Name: open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy
Uploaded: 2017-01-18T14:00:00
Duration: 9 min 30 s
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The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.

1. Preparación de multipocillos placa array <ol><li> Preparar una solución de 75 mM cumarina 6 en etanol (t ~ 2,43 ns) para mediciones de referencia para permitir la determinación de t 0. </li><li> Semilla de 150.000 células Cos en cuatro pocillos de una placa de 6 pocillos y dejar que se unieran durante la noche en medio de cultivo (véase la Lista de Materiales). </li><li> Transfectar un pozo cada uno con mTq5A, mTq5V, mTq17V y mTq32V usando un reactivo de transfección comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante y cultivo durante 24 h. </li><li> Separar las células utilizando una solución de tripsina / EDTA comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> células de pipeta 5.000 Cos en suspensión en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que expresan mTq5A en cada uno de los pocillos A1-G3 de un espesor de 96 placa de múltiples pocillos con fondo de vidrio # 1.5 que ha sido previamente tratado con poli-L-lisina. Repita para mTq5V que expresan las células en los pocillos A4-G6, mTq17V en los pozos A5-G9 y mTq32V en pocillos A10-G12. </li&gt; <li> Deja así H1 vacío (para proporcionar una medición de cualquier fondo estático de la placa de múltiples pocillos). </li><li> Pipetear 200 l de HBSS solamente en H2 bien (para proporcionar la medición de cualquier señal de fondo del medio de cultivo celular). </li><li> Pipetear 5.000 células no transfectadas en HBSS en H3 bien (para proporcionar la medición de cualquier señal de fondo de autofluorescencia celular). </li><li> Pipetear 200 l de la solución de colorante cumarina 75 M en bien H4 (para proporcionar un control sobre cualquier variación de t 0 durante la adquisición placa de múltiples pocillos, por ejemplo, debido a cambios en la temperatura ambiente o a las fluctuaciones de láser o el momento de circuitos. </li></ol> 2. openFLIM-HCA Adquisición de Datos NOTA: La información detallada se encuentra en el openFLIM-HCA wiki de 33. <ol><li> Inicio μManager y el plugin OpenFLIM-HCA </li><li> Seleccione el archivo de calibración para la combinación específica de unidad de generador de retardo ytasa de repetición del láser en &quot;Flim de control: Retraso archivo de calibración cuadro: Los archivos de calibración&quot;. </li><li> Establecer la carpeta donde se guardarán los datos bajo &quot;Archivo: Establecer carpeta de base&quot;. </li><li> Compruebe la trayectoria del haz de excitación para asegurar que el acoplamiento a la fibra óptica de entrega es estable y que la eficacia de acoplamiento se maximiza mediante la medición de la potencia transmitida a través de fibra de distribución utilizando un medidor de potencia. Las fluctuaciones menores que 5% son aceptables. </li><li> Compruebe que el GOI desencadenante es estable mediante la visualización de la señal de salida del monitor desde el Gobierno de la India en un osciloscopio activado por la señal de disparo de entrada GOI. </li><li> Compruebe la imagen del fósforo GOI en el sensor CCD, cubriendo el fotocátodo del Gobierno de la India, el establecimiento de su ganancia a 750 V y se centra una de las lentes de retransmisión de tal manera que las imágenes de los eventos de un solo fotón escaso (debido a la luz de fondo con fugas, aunque la cubierta GOI ) registrada en el CCD son tan nítidas como sea posible. </li><li> Compruebe que la muestracampo de visión se ilumina de manera uniforme por la formación de imágenes de una muestra fluorescente uniforme, tal como una gota de la solución de colorante de referencia sobre un cubreobjetos, utilizando una potencia suficientemente baja excitación (&lt;1 mW) para asegurar que el GOI no está saturado. </li><li> Seleccione el archivo de definición de placa apropiado, es decir, seleccione la opción de placas de 96 pocillos ( &quot;Archivo: Propiedades de placa de carga&quot;). </li><li> Uso de la interfaz gráfica de usuario μManager, asegúrese de que no hay un cubo divisor de haz dicroico en el pie del microscopio mediante la selección de una posición vacía. </li><li> seleccionar manualmente una anchura de la puerta de 4 ns en el Gobierno de la India durante todo el experimento. </li><li> Adquirir datos de imagen IRF: <ol><li> Uso de la interfaz gráfica de usuario μManager, asegúrese de que no hay un objetivo de microscopio en la trayectoria del haz mediante la selección de una posición vacía. colocar manualmente un bloqueo de haz anodizado negro por encima de la torreta objetivo de evitar cualquier escape de luz láser y el ángulo para minimizar cualquier reflexión de nuevo en el pie del microscopio. </li> &lt;li&gt; Uso de la interfaz gráfica de usuario μManager, establece los filtros en el CSUX (Excitación, dicroico, Emisión) de tal manera que la fracción de luz de excitación dispersa desde el disco de Nipkow hilado se pueden obtener imágenes, sino asegurar la intensidad no es suficiente para saturar el sistema por un 200 ms de tiempo de integración del CCD. Esto es para evitar exponer el fotocátodo GOI a demasiada luz, lo que podría dañar el fotocátodo. </li><li> Utilice la función de búsqueda MaxPoint sobre la gama completa de los retrasos cubiertos por el cuadro de retardo programable rápido. Compruebe el diagrama de resultados que se muestran a continuación, ajuste la caja manual de retardo curso pulsando el botón de avance de modo que el perfil completo de IRF está dentro del rango de exploración de la caja de retardo rápido. </li><li> Ajustar los parámetros de adquisición (densidad neutra, tiempo de exposición, la acumulación de Imagen) por lo que el CCD no está saturado en el más brillante puerta del tiempo y el tiempo de integración efectiva es&gt; 200 ms. </li><li> Establecer medidas de retardo de 25 ps por el retraso completo sonarone ( &quot;control Flim: caja de retardo rápido: Rellenar los retrasos&quot;). </li><li> Adquirir imagen IRF pulsando &quot;imagen Snap Flim&quot;. </li><li> Adquirir una imagen de fondo al bloquear el láser ( &quot;control de la trayectoria de luz: densidad neutra: bloqueado&quot;), lo que reduce el número de retrasos ( &quot;control Flim: caja de retardo rápido: ajuste de retardo actual (p)&quot;), deje todas las demás propiedades inalteradas y pulse el botón &quot;Ajustar imagen Flim&quot;. </li></ol></li><li> Adquirir datos de tinte de referencia: <ol><li> Seleccione bien H4 mediante el uso de la interfaz gráfica de usuario μManager ( &quot;control XYZ: Ir a bien: H4&quot;). </li><li> Uso de la interfaz gráfica de usuario μManager, filtros de selección (excitación 434/17 nm, dicroico, emisión 482/25 nm) para obtener imágenes de mTqFP. </li><li> Utilice la función de búsqueda MaxPoint sobre la gama completa de la caja de retardo rápido y luego ajustar el cuadro de retardo basto por lo que el perfil completo de descomposición se encuentra dentro del rango de retardo de la caja de retardo rápido. </li><li> Ajuste el retrasohasta el punto de máxima intensidad, cambiando el &quot;control Flim: caja de retardo rápido: ajuste de retardo actual (p)&quot;. Ajustar los parámetros de adquisición (densidad neutra, tiempo de exposición) para que el CCD no está saturado. </li><li> Establecer medidas de retardo de 25 ps sobre el rango total del retardo ( &quot;control de Flim: caja de retardo rápido: Rellenar los retrasos). </li><li> Adquirir datos de referencia de tinte presionando &quot;imagen Snap Flim&quot;. </li><li> Adquirir imagen de la cámara CCD de un segundo fondo al bloquear el láser de excitación (véase 2.11.7) </li></ol></li><li> Flim adquirir datos de la muestra placa de múltiples pocillos usando el software de adquisición μManager: <ol><li> Determina desde qué pozos deberían obtenerse imágenes y el número de campo de visión para ser adquiridos por pozo ( &quot;Configuración HCA adquisición secuenciada: posiciones XYZ&quot;). </li><li> seleccionar manualmente un campo de visión ejemplar que contiene la muestra que se va a ver. Use este campo de visión para determinar el filtro de densidad neutra óptima, anchura de la puerta en el Gobierno de la India ytiempo de integración de la cámara con el fin de alcanzar el 75% de la gama dinámica de la cámara CCD. </li><li> Enfoque automático set ( &quot;control XYZ: Enfoque automático&quot;): Pulse &quot;único control devuelva el foco&quot; y, a continuación, se centran de forma manual en las células o estructura de interés. Ajuste &quot;rango de búsqueda de enfoque automático&quot; a 2000 micras y presionar &quot;Enter&quot;. Pulse la tecla &quot;AF ahora&quot; para iniciar un procedimiento de enfoque automático. Un valor de desplazamiento se mostrará en el campo &quot;FocusOffset (enfoque automático)&quot;. </li><li> Introduzca el valor de desplazamiento obtenido en 2.13.3 en &quot;AF compensado&quot; y repita el procedimiento de enfoque automático dos veces ( &quot;AF ahora&quot;) para comprobar que el valor de desplazamiento es ahora cero, lo que indica el correcto funcionamiento del sistema de enfoque automático. </li><li> Utilice la función &quot;AutoGate&quot; en el software de adquisición de OpenFLIM-HCA para elegir una muestra logarítmica de los puntos de retardo. Alternativamente, éstos pueden ser seleccionados manualmente, ver refiereENCE 36 para más detalles. </li><li> Ajuste &quot;Acumular Marcos&quot; a un valor que los rendimientos deseados tiempo total de adquisición de datos. Aumentar el número de tramas acumuladas aumenta la relación señal a ruido de los datos Flim a expensas de que también aumenta el tiempo total de adquisición de datos FLIM. </li><li> Efectuar el registro de Flim de la placa de múltiples pocillos pulsando el botón &quot;Iniciar secuencia de HCA&quot;. </li></ol></li><li> Adquirir imagen de la cámara CCD de un fondo adicional al bloquear el láser de excitación (ver 2.11.7) con los ajustes de adquisición idénticos a los utilizados para la adquisición de datos Flim. </li></ol> 3. Análisis de Datos openFLIM-HCA Usando FLIMfit <ol><li> Compruebe que los archivos auxiliares necesarios para el análisis de datos Flim están presentes (es decir, la FIC y la medición de tinte de referencia). </li><li> Cargar los datos de la bien vacío (H1), el medio de pocillos que contiene la cultura (H2) y el pozo que contienen células no marcadas en medio de cultivo (H3) en FLIMfit( &quot;Archivo: Flim de datos de carga&quot;) para comprobar si existen contribuciones de fondo de más de 1% de la señal de las células que expresan el &quot;donante-only&quot;, es decir, en los pocillos A1-G3. </li><li> Preparar un archivo de fondo (TVB) variable en el tiempo mediante la carga del medio bien con la cultura en FLIMfit ( &quot;Archivo: Flim de datos de carga&quot;). Cargar los datos de fondo de la cámara adquiridos en la sección 2.14 ( &quot;Antecedentes: La carga de fondo&quot;) y el uso de las &quot;Herramientas: Crear TVB Intensidad mapa&quot; FLIMfit para generar el TVB. Véase la referencia 31 para más detalles sobre la TVB. </li><li> Preparar la variación espacial IRF cambio de carta mediante la carga de los datos adquiridos IRF en la sección 2.11 y restar el fondo de la cámara CCD adquirida en la sección 2.11.7. Utilice la opción &quot;Herramientas FLIMfit: Crear IRF cambio de carta&quot; para calcular la variación espacial IRF cambio de mapa. Véase la referencia [31] para más detalles sobre el cambio de carta IRF. </li><li> Montar un monoexponendecaimiento cial a los datos de referencia de tinte adquiridos en la sección 2.12. Tinte de carga de referencia y la Hoja de IRF espacialmente variable calculada en la sección 3.4, establecer los parámetros de ajuste ( &quot;Vida útil: Nº Exp: 1&quot;) con t 0 conjunto como parámetro equipada ( &quot;Vida útil: FIT Shift IRF: Equipada&quot;). Se informa a continuación, el valor de t 0 obtenido en la tabla mostrada en la pestaña &quot;Parámetros&quot;. </li><li> Analizar los datos Flim cargando los datos Flim experimentales adquiridos en la sección 2.13, la variación espacial IRF Mapa calculado en el apartado 3.4, el fondo de la cámara adquirida en la sección 2.14, el archivo TVB preparado en el apartado 3.3 y escriba el valor negativo de t 0 obtenida en el apartado 3.5 ( &quot;IRF: IRF turno: t = 0&quot;). A continuación, ajustar los datos experimentales en el modelo de decaimiento deseado usando FLIMfit 36 de acuerdo con los requisitos del experimento. </li></ol>

The authors have nothing to disclose. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Hemos descrito un microscopio placa de múltiples pocillos automatizado diseñado para el uso de HCA Flim-tiempo cerrada. Este instrumento se controla mediante el software de código abierto escrito en μManager con la opción de guardar los datos en un servidor de OMERO y el análisis de datos Flim está llevando a cabo utilizando FLIMfit 36, un programa de código abierto escrito en MATLAB y disponible como un cliente de OMERO 32 El instrumento μManager software de control, openFLIM-HCA, está disponible en línea 33 con una lista de los componentes del sistema 48 para permitir a los investigadores académicos para construir sus propios instrumentos Flim HCA. Con el fin de adquirir los datos Flim robustas, es necesario optimizar la configuración de adquisición GOI y CCD y para tener en cuenta cualquier variación en t = 0. Como se describe en 3.8.2, el ajuste de ganancia y la cámara CCD tiempo de integración GOI debe establecerse para alcanzar ~ 75% de la gama dinámica CCD. Tcantar más altos voltajes GOI y múltiples acumulaciones marco del CCD en cada retardo puerta del tiempo aumenta la relación señal-ruido de 49, pero esto aumenta el tiempo total de adquisición Flim (ya que un menor número de fotones de fluorescencia se adquieren por trama antes de que los ácidos grasos saturados de cámaras CCD y por lo que el número de acumulaciones de trama debe aumentarse) y por lo que este equilibrio debe decidirse para cada experimento. La calibración del generador de retardo depende de la tasa de repetición del láser y por lo tanto es necesario asegurarse de que el archivo de calibración correcta para la tasa de repetición utilizado se carga en el software de adquisición. El procedimiento para calibrar el cuadro de retardo se puede encontrar en la openFLIM-HCA wiki de 33. Si la autofluorescencia celular es baja en comparación con la señal de fluorescencia, se utiliza la señal procedente de un medio de cultura de la equidad también contiene proporcionar los antecedentes variable en el tiempo (TVB). Para minimizar la fluorescencia de fondo del medio de cultivo celular, evitamosmedios que contienen fenol rojo. Si la autofluorescencia celular es significativa, entonces el TVB se puede derivar de las mediciones de las células no marcadas. Sin embargo, en este caso se debe tener cuidado, ya que esto supone que el fondo de autofluorescencia es el mismo para cada píxel de la imagen. Este supuesto no será válido si la autofluorescencia varía significativamente a través de una celda o si el haz de excitación o la sensibilidad de detección no es uniforme en todo el campo de visión. La adquisición de una imagen IRF usando dispersos pulsos de luz de excitación proporciona el perfil IRF temporal que se convoluciona con el modelo de datos en el proceso de ajuste y también proporciona un mapa de la variación espacial de la IRF a través del campo de visión. El IRF se puede medir por la formación de imágenes de una muestra de dispersión tal como una suspensión coloidal aunque, en nuestro instrumento, usando luz de excitación dispersada desde el disco Nipkow proporciona una medición más limpio de la IRF. La determinación precisa del tiempo of el IRF es importante porque los errores en el retardo de tiempo entre la excitación y el tiempo-gating pueden afectar significativamente el proceso de adaptación, en particular en el montaje de los modelos de decaimiento exponencial compleja. La IRF adquirió usando luz de excitación dispersa no es exactamente lo que se necesita para el proceso de adaptación, ya que se registra en la longitud de onda de excitación en lugar de a la longitud de onda de emisión de fluorescencia, lo que puede afectar a su tiempo, a pesar de la variación espacial de la IRF debe ser el mismo en ambas longitudes de onda. Además, el IRF dispersa puede ser desplazada a nivel mundial en el tiempo en relación con la verdadera IRF debido a una longitud de trayectoria óptica diferente de la dispersión de objeto, como es el caso de un IRF adquirido desde el disco Nipkow en FLIM ópticamente seccionada. Esta corrección, t 0, que es el cambio temporal global necesaria que se debe aplicar a la IRF luz de excitación dispersa adquirida, se calcula a partir de los datos de colorante de referencia monoexponenciales como se indica en Protocol paso 4.4. Los siguientes colorantes se pueden utilizar para diferentes longitudes de onda de excitación: una cumarina 153 solución 75 M en metanol (τ ~ 4,3 ns 50) puede ser utilizado para la excitación en el intervalo de 295-442 nm; un 6 solución 75 M de cumarina en etanol (t ~ 2,43 ns 37) se pueden utilizar para la excitación en el intervalo de 430-500 nm; y un 75 mM solución de rodamina B en agua (τ ~ 1,7 ns 37) puede ser utilizado para la excitación en el intervalo de 488-575 nm. Observamos que, aunque es posible en FLIMfit utilizar un IRF diferente para cada pixel del sistema, por lo general es razonable hacer la hipótesis de que el IRF espacialmente variable tiene el mismo perfil temporal para cada pixel en la imagen, pero presenta una gama de espacialmente variable desplazamientos temporales relativos a la T Global 0. Se describe esto como el mapa de cambio de la FIC, que se determina a partir de la IRF luz dispersada. En conjunto, el perfil de la FIC, t 0 y el mapa de cambio de IRF se utilizan para bañoasegurarse de que cada píxel en el campo de visión está equipado con un IRF apropiado. Es importante destacar que, t 0 puede variar lentamente con el tiempo por lo que se debe medir antes de cualquier adquisición de datos Flim. El usuario debe decidir cómo muestrear los perfiles de decaimiento de fluorescencia y se requiere para establecer el ancho de las puertas de tiempo y sus retardos relativos después de la excitación. En general, es deseable utilizar anchos de puerta amplios para maximizar la señal detectada y por lo general nos utilizar anchos de puerta establecidas a 4 ns para Flim de células marcadas con proteínas fluorescentes. El número de retrasos puerta del tiempo debe ser suficiente para probar el perfil de desintegración fluorescente (incluyendo una puerta configurar para medir la señal justo antes del pulso de excitación) dada la complejidad del modelo de ajuste que será utilizado en el análisis. El valor óptimo puede depender de los tiempos de vida y las amplitudes relativas de los componentes de desintegración. En general, las 4 puertas son suficientes para monoexponencial apropiado decae mientras que 7 o más puertas puedenser utilizado para los modelos de desintegración más complejas. Observamos que Flim se puede implementar utilizando una serie de técnicas de dominio de tiempo o dominio de la frecuencia y automatizado HCA Flim de matrices placa de múltiples pocillos se implementó por primera vez en una lista (no seccionamiento) microscopio de campo amplio uso de las lecturas de toda la vida dominio de la frecuencia de FRET 51. Se informó entonces el primer lector de placas de múltiples pocillos óptica seccionamiento Flim automatizado para la utilización de HCA en todo el campo de la imagen-tiempo cerrada 28. Posteriormente, se aplicó en todo el campo (no seccionamiento) dominio de la frecuencia Flim HCA para detectar translacional modificaciones de correos (de fosforilación de la tirosina) a través de una biblioteca de genes utilizando FRET 52 y HCA Flim tiempo-dependientes se ha aplicado a los ensayos de FRET de VIH-1 Gag oligomerización 53 y de Sumoylation de FOXM1 54 y de Raichu RhoA y Rac1 biosensores 33. También es posible utilizar TCSPC para múltiples pocillos FLIM placa 26 pero hasta la fecha ha resultado difícil para que coincida con tque el rendimiento de las técnicas que explotan la detección de campo amplio. Un enfoque emergente que podría abordar este problema es el uso de conjuntos de detectores recuento de fotones individuales, tales como matrices SPAD 55. Observamos que las lecturas de FRET utilizando proteínas fluorescentes deben ser tratados con precaución y que los valores absolutos de los parámetros obtenidos a partir de FLIMfit o cualquier otro software de análisis Flim dependerá de los supuestos asociados con el modelo apropiado. Por ejemplo, cuando el donante de FRET tiene una segunda componente significativo decaimiento, el uso de un modelo biexponencial para ajustar los datos de FRET Flim puede resultar en la contribución de la componente de decaimiento rápido, típicamente asociado con la población FRETing que aparece más alto de lo que debería. Por tanto, es deseable utilizar los donantes con una vida útil mono-exponencial como mTq2FP. Incluso entonces, los estudios recientes han demostrado que el análisis FRET todavía puede verse afectada por estados oscuros de proteínas de fluorescencia aceptor o porheterogeneidad del factor de orientación κ 2 debido a una distribución de conformaciones fluoróforo con una variedad de ángulos y distancias cromóforos 56. Sin embargo, nosotros y otros han demostrado que las lecturas de vida de la fluorescencia de FRET sí producen resultados útiles que se correlacionan con las mediciones bioquímicas y pueden ser utilizados para la detección de interacciones de proteínas o para seguir la dinámica de biosensores. Por lo tanto esta plataforma HCA openFLIM se puede aplicar a una amplia gama de ensayos basados en vida de fluorescencia utilizando FRET o autofluorescencia celular 8, así como que proporcionan lecturas cuantitativas de sondas basadas en colorantes 25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="549">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">microscope frame&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">IX81</td>
			<td style="width:101px;">&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">optical autofocus</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">ZDC</td>
			<td>&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">motorized (x-y-z) microscope stage</td>
			<td style="width:64px;">Marzhauser</td>
			<td style="width:64px;">00-24-565-0000</td>
			<td>Stage with Corvus controlle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">excitation laser source</td>
			<td style="width:64px;">Fianium</td>
			<td style="width:64px;">SC400-4</td>
			<td>Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:320px;">gated optical intensifier&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">High Rate Imager (HRI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">delay generators</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>See agile delay generator and precision delay generator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">camera</td>
			<td style="width:64px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:64px;">ORCA-ER-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Nipkow disc scanner unit&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:64px;">CSU-X1&#160;</td>
			<td>http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Top hat diffuser</td>
			<td style="width:64px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:64px;">ED1-S20-MD</td>
			<td>Engineered diffusers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5V&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3850</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq17V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3847</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq32V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3848</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5A</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3849</td>
			<td>mTurquoise Amber construct</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">HEK293T</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>cell type used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">phenol red-free HBSS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>55021C-1000ML</td>
			<td>imaging media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">culture media</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td>DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">DMEM</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">FBS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">xTremeGene9</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>6.37E+09</td>
			<td>for transfection, follow online protocol from La Roche</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">trypsin/EDTA Solution</td>
			<td style="width:64px;">Thermo Fischer</td>
			<td style="width:64px;">R001100</td>
			<td>for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

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Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Se presenta un alto contenido de código abierto instrumento de análisis (HCA) que utiliza imágenes de vida de fluorescencia automatizado (Flim) para ensayar las interacciones proteína utilizando Förster transferencia de energía resonante (FRET) lecturas basadas. La adquisición de datos para este instrumento openFLIM-HCA es controlado por el software escrito en μManager y se lleva a cabo el análisis de datos en FLIMfit.

Open Source de análisis de contenidos de alta Utilizando microscopía de fluorescencia automatizado de imágenes por vida

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

A neuronales y astrocitos Co-cultivo de ensayo para el análisis de alto contenido de neurotoxicidad

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Investigación

Biología

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imágenes C. elegans Los embriones utilizando un microscopio de epifluorescencia y software de código abierto

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Análisis rápido y exploración de microscopía de fluorescencia de Imágenes

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Imaging semi-automatizado de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem congelación de alta presión y la rápida congelación de sustitución de tejidos vegetales para Microscopía Electrónica de Transmisión

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Flujo de trabajo para de alto contenido, cuantificación de la célula individual de marcadores fluorescentes de Universal Microscopio de datos, apoyados por software de fuente abierta

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

El seguimiento y cuantificación de los procesos de desarrollo en<em&gt; C. elegans</em&gt; Uso de las herramientas de código abierto

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Perfilado Redox Celular Utilizando Microscopía de Alto Contenido

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Análisis de una sola partícula de código abierto para el Super-resolución Microscopía con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...