Name: a simple one-step dissection protocol for whole-mount preparation of adult drosophila brains
Uploaded: 2016-12-01T13:30:00
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Nós reconhecemos o Sr. Enes Mehmet, Ms. Kiara Andrade, Ms. Pilar Rodriguez, Chris Kwok, e Ms. Danna Ghafir por seu imenso apoio ao projeto.

1. soluções utilizadas para Brain Dissecção e imunofluorescência Coloração <ol><li> Dissecar a mosca adulta cérebros em fluido cerebrospinal artificial (aCSF): NaCl 119 mM, 26,2 mM de NaHCO3, 2,5 mM de KCl, 1 mM de NaH 2 PO 4, 1,3 mM de MgCl 2, e 10 mM de glucose. Antes da utilização, o gás aCSF com 5% de CO 2/95% de O 2 por 10 - 15 min e pico com 2,5 mM de CaCl2. Esterilizar a solução por filtração através de aCSF de um filtr...

<ol>
	<li>Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruit+flies+in+biomedical+research.">Fruit flies in biomedical research.</a> Genetics. 199, 639-653 (2015).</li><li>Bellen, H. 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T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+analysis+of+human+disease-associated+gene+sequences+in+Drosophila+melanogaster.">A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster.</a> Genome Res. 11, 1114-1125 (2001).</li><li>Yamagata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+dopamine+neurons+mediate+reward+signals+for+short-+and+long-term+memories.">Distinct dopamine neurons mediate reward signals for short- and long-term memories.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 578-583 (2015).</li><li>Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+tools+for+multicolor+stochastic+labeling+reveal+diverse+stereotyped+cell+arrangements+in+the+fly+visual+system.">Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 2967-2976 (2015).</li><li>Waddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Plasticity:+Dopamine+Tunes+the+Mushroom+Body+Output+Network.">Neural Plasticity: Dopamine Tunes the Mushroom Body Output Network.</a> Curr Biol. 26, 109-112 (2016).</li><li>Wolff, T., Iyer, N. A., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroarchitecture+and+neuroanatomy+of+the+Drosophila+central+complex:+A+GAL4-based+dissection+of+protocerebral+bridge+neurons+and+circuits.">Neuroarchitecture and neuroanatomy of the Drosophila central complex: A GAL4-based dissection of protocerebral bridge neurons and circuits.</a> J Comp Neurol. 523, 997-1037 (2015).</li><li>Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+adult+Drosophila+brains.">Dissection of adult Drosophila brains.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011, 1472-1474 (2011).</li><li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining.">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat Protoc. 1, 2110-2115 (2006).</li><li>Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight+different+types+of+dopaminergic+neurons+innervate+the+Drosophila+mushroom+body+neuropil:+anatomical+and+physiological+heterogeneity.">Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity.</a> Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).</li><li>White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopaminergic+system+in+the+aging+brain+of+Drosophila.">The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila.</a> Front Neurosci. 4, 205 (2010).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pathology+and+muscle+and+dopaminergic+neuron+degeneration+caused+by+inactivation+of+Drosophila+Pink1+is+rescued+by+Parkin.">Mitochondrial pathology and muscle and dopaminergic neuron degeneration caused by inactivation of Drosophila Pink1 is rescued by Parkin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10793-10798 (2006).</li><li>Greene, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pathology+and+apoptotic+muscle+degeneration+in+Drosophila+parkin+mutants.">Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4078-4083 (2003).</li><li>Whitworth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glutathione+S-transferase+activity+rescues+dopaminergic+neuron+loss+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8024-8029 (2005).</li><li>Pesah, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+parkin+mutants+have+decreased+mass+and+cell+size+and+increased+sensitivity+to+oxygen+radical+stress.">Drosophila parkin mutants have decreased mass and cell size and increased sensitivity to oxygen radical stress.</a> Development. 131, 2183-2194 (2004).</li><li>Trinh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decaffeinated+coffee+and+nicotine-free+tobacco+provide+neuroprotection+in+Drosophila+models+of+Parkinson's+disease+through+an+NRF2-dependent+mechanism.">Decaffeinated coffee and nicotine-free tobacco provide neuroprotection in Drosophila models of Parkinson's disease through an NRF2-dependent mechanism.</a> J Neurosci. 30, 5525-5532 (2010).</li><li>Kim, K., Kim, S. H., Kim, J., Kim, H., Yim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+s-transferase+omega+1+activity+is+sufficient+to+suppress+neurodegeneration+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson+disease.">Glutathione s-transferase omega 1 activity is sufficient to suppress neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson disease.</a> J Biol Chem. 287, 6628-6641 (2012).</li></ol>

Com um interesse crescente no uso adulto Drosophila cerebral para estudar doenças humanas cérebro, circuitos neuronais e as funções cerebrais superiores, é necessário o desenvolvimento de métodos simples e rápidos para obter cérebros da mosca intactas para as análises todo-mount, que é especialmente importante para grande- dimensionar telas baseadas no cérebro. Nosso método fornece uma maneira simples e fácil de aprender abordagem para dissecar uma cabeça mosca (muitas vezes em menos de 10 s com ...

O organismo modelo Drosophila, vulgarmente conhecida como a mosca da fruta, tem sido valorizado por suas ferramentas genéticas elegantes, tempos reprodutivos curtos e altamente conservadas vias moleculares e celulares. A mosca da fruta tem sido empregue com sucesso para dissecar as vias de sinalização de base, os mecanismos de padronização de organismos multicelulares, bem como os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento neuronal, funções e doenças 1,2. Com os recentes avanços em tecnologias de rotulagem de células e de imagem, o cérebro da mosca de fruta tornou-se especialmente poderosa in fine mapeamento dos circuitos neuronais e em dissecar a base molecular e celular das funções superiores do cérebro, tais como a aprendizagem ea memória, e ritmo circadiano 1,3, 4,5,6,7,8. Uma vantagem particular do sistema de Drosophila é o seu tamanho relativamente pequeno, permitindo que toda a montagem de preparação e análise do cérebro utilizando um composto regular ou microscópio confocal. This recurso permite análises detalhadas anatômicas e funcionais de circuitos neuronais, ou mesmo um único neurônio, em níveis celulares e subcelulares, no contexto de um tecido do cérebro inteiro, proporcionando assim uma visão holística do assunto estudado e sua geometria exata dentro do todo cérebro. No entanto, dado o tamanho diminuto em vez do cérebro, ela também apresenta um desafio técnico em dissecar de forma eficiente um tecido cerebral intacta fora do caso cabeça exoesqueleto de proteção em uma mosca adulta. Vários métodos de dissecação eficaz e relativamente simples têm sido descritos em pormenor, que geralmente envolvem cuidadosa e passo a passo de remoção do processo cabeça e os tecidos associados, incluindo os olhos, a traqueia, e gordura do cérebro correcta 9, 10. Estes métodos de dissecação microcirúrgicos muitas vezes colocam exigências bastante rigorosas sobre a qualidade do fórceps de dissecação, contando com uma pinça com pontas bem alinhadas finos que podem ser facilmente danificados. Além disso, como os cérebros dissecados são muitas vezes separated do resto do corpo, o cérebro pode ser facilmente perdido durante os processos de coloração e lavagem subsequente, devido às suas pequenas dimensões e a sua transparência no tampão de processamento. Aqui, descrevemos um protocolo de dissecção de uma etapa relativamente simples e fácil de aprender, por cérebros adultos que mantém os cérebros dissecados anexados ao tronco. O processo de dissecção muitas vezes facilmente afasta a maioria dos tecidos associada ao cérebro, tais como o olho e traquéia e reduz a demanda por uma pinça de dissecação de boa qualidade. Além disso, quando imagiologia do cérebro, ao microscópio composto fluorescente ou microscópio confocal, o lado do cérebro que está distante da fonte de luz fluorescente, muitas vezes produz um sinal mais fraco e menos imagens claras devido à espessura do cérebro inteiro de montagem. Aqui, nós também descrevem um método de montagem simples que permite um fácil inversão das amostras de cérebro, permitindo imagiologia conveniente de ambos os lados do cérebro com intensificação de sinal semelhantety e qualidade. Como uma prova de conceito para a aplicação do presente método para estudar o cérebro adulto, examinámos ainda mais a presença de neurónios DA no cérebro de moscas W 1118; um genótipo que é frequentemente utilizado como a linha parental para a geração de moscas transgénicas e o controlo de tipo selvagem, em muitos estudos de Drosophila.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1320">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:573px;">w*;&#160;park&#916;21/TM3,&#160;P{GAL4-Kr.C}DC2,&#160;P{UAS-GFP.S65T}DC10,&#160;Sb1</td>
			<td style="width:311px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:151px;">51652</td>
			<td style="width:287px;">Balancer was switched to TM6B</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">PBac{WH}parkf01950</td>
			<td>Exelixis at Harvard Medical School</td>
			<td>f01950</td>
			<td>Balancer was switched to TM6C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">NaCl</td>
			<td style="width:311px;">Fisher Scientific</td>
			<td>S640-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:573px;">Sodium Bicarbonate (NaHCO3)&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">02-003-990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:311px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:573px;">Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3)</td>
			<td style="width:311px;">Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:311px;">Fisher Scientific</td>
			<td>02-003-265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">D-Sorbitol</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876-500G</td>
			<td>Replaces glucose</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:573px;">Calcium chloride dihydrate (CaCl2)</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EMD Millipore&#160;Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22&#181; Pore Size</td>
			<td style="width:311px;">Fisher Scientific</td>
			<td>GVWP14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Formalin Solution, 10% (Histological)</td>
			<td style="width:311px;">Fisher Scientific</td>
			<td>SF98-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent</td>
			<td style="width:311px;">Fisher Scientific</td>
			<td>02-003-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Tween 20</td>
			<td style="width:311px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points</td>
			<td style="width:311px;">Fisher Scientific</td>
			<td>17-456-055</td>
			<td>Protocol does not require very fine points.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td style="width:151px;">P40101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Rat-Elav-7E8A10 anti-elav</td>
			<td>The Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>Clone 7E8A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td style="width:311px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">A-21247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td style="width:311px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">A-11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">DAPI Solution (1 mg/mL)</td>
			<td style="width:311px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propyl gallate powder</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3130-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Glycerol ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss Axioimager Z1</td>
			<td style="width:311px;">Zeiss</td>
			<td style="width:151px;">Quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Zeiss Apotome.2</td>
			<td style="width:311px;">Zeiss</td>
			<td style="width:151px;">Quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Zen lite software</td>
			<td style="width:311px;"></td>
			<td style="width:151px;">Quote</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple one-step dissection protocol for whole-mount preparation of adult drosophila brains

Há um interesse crescente na utilização de Drosophila para modelar doenças degenerativas do cérebro humano, mapa circuitos neuronais em cérebros adultos, e estudar a base molecular e celular de funções cerebrais superiores. A preparação de toda a montagem dos cérebros adultos com morfologia bem preservado é fundamental para tais estudos baseadas no cérebro inteiro, mas pode ser tecnicamente desafiadora e demorada. Este protocolo descreve uma abordagem dissecção um passo fácil de aprender, de uma cabeça de mosca adulta em menos de 10 s, ao mesmo tempo manter o cérebro intacto ligado ao resto do corpo para facilitar os passos de processamento subsequentes. O procedimento ajuda a remover a maior parte dos tecidos do olho e da traqueia, normalmente associadas com o cérebro que pode interferir com a imagiologia passo posterior, e também reduz a procura da qualidade do fórceps de dissecação. Além disso, descreve-se um método simples que permite a inversão conveniente das amostras de cérebro montados sobre uma lamela, o que é importante para imagiologia de ambos os lados da bchuvas com intensidade de sinal semelhante e qualidade. Como um exemplo do protocolo, apresentamos uma análise de neurônios dopaminérgicos (DA) em cérebros adultos de WT (w 1118) voa. A elevada eficácia do método de dissecação torna-o particularmente útil para estudos baseados no cérebro adulto em larga escala em Drosophila.

A Figura 1 ilustra os principais procedimentos de dissecação cérebro adulto, como descrito acima As Figuras 2 e 3 são imagens representativas de três dias de idade WT. (Genotipo: W 1118) mosca adulta cérebros que foram costained com um anticorpo contra a tirosina hidroxilase (TH , colorido a vermelho na Figura 2 e branco na Figura 3), um marcador comumente usado para rotular neu...

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A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

O adulto de Drosophila cérebro é um sistema valioso para estudar circuitos neuronais, funções cerebrais superiores, e doenças complexas. Um método eficiente para dissecar tecido do cérebro inteiro do cabeça pequena mosca facilitará estudos baseados em cerebrais. Aqui nós descrevemos um de uma etapa simples protocolo, dissecação de cérebros adultos com morfologia bem preservada.

Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

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Visualização do Sistema Nervoso embrionárias no Whole-mount Drosophila Os embriões

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Neurociência

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Dissecação de um olho do rato para um monte inteiro do epitélio pigmentar da retina

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Único Drosophila Dissection omatídeo e Imagem

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

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Preparação Monte todo o Adulto Drosophila Cordão nervoso ventral para injeção gigante de fibra Dye

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

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Reprodutível mouse esmagamento do nervo ciático e subsequente avaliação de Regeneração por Análise Whole Mount muscular

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DII-rotulagem de neurônios DRG para estudar em uma ramificação axonal Preparação Monte Whole of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

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Dissecção e imunohistoquímica de larvas, pupa e adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinas

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Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

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Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

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Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

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Monte todo Dissecção e Imunofluorescência do mouse cóclea Adulto

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...