Name: legionella pneumophila outer membrane vesicles: isolation and analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages
Uploaded: 2017-02-22T13:00:00
Duration: 8 min 34 s
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우리는 TLR2으로 우리를 제공하기위한 교수 마르쿠스 Schnare 감사합니다 - / -과 TLR2 / 4 - / - 마우스 및 TRIF /에서 MyD88에 대한 교수 카슨 Kirschning - / - 마우스. 이 작품의 일부가 Bundesministerium 대 Bildung 놀이 Forschung에 의해 투자되었다 (예 : 바이오 miRSys을 - FKZ 0316175B, 전자 : 메드 CAPSYS - FKZ 01X1304E, http://www.bmbf.de/), 독일 연구 협회를 (SFB / TR-84; http://www.sfb-tr84.de/), 및 Hessisches Ministerium 대 Wissenschaft 싶게 미술 (LOEWE 의료 RNomics - FKZ 519 / 03 / 00.001- (0003) http://www.proloewe.de/medicalrnomics) 모든 BS합니다.

1. 중간 및 한천 플레이트를 준비 <ol><li> 국물 매체 (YEB)의 1 L를 준비합니다. ACES 10 g을 증류수 900 ㎖의 효모 추출물 10g을 녹인다. KOH (5 N)과 6.9로 pH를 조정합니다. L 시스테인 및 Fe의 10 ㎖ (증류수 10ml에 0.4 g)의 10 mL를 넣고 (NO 3) 2 O 3 x9H (증류수 10ml에 0.25 g). 증류수 1 L까지 채우고 용액 (기공 크기 : 0.22 μm의) 살균 필터. 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 판 한천 버퍼 숯불 효모 추출물 (BCYE)를 준비합니다. ACES 10 g을 증류수 900 ㎖의 효모 추출물 10g을 녹인다. KOH (5 N)과 6.9로 pH를 조정합니다. 한천 15 g 및 활성탄 2.5 g을 추가합니다. 증류수와 오토 클레이브 1 L까지 입력합니다. <ol><li> 및 L- 시스테인 10ml의 추가 (10 ml의 증류수 0.4 g)의 10 ㎖의 Fe (NO 3) 2 O 3 x9H (증류수 10ml에 0.25 g, 여과에 의해 멸균 모두 0.22 ㎛의 관통냉각 BCYE (약 50 ° C)에 기공). 4 ° C에서 접시와 저장소를 따르십시오. </li></ol></li></ol> 2. L.의 뉴모 필라 육성 <ol><li> BCYE 아가 플레이트에 L. 뉴모 필라 변형 코비 (야생 형, WT)를 확산, 3 일 동안 37 ° C에서 그들을 품어. OD 예비 배양 플레이트에서 L.의 뉴모 필라 0.3의 600 YEB 10 mL를 접종; 6 시간 동안 회전 진탕 기 (150 RPM)에서 37 ° C에서 박테리아를 배양한다. </li><li> 혈액 한천 플레이트에 정지 100 μL을 확산하여 액체 문화의 순도를 확인합니다. 37 ℃에서 밤새 품어. </li><li> 신선한 YEB 매체의 90 mL의에 남아있는 액체 배양을 추가하고 약 16 ~ 20 시간을 취하는 OD 3.0-3.5의 600을, 도달하는 회전 진탕 기 (37 ° C와 150 RPM)에 품어. </li></ol> 3. 준비 및 L. 뉴모 필라 된 OMV 정량화 참고 : 다음 원심 분리 단계를 모두 수행합니다무균 조건에서 4 ° C에서의. <ol><li> 박테리아를 펠렛 20 분 동안 4,000 XG에서 액체 문화를 원심 분리기. 신선한 원심 분리기 튜브에 뜨는을 전송 세균 펠렛을 폐기하고, 원심 분리 (20 분 4,000 XG)를 반복합니다. 일단이 단계를 반복합니다. </li><li> 살균 필터 두번 뜨는 나머지 (기공 크기 : 0.22 μm의). 3 시간 동안 10 XG에 초원 심 분리기 튜브 및 초 원심 분리기에 박테리아가없는 뜨는을 전송합니다. </li><li> 뜨는을 가만히 따르다하고 폐기합니다. 오염 LPS 단백질을 제거 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)와 초 원심 분리기 (3 시간 동안 100,000 XG)의 OMV 펠렛을 재현 탁. </li><li> 뜨는을 취소하고 멸균 PBS 500 μL의 OMV 펠렛을 재현 탁. μL 혈액 한천 플레이트에와 BCYE 한천 플레이트에 킬 (20)는 제조 된 소포의 세균 오염을 제외합니다. 37 3 일 (모두 밤새 혈액 한천 플레이트와 BCYE 한천 플레이트를 인큐베이션6; C). </li><li> 제조자의 지시에 따라 bicinchoninic 산 분석법을 사용 OMV 제제로부터 얻은 단백질 량을 정량. 참고 : 100 ㎖ L.의 뉴모 필라 문화의 농도는 일반적으로 1 μg의 / μL이다. -20 ° C에서 준비하고 정량화 된 OMV를 저장합니다. </li></ol> 4. 사전 치료 식세포 <ol><li> THP-1 세포를 준비합니다. 주 : THP-1 백혈병 환자로부터 유래 된 단핵구 세포주이다. <ol><li> 24 웰 당 2 × 5 THP-1 세포에 첨가하고 대 식세포와 같은 세포에 20 ㎚의 포르 볼 12- 미리 스테이트 13- 아세테이트 (PMA)를 추가하여 그들을 구분할. 37 ° C에서 24 시간 동안 품어. </li><li> 새로운 매체의 500 μL와 매체를 교체하고 또 다른 24 시간 동안 배양; THP-1 세포에 대한 최적 배지를 10 % 소 태아 혈청이 보충 된 RPMI 1640 높은 글루코오스로 구성된다. </li></ol></li><li> 참조에서 설명 된 바와 같이, 뮤린 골수 유래 대 식세포 (mBMDM)를 격리20 줬어. </li><li> 된 OMV와 THP-1 유래 대 식세포 또는 mBMDM을 취급합니다. <ol><li> 단계 3에서 제조 된 OMV를 해동하고, 인간 또는 뮤린 대 식세포에 대한 이들 단백질 량 (0.1, 1 및 10 μg의 / ㎖)에 의한 추가. 적어도 20 시간 동안 37 ° C로 된 OMV와 대 식세포를 부화. ELISA의 상층 액을 사용하거나 5 단계로 이동합니다. </li></ol></li></ol> 5. 대 식세포를 감염 및 집락 형성 단위 (CFU) 분석과 세균 복제 평가 <ol><li> 단계 2.1에서 L.의 뉴모 필라를 사용 단계 4.3에서 THP-1 세포 또는 mBMDM을 사전 처리 및 컨트롤 (2 × 24분의 5 우물)로 대 식세포를 전처리하지. 매체를 교환하지 마십시오. </li><li> L. 뉴모 필라 코비의 플라 젤린-부족 돌연변이와 L. 뉴모 필라 코비 WT 및 mBMDM와 THP-1 세포를 감염 (모두 감염의 다양성 0.5 (MOI)와, 1 × 5 L.의 뉴모 필라 / 24 우물), 24 부화 48 시간 각각. 보 준비제 L. 뉴모 필라 코비 (WT 또는 플라 젤린-부족 돌연변이) 단계 2.1에 설명 된대로. </li><li> 를 Lyse은 사포닌의 첨가에 의해 그들의 배지에서 세포 (최종 농도 0.1 %)과 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 피펫으로 세균을 재현 탁하고, 반응 용기에 상기 현탁액을 전송. 멸균 PBS에서 미디어를 함유 L.의 뉴모 필라의 연속 희석을 준비합니다. </li><li> 킬 BCYE 아가 플레이트에 필요한 희석액 50 μL, 37 ℃에서 3 일간 배양한다. </li><li> 시각적으로 형성된 식민지를 계산합니다. CFU를 계산 <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/55146/55146eq1.jpg" /> 전처리하지만 100 %로 설정된다 마크로파지를 감염되지하는 CFU 카운트 결과를 정규화한다. </li></ol>

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Novartis.com Available from: <a target="_blank" href="https://www.novartis.com/news/media-releases/novartis-bexsero%C2%AE-vaccine-approved-fda-prevention-meningitis-b-leading-cause">https://www.novartis.com/news/media-releases/novartis-bexsero%C2%AE-vaccine-approved-fda-prevention-meningitis-b-leading-cause</a> (2016)</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

병원성 세균 및 표적 세포에서 이러한 막 소포 충격 된 OMV 현재 집중적으로 연구되고있다. 예를 들어, 클로스 트리 디움 퍼프 린 젠스가 된 OMV 식세포의 사이토 카인의 분비를 유도 - 유래, B 림프구 보렐리 burgdorferi에 발 된 OMV 활성화 및 헬리코박터 파이로리는 막 소포는 위 상피 세포 (21, 22), (23) 상에 작용할 수 -released 수있다. L.의 뉴모 필라, 비정형 폐렴의 심한 형태를 유도 할 수있는 세포 내 병원균은 또한 폐 상피 세포와 대 식세포 (16), (19)을 활성화 할 수 있습니다 된 OMV를 발표한다. 여기서는 폐렴 된 OMV의 잠재적 역할을 연구하는 배양액에서 L. 뉴모 된 OMV의 소규모 분리를위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 멸균 CONDIT에서 작동하는 것이 중요합니다이온 및 순수 L. 뉴모 필라를 얻기 위해 다른 세균으로부터의 오염을 배제하기는 OMV 준비 - 유래. 된 OMV의 분리 최대 된 OMV이 여과 공정에 의해 손실되기 때문에이 상기 OMV 수율을 감소시킨다하더라도, L. 뉴모 필라로 수득 OMV 펠릿의 오염을 방지하기 위해 0.22 ㎛의 세공을 통해 여과하는 단계를 포함한다. 또한, 우리는 더 밀접 된 OMV는 세포 외 박테리아 (15)에 의해 LCV 내부에 출시되는 레지오넬라 폐렴의 상황을 대략 그 고립 된 소포와 L.의 뉴모 필라에 감염된 세포에 인간과 쥐의 대 식세포의 반응을 테스트했다. 채용 된 OMV의 용량이 24 시간 배양 후 인간 대 식세포의 생체 외 감염에서 무료 OMV의 양에 따라 추정되었다 (참조 20에서 설명). 다른 수신자 세포의 자극이나 생체 내 실험에서,다른 OMV의 용량이 필요할 수 있습니다 설립해야합니다. L. 뉴모 된 OMV의 효과의 분석 및 예거 STEINERT (24)에 의해 기술 된 프로토콜의 발전을 나타낸다. 여기에, THP-1 세포에 의한 주 인간의 물질의 제한된 가용성 폐포 대 식세포에 대한 모델이 될 PMA 차별화. PMA의 첨가는 대 식세포 유사 세포 (25) 단핵구 THP-1 세포를 분화. 또한, 이들은 L. 뉴모위한 잘 알려진 모델 세포주 (26)을 연구한다. 이 인간 단핵 세포주 외에, mBMDM 세포가 사용됩니다. mBMDM 널리 L.의 뉴모 27, 28, 29의 효과에 대한 연구 허용됩니다. 다른 TLR에 다른 단백질 유전자 녹아웃 사용 가능성들을 OMV 효과를 연구하기위한 유용한 도구 만든다. ORD에서당 실험 쥐의 양을 낮추는 ER은 mBMDM 대신 식세포의 한계에 의한 폐포 대 식세포 사용된다. 주요 실험 검증을위한 폐포 대 식세포가 필요할 수 있습니다. 초 원심 분리의 본원에 기술 된 프로토콜 된 OMV를 정화 게다가, Chutkan 등에 의한 프로토콜에 포함되는 밀도 구배 원심 분리를 수행 할 수있다. 30. 이렇게 얻어진 OMV 제제의 순도를 향상 공동 정제 단백질 응집체, 편모 및 LPS의 양을 줄일 수있다. 얻어진 OMV 제제의 순도는 투과 전자 현미경에 의해 또는 품질 관리 부가 단계로 나노 입자 추적 분석에 의해 분석 될 수있다. 이것은 여기에 제시된 단백질 측정 절차 넘어 정량의 추가적인 수단을 제공 할 수있다. 선택적으로, LPS 농도가 물러의 amebocyte 파쇄 시험에 의해 분석 될 수있다. OMV 수율이 낮은 경우,원심 필터를 통해 추가 농축 단계는 여기에 완료되지 않은, 수행 될 수있다. 수율이 예상보다 낮았다하면 된 OMV는 폐기되었다. 된 OMV 뒤에 생물학적 메커니즘 및 기능을 규명하기위한 노력의 일환으로, OMV 생산에 다른 스트레스 조건의 영향을 시험 할 수있다. 영양 결핍은 유해 에이전트 배양 온도, 또는 노출의 변화는 OMV 분비 (31)에 영향을 미칠 수 있습니다. 가능한 스트레스 조건은 Klimentova 및 Stulik (32)에 의해 프로토콜에서 설명합니다. 또한, 하이퍼 또는 hypovesiculating L. 뉴모 변이체가 생성 될 수있다. 상이한 OMV 제제이어서, (참조 번호 17에 기재되어 있음), 인간 폐 조직 이식편, 또는 생체 내 모델에서 대 식세포 감염 실험에서 분석 될 수있다. 세균 통신에서의 영향 선천성 면역 신호에 된 OMV의 역할, 게다가실험적으로 해결 될 수있다. 또한, 다양한 선천성 면역 신호 전달 캐스케이드의 영향 뮤린 녹아웃 세포를 사용하는 인간 세포주 CRISPR / Cas9 녹아웃의 발생에 의해 분석 될 수있다. 된 OMV에이 기초 연구는 이미 나이 세리아의 meningitides (33)에 의해 전송 뇌막염 B 존재 새로운 백신 전략의 개발에 도움이 될 것입니다. OMV 분리 및 특성화의 프로토콜로부터 출발 한 다른 그람 음성균 및 다른 숙주 세포에이를 적용 할 수있다; 단지 액체 배양에서 세균의 성장을 조절할 필요가있다. Chutkan 등 알 발행 프로토콜. 대장균과 녹농균 (30)로부터 된 OMV의 생성에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 배양 용균 박테리아 오염의 증가 및 단백질 및 MEM을 피하기 위해 늦은 정지상 도달하지 않아야branes. 또한, 숙주 세포의 자극에 사용되는 OMV 도즈 여전히 독성의 낮은 속도를 유지하면서, 생체 내 감염 동안에 된 OMV 존재의 양에 따라 결정되어야한다. 이러한 방식으로 된 OMV의 병리학 적 역할은 잡종 통신 및 호스트 병원체 상호 작용에 미치는 영향을 조사 할 수있다. 또한 폐렴에 L. 뉴모 필라 된 OMV의 역할을 연구하기 위해, 충분한 수율과 비교 감염 실험과 표준화 된 OMV 준비가 필요하다. 이 프로토콜은 분리 절차를 표준화 및 기타 그람 음성균 및 다른 숙주 세포에 OMV 연구를 확장하는 데 도움이된다. 또한, 연구는 생체 내 실험 설정을 확장하는 데 사용할 수있는 시험 관내 기술에 대한 상세한 혜택 것이다. 앞으로,이 프로토콜은 혈청 또는 기관지 LAV 1 차 생물 재료 된 OMV의 분리로 확장 될 수있다나이 유체는 생리 학적 조건하에 발표 된 OMV의 구성에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이것은 OMV 조성물의 주요 파라미터를 결정하기 위해 시험 관내 -generated 된 OMV의 특성을 이해하는 것이 도움이 될 것이다.

<html> 박테리아는 다른 메커니즘을 통해 하나 독성 인자를 분비 할 수있다. 공지 분비 시스템 외에도, 그람 음성균은 정보를 교환 할 수 있고, 작은 외막 소체 (OMV), 타원체 소체 10-300 nm의 직경과 이중 층의 막 구조를 통하여 독성 인자를 제공한다. 이들은 성장 환경 (액체 배양, 고체 배양하고, 바이오 필름)의 다양한 모든 성장 단계 (2, 3)에 분비되어있다. 된 OMV는 중요한 교통 수단 (예를 들어, OMV의 표면에서 발견되는 단백질 adhesins 독소 및 효소뿐만 아니라 대한 LPS 용) 4. 관내화물은 단백질 가수 분해로부터 보호 그래서 장거리 행동 할 수 있으며, 소포는 체액과 원격 장기 (5, 6)에서 찾을 수있다&quot;외부 참조&quot;&gt; (7, 8). 그들은 단지 인식 진핵 세포 (9), (10)에 의해 흡수되지만 또한, 이들은 숙주 세포 (4) 내로 박테리아 및 내습의 결합을 용이하게 할 수있는 할 수 없다. 레지오넬라 뉴모 필라 (L. 뉴모 필라)이 된 OMV를 분리 할 수있는 그램 음성 박테리아이다. 인간의 폐에서는 주로 자연 호스트 민물 아메바 (11)이더라도, 폐포 마크로파지를 감염. L.의 뉴모 필라 감염은 레지오넬라 증, 폐렴 (12)의 심한 형태가 발생할 수 있습니다. 숙주 세포에이 블록 phagosome - 리소좀의 융합. 복제 틈새 레지오넬라 함유 액포 (LCV)이, 13, 14이 형성되어있다 또한, 숙주 세포 기관을 모집. 리소좀 분해뿐만 아니라 이펙터 단백질 TRA에 의해 억제된다타입 IV 분비 시스템으로, 또한 된 OMV (15)의 릴리스 nslocation. 세균 배양 물로부터의 정제 된 OMV를받는 세포에 미치는 영향을 분석 할 필요가있다. L. 뉴모 된 OMV의 단백질 함량 및 폐포 상피 세포 16 만, 인간의 폐 조직 이식과 이후 연구에서 소포의 영향에 집중 이전 연구 L. 뉴모 된 OMV가 폐포 대 식세포 (17)에 의해 흡수되는 것을 보여 주었다. 된 OMV 본 병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMPs가)와 다른 박테리아 항원, 그들은 진핵 세포의 감염에 영향을 호스트 (18) 면역 반응을 조절할 수있다. L. 뉴모 된 OMV 신속 또한 그들이 멤브레인 TLR2 활성화 (19), 숙주 세포의 막과 융합하고. 그것은 리스테리아 pneumoph 것으로 알려진 바와ILA 된 OMV가 염증성 방법 16 17 식세포 및 상피 세포를 자극하고, 우리는 인간 및 뮤린 대 식세포에 감염 과정에 대한 된 OMV의 영향을 분석 하였다. 여기서는 직접 또는 감염에 따라 차등 초 원심 분리에 의해 분비 된 OMV를 분리 및 진핵 숙주 세포의 소포체의 영향을 평가하기 위해 배양액에서 L. 뉴모 필라의 배양을위한 프로토콜을 기술한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1938">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 cm petridish</td>
			<td style="width:475px;">Sarstedt AG &#38; Co KG (Nuembrecht, Germany)</td>
			<td align="right" style="width:119px;">82.1473</td>
			<td style="width:1128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70 Ti rotor</td>
			<td style="width:475px;">Beckman Coulter Incorporation (California, USA)</td>
			<td align="right">337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACES</td>
			<td style="width:475px;">Carl Roth GmbH &#38; Co KG (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td align="right">9138.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">activated charcoal</td>
			<td style="width:475px;">Carl Roth GmbH &#38; Co KG (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td style="width:119px;">X865.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">agar-agar, Kobe I</td>
			<td style="width:475px;">Carl Roth GmbH &#38; Co KG (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td align="right">5210.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Columbia agar with 5 % sheep blood</td>
			<td style="width:475px;">Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany)</td>
			<td align="right" style="width:119px;">254005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cuvettes</td>
			<td style="width:475px;">Sarstedt AG &#38; Co KG (Nuembrecht, Germany)</td>
			<td align="right" style="width:119px;">67.742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ELISA (human)</td>
			<td style="width:475px;">BD OptEIA&#8482;; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany)</td>
			<td style="width:119px;">IL-8: 555244 IL-6: 550799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ELISA (murine)</td>
			<td style="width:475px;">DuoSet, R&#38;D (Minneapolis, USA)</td>
			<td style="width:119px;">CXCL1: DY453-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Fe(NO3)3x9H2O</td>
			<td style="width:475px;">Carl Roth GmbH &#38; Co KG (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td align="right">5632.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Heracell 240i CO2 incubator</td>
			<td style="width:475px;">Thermo Fisher Scientific Germany BV &#38; Co KG (Braunschweig, Germany)</td>
			<td align="right">40830469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heraeus Multifuge X3R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Germany BV &#38; Co KG (Braunschweig, Germany)</td>
			<td align="right">75004515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inoculation loop&#160;</td>
			<td style="width:475px;">Sarstedt AG &#38; Co KG (Nuembrecht, Germany)</td>
			<td style="width:119px;">86.1567.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KOH</td>
			<td style="width:475px;">Carl Roth GmbH &#38; Co KG (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6751.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L. pneumophila Corby</td>
			<td style="width:475px;">---</td>
			<td style="width:119px;">---</td>
			<td>kindly provided by Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Germany)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L. pneumophila Corby &#916;flaA</td>
			<td style="width:475px;">---</td>
			<td style="width:119px;">---</td>
			<td>kindly provided by Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlin, Germany)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-cystein</td>
			<td style="width:475px;">Carl Roth GmbH &#38; Co KG (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mBMDM</td>
			<td style="width:475px;">---</td>
			<td style="width:119px;">---</td>
			<td>kindly provided by Prof Dr Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Germany) and Prof Dr Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Germany)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td>Biochrom GmbH (Berlin, Germany)</td>
			<td>L 1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td style="width:475px;">Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">rotating shaker (MaxQ 6000)</td>
			<td style="width:475px;">Thermo Fisher Scientific Germany BV &#38; Co KG (Braunschweig, Germany)</td>
			<td>SHKE6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI 1640 high glucose</td>
			<td>Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">saponin</td>
			<td style="width:475px;">Carl Roth GmbH &#38; Co KG (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td align="right" style="width:119px;">9622.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultrospec 10</td>
			<td style="width:475px;">Biochrom Ltd (Cambridge, England)</td>
			<td style="width:119px;">80-2116-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sterile filter (pore size: 0.22 &#181;m)</td>
			<td style="width:475px;">Corning Incorporated (new York, USA)</td>
			<td align="right" style="width:119px;">431096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">THP-1</td>
			<td style="width:475px;">Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>88081201-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sorvall Discovery 100 SE</td>
			<td style="width:475px;">Thermo Fisher Scientific Germany BV &#38; Co KG (Braunschweig, Germany)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">yeast extract</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co KG (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td align="right">2363.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td style="width:475px;">Thermo Fisher Scientific Germany BV &#38; Co KG (Braunschweig, Germany)</td>
			<td align="right" style="width:119px;">23225</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

legionella pneumophila outer membrane vesicles: isolation and analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

실험 설치 L. 뉴모 된 OMV를 준비하고,도 1에 도시되어 감염 다음 식세포의 염증성 반응에 미치는 영향을 분석. 제조 된 OMV의 염증성 전위는도 2에 도시 PMA 분화 된 THP-1 세포를 분석 할 수있다. THP-1 세포는 IL-8 및 IL-6 분비의 시간 및 농도 의존적 ​​증가에 반응한다. 도 3의 CXCL1 ELISA에 의해 제시된 또한 L. 뉴모 OMV 인식에 다른 TLR에의 영향은 다른 유전 배경에서 mBMDM를 사용하여 분석 될 수있다. OMV 자극 후 CXCL1 분비 WT 생쥐에서 mBMDM 반면, mBMDM TLR2 / 4 - / - 훨씬 적게 분비. THP-1 대식 세포에서 세균 복제에 L. 뉴모 필라 된 OMV의 영향을 연구하기 위해, 세포 된 OMV와 미리 배양 한 후 추가로 감염L.의 뉴모 필라와 (그림 4 A). THP-1 유래의 대 식세포의 프리 - 자극에 먼저 감염 24 시간 후, 세균 복제를 감소하지만, 이후 시점 (48 시간 PI)에서 CFU 카운트의 두 배에 이르게. 도 4 B에 제시된 바와 같이 대 식세포의 감염 다음 OMV 인식 시그널링 수신자 같은 수용체 (TLR)의 영향은, mBMDM 의해 평가 될 수있다. 세포는 L.의 뉴모 필라 복제의 증가를 표시하지 않습니다 - / - - 그리고 TRIF /에서 MyD88 - / TLR2 동안 OMV 사전 배양 후 WT 동물에서 mBMDM의 열배에 의해 세균 복제 증가. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig1.jpg" /> 그림 1 : 실험 절차. (A) L. 뉴모 코비 WT 10-cm BCYE 한천 플레이트 신선한 YEB 90 ㎖ 중에 전송되는 작은 배양액 (10 ㎖)를 접종하는데 사용된다로부터6 시간 후 매체. 소량은 순도를 확인하기 위해 혈액 한천 플레이트 상에 플레이 팅된다. 박테리아는 초기 정지상 (= 3.0-3.5 OD 600)까지 37 ° C에서 배양한다. (B) 배양액을 원심 분리하고, 세균을 제거하기 위해 멸균 여과 하였다. 레지오넬라 -free 상등액을 다시 ultracentrifuged PBS에 재현 탁시키고되는 OMV 펠릿을 얻었다 ultracentrifuged된다. 격리 소체는 순도 확인, 재현 탁하고, 단백질 양을 정량한다. 스케일 바는 2.5 cm를 나타냅니다. (C) 인간이나 쥐의 대 식세포는 정량화 된 OMV로 자극한다. 세포 배양 상등액을 ELISA에 이용 될 수 있거나, 대 식세포는 10 cm BCYE 한천 플레이트 상 CFU 분석으로 세균 복제를 결정 L. 뉴모 필라에 감염 될 수있다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> </A&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig2.jpg" /> 그림 2 : L. 뉴모 필라 된 OMV에 의해 THP-1 세포의 염증성 활성화. (A) 여기에서, THP-1 단핵구 세포주 폐포 대 식세포에 대한 모델로서 사용된다. PMA 분화 된 THP-1 세포를 각각 24, 48 시간 동안 L. 뉴모 된 OMV (0.01-25 μg의 / ㎖)의 투여 량 증가와 함께 처리 하였다. 무 세포 상청액은 IL-8 ELISA에 사용 하였다. SEM ± 3 개의 독립적 인 실험의 평균 값이 표시됩니다. THP-1 세포는 시간과 용량 의존적이었다 중요한 IL-8 분비와 같은 작은 0.01 μg의 / mL의 L. 뉴모 필라 된 OMV에 반응했다. (B) L. 뉴모 된 OMV (0.1 μg의 / ㎖) PMA 분화 된 THP-1 세포를 자극하는 데 사용 하였다. 배양 상등액 24 및 48 시간 후에 수집하고, 방출 된 IL-6 ELISA를 통해 측정 하였다 상등액. SEM ± 3 개의 독립적 인 실험의 평균 값이 표시됩니다. 심지어 된 OMV의 최저 용량 (0.1 μg의 / ㎖)와 IL-6의 상당량 분비 THP-1 세포. IL-6의 분비는 OMV 투여 량 증가와 장시간 배양 시간 증가. 통계 : 맨 - 휘트니 테스트; * P &lt;해당 0 μg의 / mL의 OMV에 비해 0.05 ** p &lt;0.01. 참조 (20)로부터 허가 재판하는 것은 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig3.jpg" /> 그림 3 : 대 식세포의 염증성 활성화는 TLR2 / 4에 따라 달라집니다. WT에서 mBMDM과 TLR2 / 4 - / - 생쥐 L. 뉴모 된 OMV (0.1 μg의 1 / ㎖)와 함께 배양 하였다. CXCL1 분비는 각각 24 및 48 시간 후 ELISA에 의해 분석 하였다. 그만큼3 개의 독립적 인 실험의 SEM ± 평균 값이 표시됩니다. WT 마우스에서 mBMDM는 L. 뉴모 OMV 배양 후 용량 의존적 CXCL1 분비 반응. TLR2 / 4 - / - mBMDM는 WT mBMDM에 비해 훨씬 적은 CXCL1을 분비하고,이 분비 농도 의존적으로 증가하지 않았다. 통계 : 맨 - 휘트니 테스트; 해당 μg의 0 / ㎖ OMV와 비교하여 * P &lt;0.05; 이 #P &lt;0.05 똑같이 취급 WT 샘플을 비교 하였다. 참조 (20)로부터 허가 재판하는 것은 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig4.jpg" /> 그림 4 : 대 식세포에서 L. 뉴모 필라 OMV 사전 배양 증가 세균 복제. (A)는 차별화 된 THP-1 세포가 된 OMV (0.1, 1로 미리 배양 된 10 μ; g / ㎖) 또는 LPS / IFN-γ는 (200 NG는 / mL 씩) 이상이 제어 방치 하였다. 전 배양 (20 시간) 후, THP-1 세포를 각각 2, 24, 48 시간 동안 L. 뉴모 코비 WT (MOI 0.5)로 감염시켰다. THP-1 세포는 사포닌을 첨가하여 용해시키고, 세균은 BCYE 아가 플레이트 상에 플레이 팅 하였다. CFUs 모든 시점 이후 0 μg의 / mL의 OMV에 대해 계산 하였다. 막대는 3 개의 독립적 인 실험, 기술 중복으로 수행 각각의 SEM ± 평균 값을 나타냅니다. 하지 미리 처리 된 세포에 비해 세균 흡수 (2 시간 후 감염 (PI))에 차이가 없었다. 세균 복제의 변화는 각각 24 및 48 시간 후에 측정 하였다. LPS / IFN-γ 전처리 된 THP-1 세포 이것도 L. 뉴모 OMV의 전처리 세포 농도 의존적 관찰 세균 부하 24 시간 PI의 감소를 보였다. 이후 시점 (48 시간 파이)에서, OMV 사전 처리 된 THP-1 세포는 L.의 뉴모 필라 다시의 두 배를 보여 주었다습곡, 반면 LPS / IFN-γ 전처리 식세포 박테리아 하중의 추가적인 감소를 보였다. 통계 : 맨 - 휘트니 테스트; * P &lt;해당 0 μg의 / mL의 OMV에 비해 0.05 ** p &lt;0.01. 20 시간 동안 0.1 μg의 / mL의 L. 뉴모 필라 된 OMV 사전 배양 한 다음 flagellin-에 감염되었다 (B) mBMDM 서로 다른 유전 적 배경을 가진 마우스 (WT, TLR2 - / -, 및 TRIF /에서 MyD88 - - /)에서 48 시간 동안 L. 뉴모 필라 코비 (MOI 0.5)의 결핍 돌연변이. mBMDM은 사포닌을 첨가하여 용해하고, 레지오넬라가 BCYE 아가 플레이트 상에 플레이 팅 하였다. CFU는 실선으로, 0 μg의 / ㎖ OMV에 대하여 계산 하였다. 막대는 평균 값 ±± SEM 3 개의 독립적 인 실험, 중복으로 수행 각각의를 나타냅니다. WT 마우스에서 mBMDM는 OMV 전처리 후 L. 뉴모 복제의 증가를 보였다. TLR2 - / - 대 식세포는 상당히 감소 보였다 <emTRIF /에서 MyD88에 필적&gt; 레지오넬라 복제 - / - mBMDM. 통계 : 맨 - 휘트니 테스트; WT는 샘플에 비하여 p &lt;0.05. 참조 (20)로부터 허가 재판하는 것은 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

여기서는 레지오넬라 뉴모 필라 (L. 뉴모) 액체 배양에서 외막 소체 (OMV)의 정제를 기술한다. 이러한 정제 소포 그들의 프로 - 염증 가능성을 분석하는 대 식세포의 치료에 사용된다.

레지오넬라 뉴모 필라 외부 막 소포 : 분리 및 대 식세포에 그들의 프로 - 염증 가능성 분석

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