Name: open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy
Uploaded: 2017-01-18T14:00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.

Oyuklu bir plaka dizi hazırlanması 1. <ol><li> Referans ölçümleri t 0 tespitine imkan vermek için etanol içinde 75 uM Kumarin 6 (τ ~ 2.43 ns) çözeltisi hazırlayın. </li><li> Tohum 150,000 Cos 6 gözenekli bir plakada dört kuyu içine hücre ve kültür ortamında gece boyunca birleşmeye izin (Malzeme listesine bakınız). </li><li> mTq5A, mTq5V, mTq17V ve mTq32V 24 st için, üreticinin talimatlarına ve kültüre göre ticari bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak iyi her biri transfekte. </li><li> imalatçının protokolüne göre, ticari bir tripsin / EDTA çözeltisi kullanılarak hücreleri ayırmak. </li><li> Daha önce, poli-L-lizin ile muamele edilmiş bir # 1.5 kalınlığında cam tabanlı 96 çukurlu bir levhanın her bir çukuruna A1-G3 içine mTq5A ifade Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde süspansiyon haline Pipet 5000 COS hücreleri. mTq5V kuyular A4 G6 içine hücreleri ifade için tekrarlayın, kuyular A10-G12 içine kuyu A5-G9 ve mTq32V içine mTq17V. </li&gt; <li> Boş H1 (multiwell plaka herhangi statik bir arka plan ölçümü sağlamak için) iyi bırakın. </li><li> HBSS Pipet 200 uL sadece iyi H2 içine (hücre kültür ortamından herhangi bir arka plan sinyali ölçümleri yapmak için). </li><li> Pipet HBSS 5000 transfekte hücreler, H3 içerisine (hücresel otofloresansı gelen herhangi bir arka plan sinyali ölçümleri yapmak için). </li><li> Iyi H4 içine 75 uM Kumarin boya çözüm Pipet 200 uL (çevre sıcaklığındaki değişiklikler veya lazer veya zamanlama devresi dalgalanmalar, örneğin multiwell plaka alımı sırasında t 0 herhangi bir değişiklik bir kontrol sağlamak. </li></ol> 2. openFLIM-HCA Veri Toplama NOT: Ayrıntılı bilgi openFLIM-HCA wiki 33 bulunabileceği. <ol><li> Başlangıç μManager ve OpenFLIM-HCA Eklentisi </li><li> gecikme jeneratör ünitesi özel kombinasyonu için kalibrasyon dosyasını seçin ve&quot;: Gecikme kutu kalibrasyon dosyası: Kalibrasyon Dosyalar Flim kontrolü&quot; altında lazer tekrarlama oranı. </li><li> &quot;: Set Temel Klasör Dosyası&quot; veri altında kaydedileceği klasörü ayarlayın. </li><li> Teslimat fiber optik içine bağlantıyı sağlamak için uyarma ışın yolunu kontrol edin kararlı ve bağlanma verimliliği güç ölçer kullanılarak teslim fiberden geçirilen gücü ölçerek maksimize olduğunu. % 5 daha düşük dalgalanmalar kabul edilebilir. </li><li> tetikleme GOI GOI giriş tetikleme sinyali tarafından tetiklenen bir osiloskop Goa monitör çıkış sinyalini görüntüleyerek stabil olup olmadığını kontrol edin. </li><li> 750 V olan kazancını ayarlamak ve röle lensler birini odaklanarak, öyle ki GOI photocathode kaplayarak CCD sensör üzerine GOI fosfor görüntüleme kontrol GOI kapak olsa sızıntı nedeniyle arka plan ışığı seyrek tek foton olayların görüntüleri ( ) CCD üzerine kaydedilmiş mümkün olduğunca keskindir. </li><li> numune kontrol edinGörüş alanı eşit, bir lamel referans boya eriyiğinin bir damla olarak, düzgün bir floresan örnek görüntüleme GOI doymamış emin olmak için yeterince düşük bir uyarım gücü (&lt;1 uW) kullanılarak aydınlatılır. </li><li> Uygun plaka tanımlama dosyasını seçin, yani 96-kuyucuğu için seçme seçeneği ( &quot;Dosya: Yük Plakalı özellikleri&quot;). </li><li> ΜManager GUI kullanarak, boş bir pozisyon seçerek mikroskop çerçeve içinde hiçbir dikroik ışın ayırıcı küp olduğundan emin olun. </li><li> El ile tüm deney için Goa 4 ns kapı genişliğini seçin. </li><li> IRF görüntü verilerini elde: <ol><li> ΜManager GUI kullanarak, boş bir pozisyon seçerek ışın yolunda hiçbir mikroskop objektif olduğundan emin olun. El ile geri mikroskop çerçevesinin içine herhangi bir yansıma en aza indirmek için herhangi bir lazer ışığı önceleniminin ve açı önlemek için objektif taret üzerinde siyah bir anodize ışın blok yerleştirin. </li> &lt;li&gt; μManager GUI kullanarak, eğirme Nipkow diskten dağınık uyarma ışık fraksiyon görüntülü fakat yoğunluğu, 200 sistem doyurmak için yeterli olmadığından emin olabilir, öyle ki CSUX (eksitasyon, Dichroic, Emisyon) filtreler ayarlamak ms CCD entegrasyon süresi. Bu photocathode zarar verebilecek çok fazla ışık, için GOI photocathode maruz kalmasını önlemek için olduğunu. </li><li> Programlanabilir hızlı gecikme kutusunun kapsadığı gecikmeler tam aralığında Bul MaxPoint işlevini kullanın. Görüntülenen çıkış şemasını kontrol edin ve daha sonra tam IRF profilini hızlı gecikme kutusunun tarama aralığında olacak şekilde ileri tuşuna basarak manuel ders gecikme kutusunu ayarlayın. </li><li> Satın alma parametrelerini (Nötr yoğunluk, Pozlama süresi, Çerçeve birikmesi) bu yüzden CCD parlak zaman kapısı doymuş değildir ve etkili entegrasyon süresi&gt; 200 ms ayarlayın. </li><li> Tam gecikme yüzünden 25 ps Set gecikme adımları çaldıe ( &quot;Flim kontrolü: Hızlı gecikme kutusu: gecikmeleri doldurmak&quot;). </li><li> &quot;Yakala Flim görüntü&quot; tuşuna basarak IRF görüntü kazanır. </li><li> Lazer bloke ederek bir arka plan görüntüsü Edinme ( &quot;Işıklı kontrolü: Nötr yoğunluk: bloke&quot;), gecikmeler numarası ( &quot;Flim kontrolü: Hızlı gecikme kutusu: Cari gecikme ayarı (ps)&quot;) azaltarak, değişmeden tüm diğer özelliklerini bırakın ve basın &quot;Yakala Flim görüntü&quot;. </li></ol></li><li> referans boya veri elde: <ol><li> Iyi μManager GUI kullanarak H4 seçin ( &quot;XYZ kontrolü: iyi git: H4&quot;). </li><li> MTqFP görüntüleme için μManager GUI seçin filtreler (Uyarım 434/17 nm, dichroic, Emisyon 482/25 nm) kullanılarak. </li><li> Hızlı gecikme kutusunun tam aralığında Bul MaxPoint işlevini kullanın ve tam çürüme profili hızlı gecikme kutusunun gecikme aralığında böylece daha sonra kaba gecikme kutusunu ayarlayın. </li><li> gecikmesini ayarlayın&quot;: Hızlı gecikme kutusu: Cari gecikme ayarı (ps) Flim kontrolü&quot; değiştirerek maksimum yoğunluk noktasına. CCD doymuş olmayacak şekilde satın alma parametrelerini (Nötr yoğunluk, Pozlama süresi) ayarlayın. </li><li> Tam gecikme aralığında 25 ps ayarlanan gecikme aşamaları ( &quot;Flim kontrolü: Hızlı gecikme kutusu: gecikmeleri doldurmak). </li><li> &quot;Yakala Flim görüntü&quot; tuşuna basarak referans boya veri elde. </li><li> uyarma lazer bloke ederek ikinci bir arka plan CCD kamera görüntü elde (2.11.7 bakınız) </li></ol></li><li> ΜManager tedarik yazılımı kullanılarak multiwell plaka örnek Flim veri elde: <ol><li> Kuyular görüntülü olmalıdır set ve FOV sayısı kuyunun ( &quot;: XYZ pozisyonları Kur HCA sıralı edinme&quot;) başına elde edilecek. </li><li> El ile numuneyi içeren bir örnek FOV görüntülenmiş seçin. Goa optimal nötral yoğunluk filtresi, kapı genişliğini belirlemek için bu FOV kullanın veKameranın entegrasyon süresi CCD kamera dinamik aralığının% 75 ulaşacak şekilde. </li><li> Set otomatik odaklama ( &quot;XYZ kontrolü: Otomatik odak&quot;): Basın &quot;Return odak kontrolü sadece&quot; ve daha sonra elle hücrelerin veya ilgi yapısına odaklanmak. 2000 mikron ve &quot;Enter&quot; ile &quot;Otomatik odaklama arama aralığı&quot; olarak ayarlayın. Basın &quot;AF şimdi&quot; bir otofokus prosedürünü başlatmak için. Bir ofset değeri alanına &quot;FocusOffset (Otomatik odak)&quot; görünecektir. </li><li> Otofokus sisteminin doğru çalışmasını gösteren &quot;AF offset&quot; içine 2.13.3 elde edilen ofset değeri girin ve ofset değeri şimdi sıfır olduğunu kontrol etmek için ( &quot;AF artık&quot;) iki kez otofokus işlemi tekrarlayın. </li><li> Gecikme noktaları logaritmik örnekleme seçmek için OpenFLIM-HCA edinme yazılımında &quot;autogate&quot; işlevini kullanın. Alternatif olarak, bu elle seçilebilir, bkz bkzDaha fazla bilgi için 36 rüler. </li><li> Verimleri toplam veri toplama süresini arzu bir değere &quot;Accum Çerçeveler&quot; olarak ayarlayın. biriken kare sayısını arttırmak da artmaktadır toplam FLIM veri toplama zamanı pahasına FLIM veri sinyal gürültü oranını arttırır. </li><li> &quot;HCA dizisi başlat&quot; düğmesine basarak multiwell plaka Flim edinimini çalıştırın. </li></ol></li><li> Flim veri toplama için kullanıldığı gibi aynı alım ayarları ile uyarma lazer (2.11.7 bakınız) bloke ederek başka bir arka plan CCD kamera görüntü kazanır. </li></ol> 3. openFLIM-HCA Veri Analizi FLIMfit kullanılması <ol><li> Flim veri analizi için gerekli yardımcı dosyalar mevcut olup olmadığını kontrol edin (yani, IRF ve referans boya ölçümü). </li><li> Boş oyuk (H1) veri yüklemek iyi ihtiva eden kültür ortamı (H2) ve kültür ortamı içinde de ihtiva etiketlenmemiş hücreleri (H3) FLIMfit halinde( &quot;Dosya: Yük Flim verileri&quot;) kuyu A1-G3, yani &quot;donör sadece&quot; ifade eden hücrelerden daha büyük% 1 sinyalinin arka plan katkıları olup olmadığını kontrol etmek için. </li><li> ( &quot;: Yük Flim verileri Dosya&quot;) FLIMfit içine iyice kültürü ile orta yükleyerek bir zaman içinde değişen arka plan (TVB) dosyası hazırlayın. Bölüm 2.14 edinilen kamera arka plan verileri yüklemek ( &quot;Arka Plan: Yük Arka Plan&quot;) ve FLIMfit seçeneği &quot;Araçlar: TVB Şiddeti Harita oluştur&quot; kullanımı TVB oluşturmak için. TVB ilgili daha fazla ayrıntı için 31 başvuru bakın. </li><li> bölüm 2.11 edinilen IRF verilerini yükleyerek mekansal değişen IRF Shift Harita hazırlayın ve bölüm 2.11.7 edinilen CCD kamera arka plan çıkarın. FLIMfit seçeneği &quot;Araçlar: IRF oluştur Harita Shift&quot; kullanın mekansal IRF Harita Shift değişen hesaplamak için. IRF Shift Haritada daha fazla detay için referans [31] Bkz. </li><li> Bir monoexponen Fitbölüm 2.12 elde edilen referans boya verilerine tial çürüme. Yük referans boya ve bölüm 3.4 hesaplanan mekansal değişen IRF Haritası, set uygun parametreler ( &quot;Ömrü: Hayır Uzm: 1&quot;) ile donatılmış bir parametre olarak t 0 set ( &quot;Ömrü: FIT IRF Shift: Gömme&quot;). T elde 0 değeri daha sonra &quot;Parametreler&quot; sekmesinde gösterilen tabloda belirtilmiştir. </li><li> Bölüm 2.13 edinilen deneysel Flim verileri yükleyerek Flim verileri analiz, mekansal değişen IRF Harita bölüm 3.4 hesaplanan, bölüm 2.14 edinilen kamera arka plan, TVB dosyası elde t 0 negatif değer bölüm 3.3 ve tip olarak hazırlanan bölüm 3.5 ( &quot;IRF: IRF kayması: t 0&quot;). Daha sonra deney şartlarına göre FLIMfit 36 kullanarak istenen bozunma modeli deneysel verileri uygun. </li></ol>

The authors have nothing to disclose. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Biz zaman kapılı flim kullanarak HCA için tasarlanmış bir otomatik multiwell plaka mikroskobu tarif var. Bu alet FLIMfit 36, açık kaynak kodlu bir programı, bir omero istemcisi 32 μManager enstrüman olarak MatLab yazılmıştır ve mevcut kullanarak üstlenilen bir omero sunucusu ve Flim veri analizi için veri kaydetme seçeneği ile μManager yazılmış açık kaynak yazılımı kullanılarak kontrol edilir kontrol yazılımı, openFLIM-HCA, kendi Flim HCA aletleri oluşturmak için akademik araştırmacılar etkinleştirmek için sistem bileşenlerinin 48 bir liste ile 33 online olarak kullanılabilir. Sağlam Flim verileri elde etmek amacıyla, GOI ve CCD edinme ayarlarını optimize etmek için ve t 0 oluşabilecek değişiklikleri dikkate almak gerekmektedir. 3.8.2 açıklandığı gibi, GOI kazanç ayarı ve CCD kamera entegrasyon süresi ~ CCD dinamik aralık% 75 ulaşmak için ayarlanmalıdır. UHer zaman kapısı gecikme daha yüksek GOI gerilim ve çoklu CCD çerçeve birikimleri şarkı gürültü oranı 49 sinyal artırır ancak bu daha az floresan fotonlar CCD kamera Doymuş ve çerçeve birikimleri bu yüzden numarasından önce kare başına elde edilen bu yana toplam Flim toplama süresini (artar yükseltilmelidir) ve böylece bu değiş tokuş her bir deney için belirlenmelidir. Gecikme jeneratör kalibrasyon lazer tekrarlama oranı bağlıdır ve kullanılan tekrarlanma oranının doğru kalibrasyon dosyası elde etme yazılımı yüklenir sağlamak için gereklidir. Gecikme kutusu kalibre edilmesi için prosedür openFLIM-HCA wiki 33 bulunabilir. Hücresel otofloresan floresan sinyali ile karşılaştırıldığında düşük durumunda, zamana göre değişen bir arka plan (TVS) temin etmek üzere iyi olarak ihtiva eden, sadece kültür ortamından sinyali kullanılır. Hücre kültür ortamından arka floresan en aza indirmek için, bilmekfenol kırmızısı içeren medya. Hücresel otofloresansı önemli ise, TVS etiketlenmemiş hücrelerden ölçümlerinden elde edilebilir. Bu otofloresans arka plan görüntüdeki her piksel için aynı olduğunu varsayar Ancak, bu durumda bakım, alınmalıdır. otofloresans bir hücrenin üzerinde veya uyarma kiriş veya algılama hassasiyeti görüş alanı üzerinde üniforma değilse önemli ölçüde değişir, bu varsayım geçerli olmayacaktır. dağınık uyarma ışık darbeleri kullanarak bir IRF görüntüsünün elde edilmesi uydurma sürecinde veri modeli ile convolved olan zamansal IRF profili sağlar ve aynı zamanda görüş alanının karşısında IRF mekansal değişimi bir harita sağlar. IRF Nipkow diski IRF temiz bir ölçüm sağlar saçılan uyarma ışık kullanılarak, bizim enstrüman, bir koloidal süspansiyon, ancak bir saçılma örnek görüntüleme ile ölçülebilir. Zamanlama o doğru belirlenmesiuyarma ve zaman yolluk arasındaki zaman gecikmesi hataları önemli ölçüde uydurma sürecini etkileyebilir çünkü f IRF, önemli olan özellikle karmaşık üstel bozunma modelleri uydurma. IRF IRF uzaysal değişimini aynı olmalıdır, ancak zamanlaması etkileyebilir Bu uyarma dalga boyunda yerine floresans emisyon dalga boyunda kaydedildi için uygun işlem için gerekli olan tam olarak hangi dağınık uyarma ışık kullanılarak elde edilen Her iki dalga boyu. optik kesitli Flim içinde Nipkow diskten edilen IRF olduğu gibi ek olarak, dağınık IRF küresel nedeniyle saçılma nesneden farklılaşan optik yol uzunluğu gerçek IRF zaman göreceli olarak kaydırılmış olabilir. Protoc belirtildiği şekilde elde edilen dağılmış uyarım ışık IRF uygulanmalıdır gerekli genel zamansal kayması Bu düzeltme, t = 0,, monoexponential referans boya verilerinden hesaplanmaktadırol adımı 4.4. Aşağıdaki boya farklı uyarma dalga boyları için kullanılabilir: metanol içinde 75 uM Kumarin 153 çözeltisi (τ ~ 4.3 NS 50) aralığı 295-442 nm uyarım için kullanılabilir; etanol içinde 75 uM Kumarin 6 solüsyonu (τ ~ 2.43 ns 37) aralığı 430-500 nm uyarım için kullanılabilir; ve su içinde 75 uM Rodamin B çözeltisi (T ~ 1.7 NS 37) aralığı 488-575 nm eksitasyon için kullanılabilir. Sistemin her bir piksel için farklı bir IRF kullanmak FLIMfit mümkün olmasına rağmen biz, unutmayın, genellikle mekansal değişen IRF görüntüdeki her piksel için aynı zamansal profile sahip olduğu varsayımı yapmak makul ama bir dizi sunuyor uzamsal olarak küresel t 0 göreli zamansal uzaklıklar değişen. Biz dağınık ışık IRF belirlenir IRF vardiya haritası olarak bu tarif. Birlikte, IRF profili, t 0 ve IRF vardiya haritası tr için kullanılırFOV her piksel, uygun bir IRF ile donatılmış olduğundan emin olun. Herhangi bir Flim veri toplama öncesi ölçülmelidir yüzden önemlisi, t 0 zaman içinde yavaş yavaş değişebilir. Kullanıcı floresan çürüme profillerini örnek ve zaman kapıları ve uyarım sonrasında göreli gecikmeler genişliğini ayarlamak için gerekli nasıl karar vermelidir. Genel olarak, saptanan sinyali artırmak için geniş bir kapı genişliği kullanırlar ve tipik olarak biz floresan proteinleri ile etiketlenmiş hücrelerin Flim 4 ns ayarlı kapak genişliği kullanmak arzu edilir. Zaman kapısı gecikmeler sayısı analizinde kullanılacak montaj modelin karmaşıklığı verilen (sadece uyarma darbe öncesi sinyalini ölçmek için ayarlanmış bir kapısı dahil) floresan çürüme profilini örneklemek için yeterli olmalıdır. Optimum değer yaşam süreleri ve çürüme bileşenlerin bağıl genlikleri bağlı olabilir. Genel olarak, 4 kapıları bağlantı monoexponential için yeterli iken, 7 ya da daha fazla giriş kapıları olabilir bozunurDaha karmaşık çürüme modelleri için kullanılabilir. Biz Flim FRET 51 frekans ömrü okumalarını kullanarak geniş alan mikroskobu zaman domeni veya frekans alanı teknikleri bir dizi kullanarak uygulanabilir ve multiwell plaka dizileri otomatik Flim HCA ilk (non-kesit) uygulanmıştır unutmayın. Geniş alan zaman kapılı görüntüleme 28 kullanan HCA için ilk otomatik optik kesit Flim multiwell plaka okuyucu sonra bildirilmiştir. Daha sonra, geniş alan (non-kesit) frekans Flim HCA FRET 52 kullanılarak gen kütüphanesi ve zaman-kapılı Flim HCA karşısında post-translasyonel modifikasyonlar (tirozin fosforilasyonu) taramak için uygulanmıştır HIV-1 Gag ve deneyleri FRET uygulanmıştır oligomerizasyon 53 ve FOXM1 54 ve Raichu RhoA ve Rac1 biyosensörler 33 SUMOylation arasında. Çukurlu levha Flim 26 için değil, bugüne kadar, T eşleştirmek için zor olduğu kanıtlanmıştır TCSPC kullanmak da mümkündüro geniş alan algılama istismar teknikleri throughput. Bu sorunu gidermek olabilir biri gelişmekte olan yaklaşım, SPAD diziler 55 olarak tek foton sayma dedektörleri dizilerin kullanımıdır. Biz floresan proteinleri kullanarak FRET herhangi readouts uydurma modeli ile ilişkili varsayımlar bağlıdır FLIMfit veya başka herhangi bir Flim analiz yazılımı elde edilen parametrelerin mutlak değerler dikkatle ve tedavi edilmelidir olduğunu unutmayın. FRET donör önemli ikinci çürüme bileşeni vardır, örneğin, FRET Flim veri sığdırmak için bir bieksponensiyel modelinin kullanımı genellikle olması gerekenden daha FRETing nüfusu yüksek görünen ilişkili hızlı çürüme bileşenin katkısı, neden olabilir. Böyle mTq2FP bir mono- üstel ömrü olan vericilere kullanımı arzu edilmektedir. Hatta daha sonra, son çalışmalar FRET analizi hala alıcı floresan protein veya karanlık devletler tarafından etkilenmiş olabilir göstermiştirnedeniyle kromofor açılardan çeşitli florofor yapılardan bir dağıtım ve 2 κ oryantasyon faktörü heterojenite 56 mesafeler. Yine de, biz ve diğerleri FRET floresan ömrü readouts biyokimyasal ölçümleri ile korelasyon ve protein etkileşimleri için ekran veya biyosensörler dinamiklerini takip etmek için kullanılabilecek faydalı sonuçlar üretmek yapmak olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, bu openFLIM HCA platformu FRET veya hücresel otoflüoresanı 8 kullanılarak, hem de boya bazlı prob 25 kantitatif readouts sağlayan flüoresan süresi tabanlı tahlillerde geniş uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="549">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">microscope frame&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">IX81</td>
			<td style="width:101px;">&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">optical autofocus</td>
			<td style="width:64px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">ZDC</td>
			<td>&#160;http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">motorized (x-y-z) microscope stage</td>
			<td style="width:64px;">Marzhauser</td>
			<td style="width:64px;">00-24-565-0000</td>
			<td>Stage with Corvus controlle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">excitation laser source</td>
			<td style="width:64px;">Fianium</td>
			<td style="width:64px;">SC400-4</td>
			<td>Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:320px;">gated optical intensifier&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">High Rate Imager (HRI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">delay generators</td>
			<td style="width:64px;">Kentech</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>See agile delay generator and precision delay generator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">camera</td>
			<td style="width:64px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:64px;">ORCA-ER-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Nipkow disc scanner unit&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:64px;">CSU-X1&#160;</td>
			<td>http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Top hat diffuser</td>
			<td style="width:64px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:64px;">ED1-S20-MD</td>
			<td>Engineered diffusers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5V&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3850</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq17V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3847</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq32V</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3848</td>
			<td>mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">mTq5A</td>
			<td style="width:64px;">Oxford Genetics</td>
			<td style="width:64px;">P3849</td>
			<td>mTurquoise Amber construct</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">HEK293T</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td style="width:64px;">---</td>
			<td>cell type used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">phenol red-free HBSS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>55021C-1000ML</td>
			<td>imaging media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">culture media</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td>DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">DMEM</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">FBS</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C-500ML</td>
			<td>for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">xTremeGene9</td>
			<td style="width:64px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>6.37E+09</td>
			<td>for transfection, follow online protocol from La Roche</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">trypsin/EDTA Solution</td>
			<td style="width:64px;">Thermo Fischer</td>
			<td style="width:64px;">R001100</td>
			<td>for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

Watch this Scientific Journal Video about Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Biz Förster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı readouts kullanarak protein etkileşimleri tahlil için otomatik floresans ömrü görüntüleme (Flim) kullanan açık kaynak kodlu bir yüksek içerik analizi (HCA) aleti sunuyoruz. Bu openFLIM-HCA cihaz için veri toplama yazılımı μManager yazılır ve veri analizi FLIMfit üstlenilmiştir tarafından kontrol edilir.

Otomatik Flüoresans Ömrü Görüntüleme Mikroskopi kullanmak Open Source Yüksek İçerik Analizi

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebra balığı Embriyolar Doku spesifik Floresans yarı otomatik Görüntüleme

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Yüksek basınçlı Donma ve Transmisyon Elektron Mikroskobu için Bitki Doku Hızlı Dondurma Değişiklik

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Yüksek içerik, Open Source Software tarafından desteklenen Evrensel Mikroskop Verilerden Floresan Göstergeler, Bireysel Hücre Niceleme için iş akışı

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Gelişim Süreçleri İzleme ve nicel<em&gt; C. elegans</em&gt; Açık kaynak Araçlarını Kullanma

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Yüksek İçerikli Mikroskopi Kullanılarak Hücresel Redoks Profillemesi

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...