Name: open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy
Uploaded: 2017-01-18T14:00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.

1. Framställning av flerkällsplatta Array <ol><li> Bered en lösning av 75 pM Kumarin 6 i etanol (x ~ 2,43 ns) för referensmätningar för att möjliggöra bestämning av t 0. </li><li> Seed 150.000 Cos-celler i fyra brunnar i en 6 brunnar och låt fästa över natten i odlingsmedium (se Materials List). </li><li> Transfektera en väl varje med mTq5A, mTq5V, mTq17V och mTq32V användning av ett kommersiellt transfektionsreagens enligt tillverkarens anvisningar och kultur under 24 timmar. </li><li> Lösgöra celler med användning av ett kommersiellt trypsin / EDTA-lösning enligt tillverkarens protokoll. </li><li> Pipette 5.000 Cos-celler suspenderade i Hanks balanserade saltlösning (HBSS) som uttrycker mTq5A in i var och en av brunnarna A1-G3 av en # 1,5 tjocklek glasbottnad 96 flerkällsplatta som tidigare har behandlats med poly-L-lysin. Upprepa för mTq5V uttryckande celler i brunnar A4-G6, mTq17V i brunnar A5-G9 och mTq32V i brunnar A10-G12. </li&gt; <li> Lämna väl H1 tom (för att ge mätning av statisk bakgrund från flerkällsplatta). </li><li> Pipettera 200 mikroliter av HBSS enbart till brunn H2 (för att åstadkomma mätning av någon bakgrundssignal från cellodlingsmediet). </li><li> Pipett 5000 icke-transfekterade celler i HBSS i väl H3 (för att ge mätning av någon bakgrundssignal från cell autofluorescens). </li><li> Pipettera 200 mikroliter av 75 iM Kumarin färglösning i väl H4 (för att ge en check på någon variant av t 0 under flerkällsplatta förvärv, till exempel på grund av förändringar i omgivningstemperaturen eller fluktuationer i laser eller tidskretsar. </li></ol> 2. openFLIM-HCA Data Acquisition OBS! Detaljerad information kan hittas på openFLIM-HCA wiki 33. <ol><li> Start μManager och OpenFLIM-HCA Plugin </li><li> Välj kalibreringsfilen för den specifika kombinationen av fördröjningsgeneratorenhet ochlaser repetitionshastighet under &quot;FLIM kontroll: Fördröjning box kalibreringsfilen: kalibreringsfiler&quot;. </li><li> Ställ den mapp där data sparas under &quot;File: Set Base mapp&quot;. </li><li> Kontrollera excitation strålens väg för att säkerställa att kopplingen i leveransen optiska fibern är stabil och att kopplingseffektiviteten maximeras genom att mäta kraften överförs genom leverans fiber med hjälp av en kraftmätare. Fluktuationer lägre än 5% är acceptabla. </li><li> Kontrollera att de indiska myndigheterna utlösande är stabil genom att visa signal skärmutgången på de indiska myndigheterna på ett oscilloskop utlöses av de indiska myndigheterna ingångstriggsignalen. </li><li> Kontrollera avbildning av de indiska myndigheterna fosfor på CCD-sensorn genom att täcka fotokatoden av de indiska myndigheterna, sätta sin vinst till 750 V och fokusera en relälinser så att bilder av glesa enda foton händelser (på grund av bakgrundsljus läcker även de indiska myndigheterna locket ) som spelats in på CCD är så skarp som möjligt. </li><li> Kontrollera att provetsynfält är jämnt belyst genom att avbilda en enhetlig fluorescerande prov, såsom en droppe av referensfärglösningen på en täck, med hjälp av en tillräckligt låg excitation effekt (&lt;1 ^ W) för att säkerställa att de indiska myndigheterna inte är mättad. </li><li> Välj lämplig plattan definitionsfilen, det vill säga, välj alternativ för 96-brunnsplattor ( &quot;Fil: lastskylt egenskaper&quot;). </li><li> Med hjälp av μManager GUI, se till att det inte finns någon dikroisk stråldelare kub i mikroskopstativet genom att välja en tom position. </li><li> manuellt välja en grind bredd 4 ns vid de indiska myndigheterna för hela experimentet. </li><li> Förvärva IRF bilddata: <ol><li> Med hjälp av μManager GUI, se till att det inte finns någon mikroskopobjektiv i strålgången genom att välja en tom position. Manuellt placera en svart anodiserat balk blocket ovanför målet torn för att förhindra laserljus fly och vinkel att minimera reflektion tillbaka in mikroskopstativet. </li> &lt;li&gt; Använda μManager GUI, ställa filtren i CSUX (Excitation, Dichroic, Emission), så att den del av exciteringsljus som sprids från den snurrande nipkowskiva kan avbildas men säkerställa intensiteten inte är tillräcklig för att mätta systemet för en 200 ms CCD integrationstid. Detta för att undvika att utsätta de indiska myndigheterna fotokatoden för mycket ljus, vilket kan skada fotokatoden. </li><li> Använd Sök maxpoint funktionen över hela skalan av förseningarna som omfattas av den programmerbara snabbfördröjnings rutan. Kontrollera utgångs diagram visas och sedan justera den manuella kursfördröjnings rutan genom att trycka på framåt knappen så att hela IRF profil är inom scanningsområdet för snabb fördröjnings rutan. </li><li> Justera förvärvsparametrar (neutral densitet, exponeringstid, bild ackumulering) så CCD inte är mättad i den ljusaste tid gate och effektiva integrationstiden är&gt; 200 ms. </li><li> Ställ fördröjningssteg av 25 ps över hela förseningen ringdee ( &quot;FLIM kontroll: Snabb fördröjning låda: Fylla förseningar&quot;). </li><li> Förvärvar IRF bild genom att trycka på &quot;Snap FLIM bild&quot;. </li><li> Skaffa en bakgrundsbild genom att blockera laser ( &quot;Ljus väg kontroll: Neutral densitet: blockerad&quot;), minska antalet förseningar ( &quot;FLIM kontroll: Snabb fördröjning låda: Aktuell fördröjningsinställningen (ps)&quot;), lämnar alla andra egenskaper oförändrade och tryck på &quot;Snap FLIM bild&quot;. </li></ol></li><li> Förvärva referens färgämne data: <ol><li> Välj väl H4 med hjälp av μManager GUI ( &quot;XYZ kontroll: Gå till väl: H4&quot;). </li><li> Använda μManager GUI väljer filter (excitation 434/17 nm, Dichroic, Emission 482/25 nm) för avbildning mTqFP. </li><li> Använd Sök maxpoint funktionen över hela skalan av den snabba fördröjnings rutan och sedan justera den grova fördröjnings rutan så full förfall profil är inom fördröjningsintervallet av den snabba fördröjnings rutan. </li><li> Ställa in en fördröjningtill punkten för maximal intensitet genom att ändra &quot;FLIM kontroll: Snabb fördröjning låda: Aktuell fördröjningsinställningen (ps)&quot;. Justera förvärvsparametrar (neutral densitet, exponeringstid) så att CCD inte är mättad. </li><li> Ställ fördröjningssteg av 25 ps över hela fördröjningsintervallet ( &quot;FLIM kontroll: Snabb fördröjning låda: Fylla förseningar). </li><li> Förvärva referens färgämnes data genom att trycka på &quot;Snap FLIM bild&quot;. </li><li> Skaffa en andra bakgrunds CCD kamerabilden genom att blockera excitation laser (se 2.11.7) </li></ol></li><li> Förvärva flim data för flerkällsplatta provet med hjälp av μManager förvärv programvara: <ol><li> Ange vilka brunnar bör avbildas och antalet FOV som skall förvärvas per brunn ( &quot;Setup HCA sekvenserat förvärv: XYZ positioner&quot;). </li><li> manuellt välja ett exemplar FOV innehållande det prov som skall avbildas. Använd denna FOV att bestämma den optimala filter med neutral densitet, gate bredd på de indiska myndigheterna ochintegrationstiden för kameran så att den når 75% av det dynamiska området för CCD-kameran. </li><li> Ställ autofokus ( &quot;XYZ kontroll: Autofokus&quot;): Tryck på &quot;Return fokus endast kontroll&quot;, och sedan manuellt fokusera på cellerna eller struktur av intresse. Ställ in &quot;Autofocus sökområdet&quot; till 2000 um och tryck på &quot;Enter&quot;. Tryck på &quot;AF nu&quot; för att inleda ett förfarande autofokus. Ett offsetvärde kommer att dyka upp i fältet &quot;FocusOffset (autofokus)&quot;. </li><li> Ange förskjutningsvärdet som erhållits i 2.13.3 i &quot;AF offset&quot; och upprepa autofokusförfarandet två gånger ( &quot;AF nu&quot;) för att kontrollera att förskjutningsvärdet är nu noll, vilket indikerar korrekt funktion av autofokussystemet. </li><li> Använd &quot;AutoGate&quot; -funktionen i OpenFLIM-HCA förvärv programvara för att välja en logaritmisk provtagning av fördröjningspunkter. Alternativt kan dessa väljas manuellt, se hänvisarENCE 36 för mer information. </li><li> Ställ in &quot;Accumulate Frames&quot; till ett värde som ger önskad total datainsamlingstiden. En ökning av antalet ackumulerade ramar ökar signal-brusförhållande av flim uppgifter på bekostnad av också öka den totala FLIM datainsamlingstiden. </li><li> Kör FLIM förvärv av flerkällsplatta genom att trycka på &quot;Start HCA sekvens&quot; -knappen. </li></ol></li><li> Förvärva ytterligare bakgrund CCD-kamera bild genom att blockera excitation laser (se 2.11.7) med identiska förvärvs inställningar som används för förvärvet flim uppgifter. </li></ol> 3. openFLIM-HCA dataanalys FLIMfit <ol><li> Kontrollera att nödvändiga tilläggs filer för FLIM dataanalys är närvarande (dvs. IRF och referensfärgmätning). </li><li> Läsa in data från den tomma brunnen (H1), brunnen innehållande odlingsmedium (H2) och de brunn innehållande omärkta celler i odlingsmedium (H3) i FLIMfit( &quot;Fil: Load FLIM data&quot;) för att kontrollera om det finns några bakgrunds bidrag större än 1% av signalen från celler som uttrycker &quot;donator-only&quot;, det vill säga, i brunnar A1-G3. </li><li> Förbered en tidsvarierande bakgrund (TVB) fil genom att ladda väl med odlingsmedium i FLIMfit ( &quot;Fil: Load FLIM data&quot;). Ladda kamera bakgrundsdata som förvärvats i avsnitt 2.14 ( &quot;Bakgrund: Last Bakgrund&quot;) och använda FLIMfit alternativet &quot;Verktyg: Skapa TVB Intensitet Karta&quot; för att generera TVB. Se referens 31 för mer information om TVB. </li><li> Förbered spatialt varierande IRF Shift Karta genom att ladda IRF data som samlats in i avsnitt 2.11 och subtrahera CCD-kameran bakgrund förvärvats i avsnitt 2.11.7. Använd FLIMfit alternativet &quot;Verktyg: Skapa IRF Shift karta&quot; för att beräkna spatialt varierande IRF Shift karta. Se referens [31] för mer information om IRF Shift Map. </li><li> Montera en monoexponential förfall till referensfärg data som samlats in i avsnitt 2.12. Lastreferens färgämnet och rumsligt varierande IRF Map beräknas i avsnitt 3.4, som passar parametrar ( &quot;Lifetime: Nej Exp: 1&quot;) med t 0 uppsättning som en monterad parameter ( &quot;Lifetime: FIT IRF Shift: Inbyggt&quot;). Värdet på t 0 erhållna sedan redovisas i tabellen på fliken &quot;Parameters&quot;. </li><li> Analysera flim uppgifter genom att läsa de experimentella flim data som samlats in i avsnitt 2.13, den rumsligt varierande IRF Map beräknas i avsnitt 3.4, kameran bakgrund förvärvats i avsnitt 2.14, TVB fil framställd i avsnitt 3.3 och skriv in det negativa värdet av t 0 erhålls i avsnitt 3.5 ( &quot;IRF: IRF shift: t 0&quot;). Montera sedan de experimentella data till önskad förfall modell med FLIMfit 36 i enlighet med kraven i experimentet. </li></ol>

The authors have nothing to disclose. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Vi har beskrivit en automatiserad flerkällsplatta mikroskop avsedd för HCA använder tidsspärrad FLIM. Detta instrument styrs med hjälp av programvara med öppen källkod skriven i μManager med möjlighet att spara data till en Omero server och analys flim uppgifter genomförs med hjälp av FLIMfit 36, ett open source program skrivet i Matlab och tillgänglig som en Omero klient 32 μManager instrument styrprogram, openFLIM-HCA, finns tillgänglig på nätet 33 med en förteckning över de systemkomponenter 48 för att möjliggöra akademiska forskare att konstruera sina egna FLIM HCA instrument. För att få robusta flim data är det nödvändigt att optimera förvärvsinställningar Indiens myndigheter och CCD och att ta hänsyn till eventuella variationer i t 0. Såsom beskrivits i 3.8.2 bör förstärkningsinställningen och CCD-kamera integrationstid GOI ställas in för att nå ~ 75% av CCD dynamiskt område. Usjunga högre GOI spänningar och flera CCD frame ansamlingar vid varje tidsgrindfördröjningen ökar signal-brusförhållandet 49 men detta ökar den totala FLIM uppsugningstiden (eftersom färre fluorescensfotoner förvärvas per ram före CCD-kameran mättade fettsyror och så antalet frame ansamlingar bör höjas) och så denna avvägning skall beslutas för varje experiment. Kalibreringen av fördröjningsgeneratorn beror på laserrepetitionshastighet och det är därför nödvändigt att säkerställa att den korrekta kalibreringsfilen för upprepningshastigheten som används laddas in i förvärv programvara. Proceduren för kalibrering av fördröjnings boxen kan hittas på den openFLIM-HCA wiki 33. Om den cellulära autofluorescens är låg jämfört med fluorescenssignalen, använder vi signalen från en brunn innehållande bara odlingsmedium för att tillhandahålla den tidsvarierande bakgrunden (TVB). För att minimera bakgrundsfluorescens från cellodlingsmediet, undviker vimedia innehållande fenolrött. Om den cellulära autofluorescens är betydande, då TVB kan härledas från mätningar av de omärkta cellerna. Men i detta fall måste man vara försiktig, eftersom detta förutsätter att autofluorescens bakgrunden är densamma för varje pixel i bilden. Detta antagande kommer inte att gälla om autofluorescens varierar avsevärt mellan en cell eller om exciteringsstrålen eller detekteringskänsligheten är inte likformig över synfältet. Förvärvet av en IRF bild med spridda excitation ljuspulser ger tids IRF profil som faltas med datamodellen i anpassningsprocessen och ger också en karta över den rumsliga variationen av IRF över synfältet. IRF kan mätas genom att avbilda en spridningsprov, såsom en kolloidal suspension även om, i vårt instrument, med användning av excitationsljus som sprids från den nipkowskiva ger en renare mätning av IRF. Noggrann bestämning av tidpunkten of IRF är viktigt eftersom fel i tidsfördröjningen mellan excitation och tidsgrind väsentligt kan påverka anpassningsprocessen, särskilt vid monteringen till komplexa exponentiella sönderfalls modeller. IRF förvärvats med hjälp spritt excitationsljus inte exakt vad som behövs för montering process eftersom det registreras vid excitationsvåglängden snarare än vid våglängden fluorescensemissions, som kan påverka dess timing, även om variationen i rummet av IRF bör vara densamma vid båda våglängderna. Dessutom kan den spridda IRF vara globalt skiftas i tid i förhållande till den verkliga IRF på grund av en skilda optisk våglängd från spridningsobjektet, vilket är fallet för en IRF förvärvats från nipkowskiva i optiskt genomskärning FLIM. Denna korrigering, t 0, vilket är den erforderliga globala tidsmässig förskjutning som ska appliceras på den förvärvade spritt excitationsljus IRF, beräknas från de monoexponentiell referensfärgämnesuppgifter såsom anges i Protocol steg 4,4. Följande färgämnen kan användas för olika exciteringsvåglängder: en 75 pM Kumarin 153-lösning i metanol (τ ~ 4,3 ns 50) kan användas för excitering inom intervallet 295-442 nm; en 75 pM Kumarin 6 lösning i etanol (x ~ 2,43 ns 37) kan användas för excitering inom intervallet 430-500 nm; och en 75 | iM rodamin B-lösning i vatten (τ ~ 1,7 ns 37) kan användas för excitering inom intervallet 488-575 nm. Vi noterar att, även om det är möjligt i FLIMfit att använda en annan IRF för varje bildpunkt i systemet, är det oftast rimligt att göra antagandet att spatiellt varierande IRF har samma temporal profil för varje pixel i bilden men utgör ett intervall spatiellt varierande tidsförskjutningar i förhållande till den globala t 0. Vi beskriver detta som IRF skiftkartan, som bestäms från spritt ljus IRF. Tillsammans är IRF profil, t 0 och IRF skift kartan som används för att enSe till att varje pixel i synfältet är utrustad med en lämplig IRF. Viktigt kan t 0 variera långsamt över tiden så det bör mätas innan FLIM datainsamling. Användaren bör besluta hur man prov fluorescens sönderfallsprofiler och är skyldig att ställa in bredden på tidsportar och deras relativa fördröjningar efter excitation. I allmänhet, är det önskvärt att använda breda grindbredder för att maximera den detekterade signalen och typiskt vi använder grindbredder inställda på 4 ns för FLIM av celler märkta med fluorescensproteiner. Antalet tidsgrindfördröjningar bör vara tillräcklig för att ta prov på fluorescerande sönderfallsprofilen (inklusive en gate inställd för att mäta signalen precis innan excitationspulsen) tanke på komplexiteten i passande modell som kommer att användas i analysen. Det optimala värdet kan bero på de livstider och relativa amplituderna hos de sönderfallskomponenter. I allmänhet, 4 portar är tillräckliga för montering monoexponentiellt sönderfaller medan 7 eller fler portar kananvändas för mer komplexa sönderfalls modeller. Vi noterar att FLIM kan implementeras med hjälp av en rad tids eller frekvensdomänen teknik och automatiserad FLIM HCA av flerbrunnsplattgrupper infördes först i en (icke-sektionering) brett fält mikroskop med hjälp frekvensdomänen livstid avläsning av FRET 51. Den första automatiserade optiska sektione FLIM flerkällsplatta läsare för HCA utnyttjar brett fält tids gated imaging 28 därefter rapporterats. Därefter tillsattes brett fält (icke-sektionering) frekvensdomän FLIM HCA tillämpas för att screena för posttranslationella modifieringar (tyrosinfosforylering) över ett genbibliotek med användning av FRET 52 och tidsspärrad FLIM HCA har tillämpats på FRET-analyser av HIV-1 Gag oligomerisering 53 och av SUMOylation av FOXM1 54 och av Raichu RhoA och RAC1 biosensorer 33. Det är också möjligt att använda TCSPC för flerkällsplatta FLIM 26 men hittills har det visat sig svårt att matcha than genomströmning av tekniker som utnyttjar brett fält upptäckt. En framväxande strategi som kan ta itu med denna fråga är användningen av uppsättningar av enstaka fotonräknande detektorer som SPAD arrayer 55. Vi noterar att eventuella avläsning av FRET med fluorescerande proteiner bör behandlas med försiktighet och att de absoluta värdena av parametrar som erhållits från FLIMfit eller någon annan FLIM analysprogram kommer att bero på de antaganden som är förknippade med passande modell. Till exempel, där FRET donator har en betydande andra sönderfallskomponent, kan användningen av en biexponentiell modell för att passa de FRET flim uppgifter resultera i bidraget från den snabbare sönderfallskomponenten, typiskt associerad med FRETing befolkningen uppträder högre än det borde. Det är därför önskvärt att använda givare med en mono-exponentiell livstid såsom mTq2FP. Även då har nya studier visat att FRET-analys fortfarande kan påverkas av mörka tillstånden hos acceptor fluorescensproteiner eller genomheterogenitet orienteringsfaktorn κ 2 på grund av en fördelning av fluoroforen konforma med en mängd olika kromofora vinklar och avstånd 56. Trots detta har vi och andra visat att fluorescenslivstid avläsning av FRET do producera användbara resultat som korrelerar med biokemiska mätningar och som kan användas för att screena för proteininteraktioner eller för att följa dynamiken i biosensorer. Sålunda denna openFLIM HCA plattform kan tillämpas på ett brett spektrum av fluorescenslivstid baserade analyser som utnyttjar FRET eller cellulär autofluorescens 8, samt att tillhandahålla kvantitativa avläsningar av färgbaserade prober 25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="549">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">microscope frame&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">IX81</td>
			<td style="width:101px;">&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">optical autofocus</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">ZDC</td>
			<td>&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">motorized (x-y-z) microscope stage</td>
			<td style="width:64px;">Marzhauser</td>
			<td style="width:64px;">00-24-565-0000</td>
			<td>Stage with Corvus controlle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">excitation laser source</td>
			<td style="width:64px;">Fianium</td>
			<td style="width:64px;">SC400-4</td>
			<td>Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:320px;">gated optical intensifier&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">High Rate Imager (HRI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">delay generators</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>See agile delay generator and precision delay generator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">camera</td>
			<td style="width:64px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:64px;">ORCA-ER-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Nipkow disc scanner unit&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:64px;">CSU-X1&#160;</td>
			<td>http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Top hat diffuser</td>
			<td style="width:64px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:64px;">ED1-S20-MD</td>
			<td>Engineered diffusers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5V&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3850</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq17V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3847</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq32V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3848</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5A</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3849</td>
			<td>mTurquoise Amber construct</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">HEK293T</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>cell type used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">phenol red-free HBSS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>55021C-1000ML</td>
			<td>imaging media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">culture media</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td>DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">DMEM</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">FBS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">xTremeGene9</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>6.37E+09</td>
			<td>for transfection, follow online protocol from La Roche</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">trypsin/EDTA Solution</td>
			<td style="width:64px;">Thermo Fischer</td>
			<td style="width:64px;">R001100</td>
			<td>for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

Watch this Scientific Journal Video about Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Vi presenterar en öppen källkod hög innehållsanalys (HCA) instrument som använder automatiserad fluorescens livstid avbildning (FLIM) för att analysera proteininteraktioner med hjälp av Förster resonans energiöverföring (FRET) -baserade avläsningar. Datainsamlingen för denna openFLIM-HCA instrument styrs av mjukvara skriven i μManager och dataanalys genomförs i FLIMfit.

Open Source Hög innehållsanalys Använda automatiserade fluorescens Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

En Neuronal och astrocyternas Co-Kultur-analys för High innehållsanalys av Neurotoxicitet

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse avbildning av Mitos Efter siRNA Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryon med en Epifluorescent Mikroskop och Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Snabb analys och utforskningen av fluorescensmikroskopi bilder

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Semi-automatisk avbildning av vävnad-specifika fluorescens i Zebrafish embryon

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Högtrycks Frysning och Quick Freeze Substitution av växtvävnad för transmissionselektronmikroskopi

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Arbetsflöde för hög halt, Individuell Cell Kvantifiering av fluorescerande markörer från Universal Mikroskop Data, som stöds av Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Spårning och kvantifiera utvecklingsprocesser i<em&gt; C. elegans</em&gt; Använda Open-source-verktyg

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Cellulär redoxprofilering med hög innehållsmikroskopi

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Öppen källkod Single-partikelanalys för Super högupplösande mikroskopering med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...