오. </li><li> monoexponen를 장착섹션 2.12에서 취득한 참조 염색은 최초 데이터 붕괴. 로드 참조 염료 및 3.4 절에서 계산 된 공간적으로 변화하는 IRF지도, 설정에 맞게 매개 변수 ( &quot;수명 : 호 특급 : 1&quot;)를 장착 매개 변수로 t에 0 세트 ( &quot;수명 : FIT IRF 이동 : 장착&quot;). 얻어진 t 0의 값은 &quot;매개 변수&quot;탭에 도시 된 표에보고된다. </li><li> 섹션 2.13에서 획득 한 실험 FLIM 데이터를로드하여 FLIM 데이터를 분석, 공간적 변화 IRF지도 3.4 절에서 계산, 섹션 2.14에서 획득 한 카메라 배경은 TVB 파일을 얻을 t 0의 음의 값에 3.3를 입력 준비 섹션 3.5 ( &quot;IRF : IRF 이동 : t 0&quot;). 그런 다음, 실험 조건에 따라 36 FLIMfit 사용하여 원하는 감쇠 모델 실험 데이터를 장착한다. </li></ol>

The authors have nothing to disclose. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

우리는 시간 게이트 FLIM를 사용하여 HCA 용으로 설계된 자동화 된 멀티 웰 플레이트 현미경을 설명했다. 이 악기는 FLIMfit (36), 오픈 소스 프로그램 OMERO 클라이언트 32 μManager의 도구로 매트랩 작성 및 사용할 수를 사용하여 수행되는 OMERO 서버와 FLIM 데이터 분석에 데이터를 저장하는 옵션을 μManager로 작성된 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 제어 제어 소프트웨어, openFLIM-HCA는 자신의 FLIM의 HCA 기기를 구성하는 학술 연구를 가능하게하는 시스템 구성 요소 (48)의 목록 33 온라인으로 사용할 수 있습니다. 강력한 FLIM 데이터를 획득하기 위해서는, GOI 및 CCD 취득 설정을 최적화 및 t 0에서 어떠한 변화를 고려하는 것이 필요하다. 3.8.2에 설명 된 바와 같이, GOI 이득 설정 및 CCD 카메라 적산 시간 ~ 다 CCD 동적 범위의 75 %에 도달하도록 설정하여야한다. 유마다 게이트 지연에 더 GOI 전압 복수 CCD 프레임 축적 노래하는 잡음비 (49)에 신호를 증가 시키지만 이는 적은 형광 광자는 CCD 카메라 포화 프레임 축적 너무 수가 이전 프레임마다 취득되기 때문에 총 FLIM 획득 시간 (증가 증가한다) 등이 트레이드 오프는 각 실험에 대해 결정해야한다. 딜레이 생성기의 보정은 레이저 반복률에 따라 그리고 사용 된 반복율에 대한 정확한 교정 파일을 수집 소프트웨어에 로딩되는 것을 보장하는 것이 필요하다. 지연 상자를 교정하기위한 절차는 openFLIM-HCA 위키 (33)에서 찾을 수 있습니다. 셀룰러 형광도는 형광 신호에 비해 낮은 경우, 우리는 시간에 따라 변화하는 배경 (TVB)를 제공하기 위해 잘 함유 단지 배지로부터의 신호를 사용한다. 세포 배양액으로부터 배경 형광을 최소화하기 위해 피페놀 레드를 포함하는 미디어. 셀룰러 형광도가 중요한 경우, TVB는 표지 된 세포의 측정으로부터 유도 될 수있다. 이것은 자기 형광 배경 이미지의 모든 픽셀에 대해 동일한 것으로 가정하지만,이 경우 관리에주의해야한다. 형광도 셀을 통해 또는 여기 빔 또는 검출 감도가 시야에 걸쳐 균일하지 않은 경우 상당히 다양 할 경우이 가정은 유효하지 않습니다. 산란 여기 광 펄스를 이용하여 IRF 화상의 취득 피팅 프로세스에 데이터 모델과 콘볼 루션되는 시간 IRF 프로파일을 제공하고, 또한 시야에 걸쳐 IRF의 공간적 변이지도를 제공한다. IRF는 Nipkow 디스크가 IRF의 클리너 측정을 제공로부터 산란 된 여기 광을 이용하여, 우리의 장비, 이러한 콜로이드 현탁액 비록 같은 산란 샘플을 이미지화하여 측정 할 수있다. 타이밍 오의 정확한 결정여기 및 시간 게이팅의 지연 시간의 오차가 크게 피팅 프로세스에 영향을 미칠 수 있기 때문에 주 6 IRF는 중요 특히 복소 지수 감쇠 모델 피팅. IRF는 IRF의 공간적 변화가 동일해야하지만, 그 타이밍에 영향을 미칠 수는 여기 파장에서보다는 형광 발광 파장에 기록되기 때문에, 피팅 프로세스에 필요하지 정확히 산란 여기 광을 이용하여 취득 두 파장에서. 광학적으로 단면 한 FLIM에 Nipkow 디스크에서 취득한 IRF 대한 경우와 같이 또한 산란 IRF 세계적으로 인한 산란 오브젝트로부터 서로 다른 광로 길이로 실제 IRF 시간에 대하여 시프트 될 수있다. Protoc에 나타낸 바와 같이, 취득 된 산란 여기 광 IRF 적용해야 필요한 전체 시간 시프트이다이 보정 t 0, 단지 수 기준 염료 데이터로부터 계산올 단계 4.4. 다음 염료 상이한 여기 파장에 대해 사용될 수있다 : 메탄올 중 75 μM 쿠마린 153 용액 (τ는 4.3 ~ 50 NS)가 범위 295-442 nm의 여기에서 사용될 수있다; 에탄올 중 75 μM 쿠마린 6 용액 (τ ~ 2.43 NS 37)는 430-500 nm의 범위에서 여기에 사용될 수있다; 물 75 μM 로다 민 B 용액 (τ는 1.7 ~ 37 NS)는 488-575 nm의 범위에서 여기에 사용될 수있다. 이 시스템의 각 픽셀에 대해 서로 다른 IRF를 사용 FLIMfit 가능하지만 우리는주의, 보통은 공간적으로 변화 IRF 이미지의 모든 픽셀에 대해 동일한 시간 프로파일을 갖는다는 가정을하는 것이 합리적이지만 범위를 제시 의 공간적 글로벌 t 0을 기준으로 시간 오프셋을 변화. 우리는 산란광의 IRF에서 결정되는 IRF 시프트지도로이 설명합니다. 이와 함께 IRF 프로파일, t 0와 IRF 시프트지도는 실내에 사용된다화각의 각 픽셀은 적절한 IRF 장착되어 있는지 확인합니다. 그것은 어떤 FLIM 데이터 취득 전에 측정해야하므로 중요한 t 0 시간 서서히 변할 수있다. 사용자는 형광 감쇄 정보를 샘플링하고, 시간 - 게이트 및 여진 후 상대적인 지연의 폭을 설정하는 데 필요한 방법을 결정한다. 일반적으로, 검출 된 신호를 최대화하기 위해 다양한 게이트 폭을 사용하고 일반적으로 우리가 형광 단백질 표지 세포의 FLIM 4 NS 설정된 게이트 폭을 사용하는 것이 바람직하다. 시간 - 게이트 지연의 수는 분석에 사용되는 피팅 모델의 복잡성 주어진 (단지 여기 펄스 전에 신호를 측정하도록 설정된 하나의 게이트를 포함), 형광 소멸 프로파일을 샘플링하기에 충분해야한다. 최적 값 수명 및 감쇠 요소의 상대 진폭에 의존 할 수있다. 일반적으로, 4 게이트 피팅 단지 수에 충분가있는 동안 7 개 이상의 게이트 수도 붕괴더 복잡한 감쇠 모델에 사용될. 우리 FLIM은 FRET (51)의 주파수 도메인 수명 판독을 이용하여 전체 필드 현미경 시간 도메인 또는 주파수 도메인 기술의 범위를 사용하여 구현 될 수 있고, 멀티 웰 플레이트 어레이들의 자동화 FLIM의 HCA가 먼저 (비 절편)으로 구현되었음을 주목. 넓은 필드 시간 문 영상 (28)을 이용하여 HCA의 첫 번째 자동 광학 절편의 FLIM 멀티 웰 플레이트 리더는 다음보고되었다. 이어서, 넓은 필드 (비 절편) 주파수 도메인 FLIM의 HCA가 FRET 52 이용한 유전자 라이브러리 및 시간 게이팅 FLIM의 HCA 걸쳐 번역 후 변형 (티로신 인산화)을위한 선별에 적용되었다 HIV-1 개그의 분석을 FRET에 적용된 올리고머 53 FOXM1 (54)과 Raichu에서 RhoA와 RAC1 바이오 센서 (33)의 SUMOylation의. 이는 멀티 웰 플레이트 FLIM 26하지만 날짜가 t와 일치하도록 도전 입증되었다 TCSPC를 사용하는 것도 가능하다그는 넓은 필드 검색을 이용 기술의 처리량. 이 문제를 해결 수있는 하나의 새로운 접근 방식은 SPAD 어레이 (55)로 단일 광자 계수 검출기의 배열의 사용이다. 우리는 형광 단백질을 이용하여 FRET 임의의 판독은 피팅 모델과 관련된 가정에 의존한다 FLIMfit 또는 다른 FLIM 분석 소프트웨어로부터 얻은 파라미터의 절대 값주의 것을 취급되어야 참고. 프렛 도너 상당한 초 잔광 구성 요소가 예를 들어, FRET FLIM 데이터에 맞게하는 biexponential 모델의 사용은 전형적으로해야보다 FRETing 인구가 높은 표시에 관련한 빨리 감쇠 성분의 기여가 발생할 수있다. 그러한 mTq2FP 같은 모노 지수 수명이 도너를 사용하는 것이 바람직하다. 그럼에도, 최근 연구 FRET 분석을 계속 받게 형광 단백질 또는 어두운 상태에 의해 영향을받을 수 있음을 보여 주었다발색단 때문에 다양한 각도와 형광체의 배좌의 분포와이 κ 배향 계수의 이질성 (56) 간 거리. 그럼에도 불구하고, 우리와 다른 FRET의 형광 수명 판독은 생화학 적 측정과 상관 관계 및 단백질 상호 작용을 선별하거나 바이오 센서의 역학을 수행하는 데 사용할 수있는 유용한 결과를 생성 할 수 있음을 보여 주었다. 따라서 본 openFLIM HCA 플랫폼 FRET 또는 셀룰러 형광도 8을 이용뿐만 아니라, 염료 계의 프로브 (25)의 정량적 인 판독을 제공하는 형광 수명 기반 분석의 넓은 범위에 적용될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="549">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">microscope frame&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">IX81</td>
			<td style="width:101px;">&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">optical autofocus</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">ZDC</td>
			<td>&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">motorized (x-y-z) microscope stage</td>
			<td style="width:64px;">Marzhauser</td>
			<td style="width:64px;">00-24-565-0000</td>
			<td>Stage with Corvus controlle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">excitation laser source</td>
			<td style="width:64px;">Fianium</td>
			<td style="width:64px;">SC400-4</td>
			<td>Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:320px;">gated optical intensifier&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">High Rate Imager (HRI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">delay generators</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>See agile delay generator and precision delay generator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">camera</td>
			<td style="width:64px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:64px;">ORCA-ER-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Nipkow disc scanner unit&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:64px;">CSU-X1&#160;</td>
			<td>http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Top hat diffuser</td>
			<td style="width:64px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:64px;">ED1-S20-MD</td>
			<td>Engineered diffusers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5V&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3850</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq17V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3847</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq32V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3848</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5A</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3849</td>
			<td>mTurquoise Amber construct</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">HEK293T</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>cell type used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">phenol red-free HBSS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>55021C-1000ML</td>
			<td>imaging media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">culture media</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td>DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">DMEM</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">FBS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">xTremeGene9</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>6.37E+09</td>
			<td>for transfection, follow online protocol from La Roche</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">trypsin/EDTA Solution</td>
			<td style="width:64px;">Thermo Fischer</td>
			<td style="width:64px;">R001100</td>
			<td>for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

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Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

우리는 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 기초 판독하여 단백질 상호 작용을 분석 자동화 형광 수명 이미징 (FLIM)을 이용하는 오픈 소스 고 함량 분석 (HCA) 기기를 제시한다. 이 openFLIM-HCA 기기에 대한 데이터 수집은 소프트웨어 μManager 작성 및 데이터 분석 FLIMfit에 착수에 의해 제어된다.

자동 형광 수명 이미징 현미경을 활용하여 오픈 소스 높은 콘텐츠 분석

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

연구

생물학

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

신속한 분석 및 형광 현미경 이미지의 탐사

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

탠덤 고압 냉동 및 투과 전자 현미경을위한 식물 조직의 빠른 동결 교체

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

높은 콘텐츠, 오픈 소스 소프트웨어에 의해 지원되는 범용 현미경 데이터에서 형광 마커, 개별 셀 정량화를위한​​ 워크 플로우

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

의 발달 프로세스 추적 및 정량화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 오픈 소스 도구를 사용하여

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

고감도 현미경을 이용한 세포 산화 환원 프로파일 링

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapper 슈퍼 해상도 현미경을위한 오픈 소스 단일 입자 분석

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...