Name: open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy
Uploaded: 2017-01-18T14:00:00
Duration: 9 min 30 s
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The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.

1. Preparação do Multiwell placa matriz <ol><li> Prepara-se uma solução de 75 uM Cumarina 6 em etanol (t ~ 2,43 NS) para medições de referência para permitir a determinação de T 0. </li><li> Semente 150.000 células Cos em quatro poços de uma placa de 6 poços e deixa-se ligar durante a noite em meio de cultura (ver Lista de Materiais). </li><li> Transfectar uma bem cada uma com mTq5A, mTq5V, mTq17V e mTq32V usando um reagente de transfecção comercial de acordo com as instruções do fabricante e a cultura durante 24 h. </li><li> Retire células utilizando uma solução de tripsina / EDTA comercial de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Pipetar as células Cos 5.000 suspensos em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) que expressam mTq5A em cada um dos poços A1-G3 de uma placa de poços múltiplos 96 # 1.5 espessura com fundo de vidro, que tenha sido previamente tratada com poli-L-lisina. Repetir para mTq5V expressando células em poços A4-G6, em poços mTq17V A5-G9 e mTq32V em poços A10-G12. </li&gt; <li> Deixar bem H1 vazio (para medir de qualquer fundo estático da placa com múltiplas cavidades). </li><li> Pipetar 200 uL de HBSS única em H2 bem (para fornecer uma medição de qualquer sinal de fundo a partir do meio de cultura celular). </li><li> Pipeta 5.000 células não transf ectadas em HBSS em H3 bem (para fornecer uma medição de qualquer sinal de fundo a partir de autofluorescência celular). </li><li> Pipetar 200 mL da solução 75 uM de corante cumarina para bem H4 (para proporcionar um controlo sobre qualquer variação de t 0, durante a aquisição placa com múltiplas cavidades, por exemplo, devido a alterações na temperatura ambiente ou a flutuações em laser ou circuitos de temporização. </li></ol> 2. Aquisição de Dados openFLIM-HCA NOTA: Informações detalhadas podem encontrado no wiki openFLIM-HCA 33. <ol><li> Iniciar μManager eo Plugin OpenFLIM-HCA </li><li> Selecione o arquivo de calibração para a combinação específica de unidade geradora de atraso etaxa de repetição do laser em &quot;FLIM controle: Atraso arquivo de calibração caixa de: Arquivos de Calibração&quot;. </li><li> Definir a pasta onde os dados serão salvos em &quot;Arquivo: Set Pasta Base&quot;. </li><li> Verificar o percurso do feixe de excitação para assegurar que o acoplamento na fibra óptica de entrega é estável e que a eficiência de acoplamento é maximizada através da medição de energia transmitida através da fibra de entrega utilizando um medidor de potência. As flutuações menores do que 5% são aceitáveis. </li><li> Verifique se o GOI disparo é estável, exibindo o sinal de saída do monitor do GOI em um osciloscópio desencadeada pelo sinal de disparo de entrada GOI. </li><li> Verifique a imagem do fósforo GOI para o sensor CCD, cobrindo o fotocátodo do GI, definindo o seu ganho para 750 V e concentrando-se a uma das lentes de retransmissão de tal forma que as imagens de eventos de fótons individuais esparsos (devido a luz de fundo vazamento embora a tampa GOI ) gravado no CCD são tão nítidas quanto possível. </li><li> Verifique se a amostracampo de visão é iluminada uniformemente por imagiologia de uma amostra fluorescente uniforme, tal como uma gota de solução de corante de referência sobre uma lamela, utilizando uma suficientemente baixa energia de excitação (&lt;1 mW) para garantir que o GI não está saturado. </li><li> Selecione o arquivo de definição de placa adequado, ou seja, selecione a opção para placas de 96 poços ( &quot;file: propriedades de carga da placa&quot;). </li><li> Usando o μManager GUI, assegurar que não há cubo separador de feixes dicróico no corpo do microscópio, seleccionando uma posição vazia. </li><li> selecionar manualmente uma largura de portão de 4 ns na GOI para todo o experimento. </li><li> Adquirir dados de imagem IRF: <ol><li> Usando o μManager GUI, garantir que não há nenhuma objetiva do microscópio no caminho do feixe, selecionando uma posição vazia. colocar manualmente um bloco feixe anodizado preto acima da torre da objetiva para evitar qualquer escape luz laser e ângulo para minimizar qualquer reflexão de volta para o corpo do microscópio. </li> &lt;li&gt; Usando o μManager GUI, configure os filtros na CSUX (Excitação, Dichroic, Emissão) de tal modo que a fração de luz de excitação dispersa a partir do disco de Nipkow fiação pode ser trabalhada, mas garantir a intensidade não é suficiente para saturar o sistema para um 200 MS CCD tempo de integração. Isso é para evitar a exposição da fotocatodo GOI a muita luz, o que poderia danificar o fotocátodo. </li><li> Use a função Find MaxPoint em toda a gama dos atrasos abrangidos pela caixa de atraso rápido programável. Consulte o diagrama da saída exibida e, em seguida, ajustar a caixa atraso claro o manual pressionando o botão para a frente de modo que o perfil completo IRF está dentro da faixa de varredura da caixa de atraso o jejum. </li><li> Ajustar os parâmetros de aquisição (densidade neutra, tempo de exposição, a acumulação frame) de modo que o CCD não está saturado na mais brilhante tempo portão e o tempo de integração eficaz é&gt; 200 ms. </li><li> Definir medidas de atraso de 25 ps sobre o atraso completo tocoue ( &quot;controle de FLIM: Caixa de atraso rápida: Preencher atrasos&quot;). </li><li> Adquirir imagem IRF pressionando &quot;imagem snap FLIM&quot;. </li><li> Adquirir uma imagem de fundo, bloqueando a laser ( &quot;controle de caminho de luz: densidade neutra: bloqueado&quot;), reduzindo o número de atrasos ( &quot;controle de FLIM: Caixa de atraso rápida: definição de atraso actual (MA)&quot;), deixe todas as outras propriedades inalterada e imprensa &quot;snap imagem FLIM&quot;. </li></ol></li><li> Adquirir dados corante de referência: <ol><li> Selecione bem H4 usando a μManager GUI ( &quot;controle XYZ: Vá para o bem: H4&quot;). </li><li> Usando o μManager GUI, selecione filtros (Excitação 434/17 nm, Dichroic, Emissão 482/25 nm) para geração de imagens mTqFP. </li><li> Use a função Find MaxPoint em toda a gama de caixa de atraso do rápido e, em seguida, ajustar a caixa atraso grosso modo o perfil de decaimento completo está dentro do intervalo de atraso de caixa de atraso o jejum. </li><li> Definir o atrasoao ponto de intensidade máxima, alterando o &quot;controle FLIM: Caixa de atraso rápida: definição de atraso actual (MA)&quot;. Ajustar os parâmetros de aquisição (densidade neutra, tempo de exposição) para que o CCD não está saturado. </li><li> Definir medidas de atraso de 25 ps acima da faixa de atraso total ( &quot;controle FLIM: Caixa de atraso rápida: Preencher atrasos). </li><li> Adquirir dados de corante de referência pressionando &quot;imagem snap FLIM&quot;. </li><li> Adquirir imagem da câmara CCD um segundo fundo, bloqueando a laser de excitação (ver 2.11.7) </li></ol></li><li> Adquirir dados FLIM da amostra placa de poços múltiplos usando o software de aquisição de μManager: <ol><li> Defina quais poços devem ser trabalhada eo número de FOV a ser adquirido por poço ( &quot;HCA Setup aquisição sequenciado: posições XYZ&quot;). </li><li> seleccionar manualmente um FOV exemplar contendo a amostra a ser trabalhada. Utilize este FOV para determinar o filtro de densidade neutra ideal, largura portão no GI etempo de integração da câmara, de modo a chegar a 75% da gama dinâmica da câmara CCD. </li><li> Definir a focagem automática ( &quot;controle XYZ: Foco automático&quot;): Aperte &quot;única controle de foco Retorno&quot;, e depois focar manualmente as células ou estrutura de interesse. Defina &quot;intervalo de pesquisa focagem automática&quot; a 2000 mm e pressione &quot;Enter&quot;. Pressione o botão &quot;AF agora&quot; para iniciar um processo de focagem automática. Um valor de deslocamento vai aparecer no campo &quot;FocusOffset (focagem automática)&quot;. </li><li> Digite o valor do deslocamento obtido em 2.13.3 para &quot;AF offset&quot; e repita o procedimento autofocus duas vezes ( &quot;AF agora&quot;) para verificar se o valor do deslocamento agora é zero, indicando o correto funcionamento do sistema de focagem automática. </li><li> Use a função &quot;AutoGate&quot; no software de aquisição OpenFLIM-HCA para escolher uma amostragem logarítmica dos pontos de atraso. Alternativamente, estes podem ser seleccionadas manualmente, ver referemrência 36 para mais detalhes. </li><li> Defina &quot;Acumular Frames&quot; para um valor que os rendimentos desejado tempo total de aquisição de dados. Aumentando o número de quadros acumulados aumenta a relação sinal-ruído dos dados de FLIM à custa de também o aumento do tempo total de aquisição de dados de FLIM. </li><li> Executar a aquisição de FLIM da placa com múltiplas cavidades, premindo o botão &quot;Iniciar sequência HCA&quot;. </li></ol></li><li> Aquisição de mais imagem da câmara CCD fundo, bloqueando a laser de excitação (ver 2.11.7) com configurações de aquisição idênticos tão utilizado para a aquisição de dados FLIM. </li></ol> 3. openFLIM-HCA Análise de Dados Usando FLIMfit <ol><li> Verifique se os arquivos auxiliares necessários para análise de dados FLIM estão presentes (ou seja, IRF e medição corante de referência). </li><li> Carregar os dados a partir do poço vazio (H1), o meio de cultura contendo também (H2) e as cavidades que continham células não marcadas em meio de cultura (H3) em FLIMfit( &quot;Ficheiro: FLIM dados de carga&quot;) para verificar se existem quaisquer contribuições de fundo maior do que 1% do sinal a partir das células que expressam &quot;doador-apenas&quot;, ou seja, em poços A1-G3. </li><li> Prepare um arquivo de variável no tempo de fundo (TVB) carregando o médio, bem com a cultura em FLIMfit ( &quot;File: dados FLIM Load&quot;). Carregar os dados de fundo de câmara adquiridos na seção 2.14 ( &quot;Background: Fundo Load&quot;) e usar as &quot;Ferramentas: Criar TVB Mapa Intensidade&quot; opção FLIMfit para gerar a TVB. Ver a referência 31 para mais detalhes sobre a TVB. </li><li> Prepare o espacialmente variável IRF Mapa Turno por carregar os dados IRF adquiridos na secção 2.11 e subtrair o branco câmera CCD adquirida na secção 2.11.7. Use a opção FLIMfit &quot;Ferramentas: Criar IRF deslocação da carta&quot; para calcular a espacialmente variável IRF deslocação da carta. Veja referência [31] para mais detalhes sobre o Mapa de Deslocamento IRF. </li><li> Caber um monoexponencial cárie aos dados de corante de referência adquiridas na seção 2.12. Dye carga de referência eo Mapa IRF espacialmente variável calculada no ponto 3.4, definidos parâmetros de ajuste ( &quot;Lifetime: No. Exp: 1&quot;) com t 0 conjunto como um parâmetro equipada ( &quot;Lifetime: FIT IRF Turno: justo&quot;). O valor de t 0 obtido é então relatado na tabela mostrada na guia &quot;Parâmetros&quot;. </li><li> Analisar os dados FLIM por carregar os dados FLIM experimentais adquiridos na seção 2.13, o espacialmente variável IRF Mapa calculada no ponto 3.4, o branco câmera adquirida na seção 2.14, o arquivo TVB preparado na seção 3.3 e digite o valor negativo de t 0 obtido na secção 3.5 ( &quot;IRF: IRF mudança: t 0&quot;). Em seguida, ajustar os dados experimentais para o modelo de decaimento desejado usando FLIMfit 36 de acordo com os requisitos do experimento. </li></ol>

The authors have nothing to disclose. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Nós descrevemos um microscópio placa com múltiplas cavidades automatizado projetado para HCA usando FLIM fechado em tempo. Este instrumento é controlado através de software de código aberto escrito em μManager com a opção de salvar os dados para um servidor OMERO ea análise dos dados FLIM sendo realizado usando FLIMfit 36, um programa de código aberto escrito em Matlab e disponível como um cliente OMERO 32 O instrumento μManager software de controle, openFLIM-HCA, está disponível on-line 33 com uma lista dos componentes do sistema 48 para permitir que pesquisadores acadêmicos para construir seus próprios instrumentos FLIM HCA. A fim de adquirir dados FLIM robustos, é necessário para otimizar as configurações de aquisição de Governo indiano e CCD e para ter em conta as variações de t 0. Tal como descrito em 3.8.2, e o ajuste de ganho câmara CCD GI tempo de integração deverá ser ajustada para atingir ~ 75% da gama dinâmica do CCD. vocêcantar mais elevadas tensões GOI e várias acumulações de quadro CCD em cada atraso porta do tempo aumenta a relação sinal-ruído 49, mas isso aumenta o tempo total de aquisição FLIM (já que menos fótons de fluorescência são adquiridos por quadro antes de os ácidos gordos saturados de câmera CCD e por isso o número de acumulações de quadro deve ser aumentada) e por isso este trade-off deve ser decidido para cada experimento. A calibração do gerador de atraso depende da taxa de repetição do laser e é, portanto, necessário para assegurar que o ficheiro de calibração correcta para a taxa de repetição utilizado é carregado para o software de aquisição. O procedimento para calibrar a caixa de atraso pode ser encontrado no wiki openFLIM-HCA 33. Se a autofluorescência celular é baixo quando comparado com o sinal de fluorescência, que utilizam o sinal a partir de um meio de cultura apenas uma das cavidades contendo a fornecer o fundo variável no tempo (TVB). Para minimizar a fluorescência de fundo do meio de cultura celular, evitamosmídia contendo vermelho de fenol. Se a autofluorescência celular é significativo, em seguida, o TVB podem ser derivadas a partir de medições das células não marcadas. No entanto, neste caso, deve ser tomado cuidado, já que esta assume que a autofluorescência fundo é a mesma para cada pixel na imagem. Esta suposição não será válida se a autofluorescência varia significativamente entre uma célula ou se o feixe de excitação ou sensibilidade de detecção não é uniforme ao longo do campo de visão. A aquisição de uma imagem de IRF usando pulsos de luz de excitação espalhadas fornece o perfil de IRF temporal que é convolvido com o modelo de dados no processo de adaptação e também fornece um mapa da variação espacial da IRF em todo o campo de vista. O IRF pode ser medida por imagiologia de uma amostra de espalhamento, tais como uma suspensão coloidal, embora, no nosso instrumento, usando a luz de excitação espalhada a partir do disco de Nipkow fornece uma medição de líquido de limpeza do IRF. A determinação precisa do momento of IRF é importante porque os erros no tempo de atraso entre o tempo de excitação e-gating pode impactar significativamente o processo de adaptação, particularmente na altura da montagem de complexos modelos de decaimento exponencial. O IRF adquiridos utilizando luz de excitação dispersa não é exatamente o que é necessário para o processo de adaptação, porque ele é gravado no comprimento de onda de excitação ao invés de no comprimento de onda de emissão de fluorescência, o que pode afetar o seu calendário, embora a variação espacial da IRF deve ser o mesmo em ambos os comprimentos de onda. Além disso, o IRF dispersa pode ser deslocado em todo o mundo no tempo em relação à verdadeira IRF devido a um comprimento do percurso óptico diferindo do objecto dispersão, como é o caso para um IRF adquirida a partir do disco de Nipkow em FLIM opticamente seccionada. Esta correcção, t 0, que é o deslocamento temporais mundial necessário que deve ser aplicada ao IRF luz de excitação espalhada adquirida, é calculado a partir dos dados de referência monoexponencial corante tal como indicado na Protocetapa ol 4.4. Os seguintes corantes podem ser usados para diferentes comprimentos de onda de excitação: 75 uM um Cumarina 153 solução em metanol (τ ~ 4.3 NS 50) pode ser usado para a excitação na gama de 295-442 nm; uma solução de 75 uM Cumarina 6 em etanol (t ~ 2,43 NS 37) pode ser usado para a excitação na gama de 430-500 nm; e uma solução 75 | iM rodamina B em água (τ ~ 1.7 NS 37) pode ser usado para a excitação na gama de 488-575 nm. Fazemos notar que, embora seja possível, em FLIMfit usar um IRF diferente para cada pixel do sistema, geralmente, é razoável assumir que o IRF espacialmente variável tem o mesmo perfil temporal para cada pixel da imagem, mas apresenta uma gama de espacialmente variando deslocamentos temporais relativos ao global a T 0. Descrevemos deste como o mapa de IRF mudança, a qual é determinada a partir da luz dispersa IRF. Juntos, o perfil de IRF, t 0 e o mapa deslocamento IRF são usados para PTCertifique-se de que cada pixel no campo de visão é equipado com um IRF apropriado. Importante, t 0 pode variar lentamente ao longo do tempo por isso deve ser medido antes de qualquer aquisição de dados FLIM. O usuário deve decidir como provar os perfis de decaimento de fluorescência e é necessário para definir a largura dos tempos portões e seus atrasos relativos após excitação. Em geral, é desejável usar grandes larguras de porta para maximizar o sinal detectado e normalmente usamos larguras de porta configurada para 4 ns para FLIM de células marcadas com proteínas de fluorescência. O número de atrasos de tempo de porta deve ser suficiente para provar o perfil de decaimento de fluorescência (incluindo um portão definido para medir o sinal imediatamente antes do pulso de excitação) dada a complexidade do modelo adequado que vai ser utilizado na análise. O valor óptimo pode depender de os tempos de vida e amplitudes relativas dos componentes de decaimento. Em geral, 4 portas são suficientes para monoexponencial montagem decai enquanto 7 ou mais portas podemser usado para mais modelos de decaimento complexas. Notamos que FLIM pode ser implementado usando uma variedade de técnicas no domínio do tempo ou no domínio da frequência e HCA FLIM automatizada de arranjos de placas de múltiplos poços foi implementado pela primeira vez em um (não-corte) microscópio de campo amplo usando leituras ao longo da vida no domínio da frequência de FRET 51. O primeiro leitor de placas de poços múltiplos óptico seccionamento FLIM automatizado para HCA utilizando todo o campo de imagem fechado em tempo 28 foi então relatada. Subsequentemente, toda a área (não de corte) no domínio da frequência de FLIM HCA foi aplicado para o rastreio de translacionais pós (fosforilação de tirosina) ao longo de uma biblioteca de genes usando FRET 52 e HCA FLIM-gated tempo tem sido aplicada a FRET ensaios de HIV-1 Gag oligomerização 53 e de SUMOilação de FOXM1 54 e de Raichu RhoA e Rac1 biossensores 33. É também possível utilizar TCSPC FLIM para placa de poços múltiplos 26, mas até à data não tenha sido um desafio para combinar tele taxa de transferência de técnicas que exploram a detecção de campo amplo. Uma abordagem emergente que poderia resolver este problema é o uso de matrizes de detectores de contagem de fótons individuais, tais como matrizes SPAD 55. Fazemos notar que quaisquer leituras de FRET utilizando proteínas fluorescentes devem ser tratados com precaução e que os valores absolutos dos parâmetros obtidos a partir FLIMfit ou qualquer outro software de análise de FLIM dependerá das hipóteses associadas com o modelo de ajustamento. Por exemplo, onde o dador de FRET tem uma componente significativa segundo decaimento, a utilização de um modelo biexponencial para ajustar os dados de FRET FLIM pode resultar na contribuição do componente mais rápida deterioração, tipicamente associados com a população FRETing aparecendo maior do que deveria. Por conseguinte, é desejável utilizar doadores com um tempo de vida de mono-exponencial, tais como mTq2FP. Mesmo então, os estudos recentes têm demonstrado que a análise de FRET pode ainda ser afectado por estados escuras de proteínas aceitador de fluorescência ou porheterogeneidade do factor de orientação κ 2 devido a uma distribuição de conformações fluoróforo com uma variedade de ângulos e distâncias cromóforos 56. No entanto, nós e outros mostraram que as leituras de fluorescência ao longo da vida de FRET produzem resultados úteis que se correlacionam com as medições bioquímicas e pode ser utilizado para pesquisar as interacções proteína ou para acompanhar a dinâmica de biossensores. Assim, esta plataforma openFLIM HCA pode ser aplicado a uma vasta gama de ensaios à base de tempo de vida de fluorescência utilizando FRET ou autofluorescência celular 8, bem como proporcionando leituras quantitativas de sondas à base de corante 25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="549">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">microscope frame&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">IX81</td>
			<td style="width:101px;">&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">optical autofocus</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">ZDC</td>
			<td>&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">motorized (x-y-z) microscope stage</td>
			<td style="width:64px;">Marzhauser</td>
			<td style="width:64px;">00-24-565-0000</td>
			<td>Stage with Corvus controlle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">excitation laser source</td>
			<td style="width:64px;">Fianium</td>
			<td style="width:64px;">SC400-4</td>
			<td>Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:320px;">gated optical intensifier&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">High Rate Imager (HRI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">delay generators</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>See agile delay generator and precision delay generator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">camera</td>
			<td style="width:64px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:64px;">ORCA-ER-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Nipkow disc scanner unit&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:64px;">CSU-X1&#160;</td>
			<td>http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Top hat diffuser</td>
			<td style="width:64px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:64px;">ED1-S20-MD</td>
			<td>Engineered diffusers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5V&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3850</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq17V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3847</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq32V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3848</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5A</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3849</td>
			<td>mTurquoise Amber construct</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">HEK293T</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>cell type used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">phenol red-free HBSS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>55021C-1000ML</td>
			<td>imaging media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">culture media</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td>DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">DMEM</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">FBS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">xTremeGene9</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>6.37E+09</td>
			<td>for transfection, follow online protocol from La Roche</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">trypsin/EDTA Solution</td>
			<td style="width:64px;">Thermo Fischer</td>
			<td style="width:64px;">R001100</td>
			<td>for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

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Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Nós apresentamos uma análise (HCA) instrumento de alto conteúdo open source utilizando imagens de fluorescência vida automatizado (FLIM) para ensaiar interações proteína usando Förster transferência de energia de ressonância (FRET) leituras base. Aquisição de dados para este instrumento openFLIM-HCA é controlada por software escrito em μManager e análise de dados é realizado em FLIMfit.

Open Source Análise alta Conteúdo Utilizando Automated microscopia de fluorescência Lifetime Imagiologia

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Biologia

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imagem C. elegans Os embriões utilizando um microscópio de epifluorescência e Software de Código Aberto

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Análise rápida e Exploração de microscopia de fluorescência Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem congelamento de pressão alta e rápida substituição em congelamento dos tecidos vegetais por Microscopia Eletrônica de Transmissão

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Fluxo de trabalho para de alta conteúdo, Quantificação de células individuais de marcadores fluorescentes de Microscópio Universal Data, apoiada pela Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Rastreamento e quantificação processos de desenvolvimento em<em&gt; C. elegans</em&gt; Como usar as ferramentas de código aberto

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Redox Cellular Profiling Usando Microscopia de Alto Conteúdo

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Análise de partícula única open-source para Microscopia Super-resolução com VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...