Name: unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen
Uploaded: 2017-01-20T13:00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen at JoVE.com

نشكر كريستين Kerschbamer، توماس Letschka، سابين Oettl، مارغو Raffeiner، وفلوريان Senoner من مركز البحوث Laimburg وMirelle بورخيس دياس Schnetzer من Dualsystems في مجال التكنولوجيا الحيوية AG للدعم التقني وجوليا ستروبل لتنقيح الكتابة المخطوطة. تم تنفيذ هذا العمل كجزء من مشروع APPL2.0 ويتم تمويلها جزئيا من قبل مقاطعة ذاتية الحكم لبوزن / بولزانو، إيطاليا وأبل اتحاد جنوب تيرول.

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

في الشاشة Y2H، وشارك في أعربت عن بروتين المستجيب محتمل مع مختلف البروتينات التفاعل افتراضية (الخطوة 7). يحتوي كل المتنامية استنساخ الخميرة الطعم ولكن (يحتمل) interactor لآخر. يتم ترميز البروتينات التفاعل في مكتبة [كدنا أن يتم استنساخ في البلازميدات فريسة. الطعم والفريسة البلازميدات كل رمز المشترك cistronically لجزء من عامل الخميرة النسخ. في حالة وجود التفاعل الجسدي بين الطعم (المستجيب) وفريسة interactor لترميز البلازميد، متحدون شطري عامل النسخ (المجال ملزم الحمض النووي ومجال التنشيط)، ويتسبب في التعبير الجيني مراسل. الخميرة هي قادرة على النمو على لوحات مختارة SD histidine- والمنضب الأدينين. هذا النوع من مكتبة [كدنا فريسة يتوقف على المستجيب فرزهم ويجب أن يتم اختيار وفقا لذلك. يجب أن يكون الموجه الفريسة والطعم، وكذلك سلالة الخميرة، متوافق. في هذه الشاشة، وLexA الحمض النووي المجال وتفعيل domai GAL4 ملزمن كانت تستخدم كوحدات عامل الخميرة النسخ المتوافقة. مكتبة [كدنا يمكن بناؤها بشكل فردي، العرف، أو الحصول عليها تجاريا. إعداد مكتبة فريسة كدنا] ليست جزءا من هذا البروتوكول. في هذا البروتوكول، واستخدمت لذلك، مكتبة [كدنا تطبيع بتشييدها من الحمض النووي الريبي من تفاح أوراق DOMESTICA x و المستنسخة في pGAD-HA 41. تحولت المستجيب (الطعم) -expressing الخميرة سلالة مع مكتبة فريسة، واختيرت الحيوانات المستنسخة على لوحات مختارة SD histidine- والمنضب الأدينين. لاستخراج DNA البلازميد من المستعمرات الخميرة، ينصح DNA البلازميد عدة القائم على عمود مصغرة للبكتيريا في تركيبة مع خطوة تعطل الميكانيكية باستخدام الخرز الزجاجي لتحسين الخميرة تحلل (الخطوة 8). في هذه تنقية البلازميد، سيتم تنقية الطعم وناقلات فريسة في وقت واحد في تركيزات منخفضة نسبيا. ومع ذلك، فإن كمية DNA البلازميد يكفي للتعرف على شريك التفاعل من خلال التسلسل خفة دمالحوت نشر البلازميد مسبق (الخطوة 8.4). وكبديل لذلك، الحمض النووي تنقيته في الخطوة 8.4 يمكن أن تتحول إلى المختصة كولاي واختار مع فريسة بوساطة ناقلات المقاومة للمضادات الحيوية (مثل الأمبيسلين وفي حالة pGAD-HA). هاء اختيار القولونية المستعمرات تحمل سوى مكتبة البلازميد pGAD-HA، وتنقية البلازميد ذات العائد المرتفع يمكن القيام بها مع هذه الحيوانات المستنسخة. التحول الناجح لpLexA-N وpGAD-HA يبني يكمل التربتوفان ويسين auxotrophy من NMY51. التفاعل بين المستجيب وبروتين (المشفرة على pGAD-HA) يؤدي إلى تفعيل نظام مراسل في NMY51 السلالات. في حالة تفعيل الذاتي، NMY51 تحولت مع المستجيب معربا عن pLexA-N في تركيبة مع ناقلات مكتبة فارغة pGAD-HA تنمو على لوحات انتقائية تفتقر TRP-ليو-له-ADE، ويرجع ذلك إلى تفعيل غير المرغوب فيها من النظام مراسل NMY51 40. تفعيل الذات يمكن أن أكون wEAK ويمكن أن يحدث في غياب TRP-ليو-له، أو تفعيل يمكن أن تكون قوية وتميز بالنمو على لوحات TRP-ليو-له-ADE 41. تفعيل الذات يمكن أن يسبب خلفية ضخمة من الحيوانات المستنسخة إيجابية كاذبة في الشاشة Y2H الفعلية. لتجنب هذا، يجب إجراء اختبار الذاتي التنشيط مع الطعم، الذي ناقلات، معربا عن المستجيب هو-شارك تحولت مع ناقلات مكتبة فارغة. في هذا الإطار التجريبي، لا يجب أن يتسبب التعبير الجيني مراسل. إذا تفعيل الذات (أي نمو على لوحات مختارة) مرئيا في الاختبار، وسيلة يمكن أن تستكمل مع تركيزات مختلفة من 3 أمينو-1،2،4-التريازول 45 (3-AT). 3-AT هو المانع من نازعة الماء imidazoleglycerol فوسفات (HIS3)، وهو إنزيم مهم خلال الحامض الاميني الحيوي 46. مكملات مع 3-AT يمكن أن تقلل من تأثيرات ضعف تفعيل الذاتي خلال شاشات Y2H 47،48. يجب اختبار تركيزات مختلفة من 3-AT. في هذا البروتوكول، 1 - استخدمت 40 ملم 3-AT. يجب بعد ذلك يتم استخدام أقل تركيز الذي يؤدي إلى قمع تفعيل الذاتي في الشاشة Y2H. لا يمكن إلا أن لوحات مختارة من تفعيل الذات فحص يتم تقييم إذا لوحات SD-TRP-ليو من شارك في التحول تحتوي على عدد كاف من الحيوانات المستنسخة. باعتبارها ≥ إشارة 500 المستعمرات في 90 ملم (قطر) طبق بتري كافية. لتحديد كفاءة ترنسفكأيشن بالضبط، فمن المستحسن لإعداد التخفيفات المسلسل من الخميرة تتحول التعاون ونشرها على لوحات SD-TRP-ليو. للحد من تفعيل الذات، والمستجيب يمكن المستنسخة في pLexA-C، ناقل التعبير الطعم الذي يجمع العلامة LexA لمحطة سي من البروتين. توجه ليكس-A علامة لا يمكن تخفف تفعيل مصيره (24). ومع ذلك، فإنه ليس من الممكن في كل حالة إلى خفض أو إلغاء تفعيل الذات. تشكيلالمستعمرات الحمراء أو المحمر يشير إلى التفاعل الضعيف أو كاذبة إيجابية. يتم تنشيط الجينات مراسل ade2 من NMY51 فقط عندما يتعلق الأمر تفاعل البروتين البروتين، والتي في كتل بدوره تراكم صبغة حمراء في هذه الخميرة سلالة 40. في حالة عدم وجود تفاعل، NMY51 هي المحمر، في حين المستعمرات تحمل interactors قوية بيضاء. مراقبة لون مستعمرة على لوحات مختارة وبالتالي يوفر تلميحا هاما آخر للحكم على ما إذا المستعمرات منها هي interactors true- أو إيجابية كاذبة. ومن الضروري في نهاية المطاف على التكيف أو تغيير إعدادات الفحص معينة فيما يتعلق بطبيعة الطعم وخصائص التفاعل. الآن، وقد وضعت عددا من التحسينات والتقنيات مشتقة من Y2H مشتركة تتيح لتحليل التفاعلات البروتينية صعبة إلى حد ما في أنظمة المضيف مختلفة. مراجعة من قبل Stynen وآخرون. 49 عناوين ليصف الثانية جوانب مختلفة من Y2H، وإدخال تحسينات لها، والتكيف، وبالتالي يوفر معلومات مفيدة حول كيفية اختيار فحص التفاعل المناسب. أصبحت شاشات Y2H والتقنيات المستمدة تستخدم على نطاق واسع في المجالات البحثية المختلفة، حيثما هو مطلوب تحديد تفاعلات البروتين الثنائية. حتى لو يتم تنفيذ الضوابط الحرجة، مثل اختبارات تفعيل الذات من الطعم واحد الى واحد إعادة التحولات من البروتينات المتفاعلة التي تم تحديدها، وY2H معرضة لإنتاج نتائج خاطئة 26، 50، 51. الخميرة كنموذج ليست مناسبة لجميع الدراسات التفاعل. الخميرة لا تشكل بالضرورة بيئة الخلوية التي تدعم التعديل المناسب بعد متعدية وقابلة للطي لكل بروتين 24. وعلاوة على ذلك، في الإعداد Y2H، البروتينات والإفراط في اعرب، والتعبير عنها ليس السيطرةبقيادة المروج الطبيعي. تجبر Y2H الشركاء التفاعل البروتينية إلى النواة، وهي ليست بالضرورة وجهة التحت خلوية الطبيعية. وبالتالي قد لا تعكس الظروف الخلوية الأم من التفاعل من قبل الخميرة ويمكن أن يؤدي إلى نتائج خاطئة سلبية أو إيجابية كاذبة. وتستند معظم Y2H على تكامل الخميرة auxotrophy كمبدأ انتقائية. يتميز هذا الاختيار الغذائية من قبل حساسية عالية، ولكن على حساب من الانتقائية انخفض بالمقارنة مع غيرها (على سبيل المثال، مراسل مولد اللون) فحوصات 49. إذا unreducible تفعيل الذاتي (انظر أعلاه) أو تحدث قيود أخرى لالمستجيب معين، وY2H ليست فحص المناسب 25. في الجدول 1 والشكل 1، وبالنظر إلى النتائج المتوقعة للاختبار الذاتي التنشيط. يمكن أن يكون سبب غياب التفاعلات الحقيقية (أي السلبيات الكاذبة) التي كتبها سمية بروتين، غير صحيح البروتين متعدية<html> تجهيز والفراغية عائق للتفاعل والشركاء التفاعل ممثلة تمثيلا ناقصا في المكتبة تفترس غشاء توطين الطعم، أو في عداد المفقودين المكونات الضرورية للتفاعل 24. فمن المستحسن أن دي نوفو تضخيم الجين كامل طول البروتين التفاعل تحديدها من كدنا]، subclone ذلك إلى pGAD-HA، وإجراء التفاعل فحص واحد الى واحد من خلال تحويل ولدت pGAD-HA بناء في، معربا عن الطعم NMY51 سلالة. وهذا أمر ضروري لأن interactor لاحظ موجودة في مكتبة فريسة قد تكون سوى جزء من بروتين أكبر. ومع ذلك، فإن المعلومات عن منهما الجين كامل طول يمكن الوصول إليها إلا إذا كبير الجيني وtranscriptomic تسلسل البيانات المتاحة. بروتوكول التحول للفحص الذاتي التنشيط الموصوفة هنا يمكن تطبيقها لمثل هذا الاختبار واحد الى واحد، والتفاعل بين الطعم وinteractor لويجب أن تكون قابلة للتكرار. الحمار = &quot;jove_content&quot;&gt; التفاعلات التي تم تحديدها في شاشة Y2H يجب دائما أن أكده تقنية مستقلة أخرى. يجب أن يكون هذا الأسلوب مستقلة أقرب إلى بيئة طبيعية للالفعلي للتفاعل البروتين البروتين. في حالة ATP_00189 phytoplasmal المستجيب، تم التحقق من التفاعل مع عوامل النسخ TCP من تفاح س DOMESTICA في أخمص مع تكامل الفلورسنت ثنائي الجزيء (BiFC) في نيكوتيانا benthamiana جبلة مجردة 28 (ليست جزءا من هذا البروتوكول). وقد اشتق ATP_00189 البروتين المستجيب من محطة الممرض P. مالي. في بلانتا BiFC وهكذا اختارت أن تحقق التفاعل ATP_00189 مع تفاح س DOMESTICA عوامل النسخ التي سبق تحديدها في Y2H 28. BiFC هو البروتين البروتين التفاعل الفحص التي لا تتطلب النبات التحت خلوية من البروتينات التفاعل إلى النواة من أجل تفعيل نظام مراسل &lt;سوب الطبقة = &quot;XREF&quot;&gt; 52. علاوة على ذلك، في أخمص التعبير والآلات تعديل يحاكي بيئة من التفاعل الطبيعي بين المستجيب البكتيرية مصنع في مضيف مصنعها. ومع ذلك، فإن الشاشة العالمية باستخدام BiFC ليست مجدية. هناك العديد من الخطوات في البروتوكول التي يجب معالجتها بعناية. عندما تضخيم الجين (الخطوة 4)، من المهم أن يستبعد أن الاشعال ربط الحمض النووي المصنع. وبالتالي، من الحمض النووي من النباتات غير المصابة يجب أن تدرج كعنصر تحكم السلبية. يجب أن لا يحتوي على تسلسل الجين من مصلحة تقييد مواقع EcoRI وسالي التي تستخدم لاستنساخ اتجاهي للإدراج. إذا كان تسلسل لا تحتوي على هذه المواقع، يجب اختيار الانزيمات تقييد مختلفة لاستنساخ. التحول الخميرة هي طريقة المركزي خلال هذا البروتوكول. كفاءة ترنسفكأيشن يعتمد على كفاءة خلايا الخميرة، حيويتها، ولاية النمو، ونوعية reag ترنسفكأيشنوالأنف والحنجرة 53، 54. لالبروتوكول المقترح، فإنه ينصح بشدة لاستخدام الخميرة من لوحات جديدة لا يزيد عمرها عن أسبوعين (الاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية) عند تنفيذ التحولات. في كثير من الأحيان، تأخر نمو الخميرة تتحول عندما يتم تلقيح الثقافات السائلة انتقائية مع المستعمرات من لوحات أجار القديمة. ومن المفيد أيضا استخدام الثقافة بداية السائل بمثابة اللقاح للتجارب الفعلية وعدم استخدام الخميرة مباشرة من لوحة. انخفاض كفاءة عندما transfecting فريسة في الخميرة، معربا عن الطعم يمكن أن يؤدي إلى نقص تمثيل بعض البروتينات فريسة (interactors المحتملة)، وبالتالي يمكن أن تحرف الشاشة بأكملها. في هذا البروتوكول، وكفاءة ترنسفكأيشن خميرة ~ 150،000 وت م / ميكروغرام الحمض النووي transfected في Y2H عملت بشكل جيد. معرفة عيوب وعيوب تقنية Y2H وتفسير النتائج بطريقة حاسمة ومناسبة أمر لا غنى عنه لرسم نيوسإلخ الاستنتاجات. وقد استخدمت المقايسات Y2H والمشتقات لسنوات عديدة، وخضعت العديد من التحسينات والتعديلات فيما يتعلق خصائص الطعم المختلفة، وتوطين التحت خلوية من التفاعل والشركاء ملزم المتوقع، وغيرها من العوامل التي قد تكون مطلوبة للتفاعل (انظر Y3H 55، 56، 57). في الآونة الأخيرة، وقد وضعت شاشات Y2H مجموعة مقرها التي تسمح للتحليل الآلي، والإنتاجية العالية من العديد من الطعوم ضد الملايين من يفترس 58. المستقبل على الأرجح يكمن في الأتمتة والإنتاجية العالية النهج لهذا الاختبار للسماح لاستجلاء مسارات الإشارات المعقدة وinteractomes في المجالات البحثية المختلفة.

<html> وقد وضعت الخميرة شاشات اثنين هجينة (Y2H) حوالي 27 سنوات قبل 1 ومنذ ذلك الحين استخدمت على نطاق واسع في مختلف المجالات لتحديد تفاعلات محددة البروتين البروتين 2، 3، 4، 5، 6، 7، 8، 9، 10، 11 . التفاعل المادي للالمستجيب البكتيرية مع بروتين هدف المضيف وغالبا ما يكون شرطا مسبقا للتلاعب وظيفي من هذا البروتين الهدف. تحليل هذه التفاعلات قد انتقل إلى محورا للعديد من قطاعات مختلفة من العدوى الأحياء 12، 13، 14، 15،&quot;&gt; 16، 17، 18. إن مبدأ الشاشة Y2H هو أن التفاعل بين اثنين من البروتينات يؤدي إلى إعادة تشكيل عامل النسخ الوظيفي الذي يدفع التعبير عن الجينات المراسل. والمستجيب المعروفة (و&quot; وتنصهر الطعم &quot;) translationally إلى المجال الحمض النووي ملزمة (DBD) من عامل النسخ، وشركاء التفاعل المحتمل (و&quot;فريسة&quot;) وتنصهر إلى المجال تفعيل (م) من عامل النسخ منها. ومنذ شريك التفاعل غير معروف، ومكتبة من إمكانات يتم استنساخ interactors إلى ما يسمى &quot;مكتبة فريسة.&quot; وعادة ما يتم إجراء هذه المكتبة من قبل استنساخ cDNAs إلى ناقلات فريسة التعبير البلازميد المناسب ترميز م والتي تتوافق مع الطعم متجه المشفرة DBD. وفي حالة التفاعل، و عوامل النسخ المعاد لحث على التعبير عن الجينات المراسل، التي تمكن عموما اختيار نمو الخميرة. إنويتحقق تحديد interactors بواسطة التسلسل البلازميد فريسة مع الاشعال-بلازميد معين. وقد طورت البكتيريا استراتيجيات مختلفة للتلاعب واستغلال الأيض المضيفة أو من الإفلات من آليات الدفاع وتفرز جزيئات المستجيب عبر مختلف أنظمة إفراز البكتيريا 19 و 20 و 21. تحديد الشركاء ملزم من هذه المؤثرات البكتيرية وبالتالي هو الخطوة الأولى في تحديد مسار التلاعب في البلد المضيف. وهذا يؤدي إلى تحسين فهم الآليات الإمراضية محددة. يتم تنفيذ شاشات Y2H لتحديد التفاعلات المستجيب البكتيرية خلال phytoplasmoses، وكثير من الأحيان، Y2H هو التجربة الأولية الحاسمة لتوصيف مزيد من الآليات المرضية الجزيئية في مجال البحوث phytoplasma 22 و 23. ومع ذلك، فإن التقىوصف هود في معظم المنشورات نادرة إلى حد ما، وغالبا ما يتم الاستعانة بمصادر خارجية هذه التقنيات لشركات التكنولوجيا الحيوية. للفت الانتباه إلى جدوى هذه الطريقة، يوفر هذا البروتوكول المعلومات خطوة بخطوة لتحديد الشركاء التفاعل جزيء المستجيب البكتيرية في المضيف الطبيعي. وعلى الرغم من الاستخدام الواسع ونهج سريع إلى الأمام من شاشات Y2H، فإنه يجب ألا ننسى أن بعض التفاعلات قد لا تحدث في نظام الخميرة. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن يتم استخدام خلايا الخميرة كنوع من &quot;في الجسم الحي عاء التفاعل&quot; مع بعض القيود البيولوجية هذه. وقد تناولت العديد من الكتاب مزايا وعيوب Y2H ومشتقاته 11، 24، 25، 26، 27. الاعتبارات العامة هي، على سبيل المثال، أن خلية الخميرة قد لا توفر المناسبالتعبير الجيني، (مرحلة ما بعد) متعدية، أو الظروف translocational للبروتينات منها قيد الدراسة. وهذا يمكن أن يؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة في الشاشة. تفاعلات إيجابية يمكن بدوره أن يكون القطع الأثرية وقد لا يحدث في الوضع الطبيعي (أي في حالة المؤثرات في المضيف المناسب). ومن ثم لا غنى عنه لتأكيد التفاعل من نظام الخميرة تعبير مغايرة مع اختبار تفاعل مستقلة في نظام بيولوجي أكثر ارتباطا. في هذه الدراسة، تم تحديد الشركاء ملزم من ATP_00189 المستجيب من مسببات الأمراض النباتية غير الصالحة للزراعة Candidatus Phytoplasma مالي (P. مالي). توفر نتائج نظرة ثاقبة الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور أعراض التفاح انتشار 28 عاما، وهو المرض الذي يسبب خسائر اقتصادية عالية في مناطق زراعة التفاح المتضررة في أوروبا 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1514">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:565px;">Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:211px;">Applichem</td>
			<td style="width:324px;">A6284</td>
			<td style="width:415px;">for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trishydroxymethylaminomethane (Tris)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodiumchloride (NaCl)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2942</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2937</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">N-Lauroylsarcosin sodium salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A7402</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ammonium acetate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>9688</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1108</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3928</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>51976</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNAse</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2760</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chloroform:Isoamyl 24:1</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1935</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proofreading Polymerase (e.g. iProof)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>203433</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EcoRI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SalI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0641</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1493</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td>for self-activation assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Arginine Monohydrochloride&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3680</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Isoleucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3642</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-lysine Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3448</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Methionine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3897</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Phenylalanine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3464</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Threonine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3946</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tyrosine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3401</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Uracile</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0667</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Valine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3406</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Adenine Hemisulfate Salt&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1596</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.22 &#181;m Pore Filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16541</td>
			<td>for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Histidine Monohydrochloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3719</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Leucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3496</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tryptophane&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3410</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Nitrogen Base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51483</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1349</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-1</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peptone</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2208</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyethylene Glycol 4000 (PEG)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1249</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3478</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Salmon Sperm DNA&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2159</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-719</td>
			<td>for Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PLN350</td>
			<td>for plasmid purification from yeast and bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acid Washed Glass Beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>for plasmid purification from yeast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0839</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Extract</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1552</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z368245 (Sigma)</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bait vector (e.g. pLexA-N)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Prey vector (e.g. pGAD-HA)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control prey vector (e.g. pLexA-p53)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control bait vector (e.g. pACT-largeT)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C640003</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3&#916;200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>676 051</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td>for quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free)</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2500010</td>
			<td>for PCR and DNA works</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpell</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0301</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile filter (0.22 &#181;m; Polyethersulfone))</td>
			<td>VWR-International</td>
			<td>514-0073 (European Catalogue number)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 90 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633180</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 150 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>639161</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer (e.g. BioPhotometer)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>550507804</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WB7</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Western Blot Equipment</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>diverse</td>
			<td>for protein detection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dNTPs</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2201210</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 ml; 1000 ml; 2000 ml) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z232793, Z232858, Z232866</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaking Incubator (e.g. GFL 3031)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3031</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>KB 53 (E3.1)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825)</td>
			<td>Omniwash</td>
			<td>IF 825</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2 ml, 1.5 ml and 2.0 ml Reaction Vials (Polypropylene)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10-1000 &#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>diverse</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SPR-L-S01</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3617000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T4-Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fridge (4&#176;C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>81.767.580.4</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Freezer (-20&#176;C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>G5216</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Graduated Cylinder (e.g. Brand)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z327352; Z327417; Z327441&#160;&#160;</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S55701</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2)</td>
			<td>Integra-Biosciences</td>
			<td>155000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cuvettes for Electroporation (1 mm)</td>
			<td>Molecular Bio Products</td>
			<td>5510-11</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electroporator (e.g. Eporator)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 ml)</td>
			<td>VWR-International&#160;</td>
			<td>525-0403 (European Catalogue number)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 ml)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dithiothreitol (DTT, e.g. DTT, 1M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM))</td>
			<td>Ambion&#160;</td>
			<td>AM8110G (distributed by Thermo Scientific)</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2021 Sigma&#160;</td>
			<td>for yeast culture (ready-made mix)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen

التكشف الآليات الجزيئية من مظاهر المرض من المهم أن نفهم الأمراض والتنمية أعراض في علم النبات. وقد تطورت البكتيريا استراتيجيات مختلفة للتلاعب الأيض المضيفة لمصلحتهم الخاصة. وغالبا ما يقترن هذا التلاعب البكتيرية مع تطور أعراض شديدة أو وفاة النباتات المتضررة. أصبح تحديد جزيئات بكتيرية محددة مسؤولة عن التلاعب المضيف مجال هام في الأبحاث الميكروبيولوجية. بعد تحديد هذه الجزيئات البكتيرية، ودعا &quot;المؤثرات&quot;، فمن المهم توضيح وظيفتها. نهج واضحة لتحديد وظيفة من المستجيب في تحديد شريك ملزم البروتينية في المضيف الطبيعي عبر شاشة الخميرة اثنين الهجين (Y2H). عادة المضيف المرافئ عدد كبير من الشركاء المحتملين ملزم التي لا يمكن التنبؤ بما فيه الكفاية من قبل أي في خوارزمية SILICO. وبالتالي، فإن أفضل خيار لPERFORM شاشة مع المستجيب افتراضية ضد مكتبة كاملة من بروتينات المضيف التعبير عنها. ومن الصعب وخاصة إذا كان العامل المسبب هو زراعتها مثل phytoplasma. يوفر هذا البروتوكول إرشادات خطوة بخطوة لتنقية الحمض النووي من محطة المصابة phytoplasma المضيف الخشبية، والتضخيم من المستجيب المحتملين، وتحديد لاحق من شريك التفاعل الجزيئي المصنع مع شاشة Y2H. على الرغم من شاشات Y2H تستخدم عادة، هناك اتجاه الاستعانة بمصادر خارجية لهذه التقنية لشركات التقنية الحيوية التي تقدم خدمة Y2H في التكلفة. وينص هذا البروتوكول على تعليمات حول كيفية إجراء Y2H في أي مختبر البيولوجيا الجزيئية مجهز لائق باستخدام تقنيات المختبر القياسية.

قبل لا يمكن أن يؤديها على الشاشة Y2H الفعلية يجب أن يتم اختبار الطعم لتفعيل الذات. ويتحقق ذلك عن طريق تحويل ناقلات التعبير الطعم جنبا إلى جنب مع ناقلات مكتبة فريسة فارغة ووقف النمو على لوحات مختارة. لتحليل ما إذا كان ATP_00189 البروتين phytoplasmal هو تفعيل الذاتي، تم إجراء الاختبار الذاتي التنشيط كما هو موضح في القسم 5. البلازميد الطعم مكملة لجنة المراجعة الفنية وفريسة البلازميد وauxotrophy ليو س الخباز NMY51 40. وهكذا يتميز ناجح شارك في التحول من النمو على لوحات انتقائية تفتقر الحزب وليو. التفاعل بين الطعم والبروتينات فريسة يؤدي إلى تكامل من auxotrophy له وADE من NMY51. إذا ظهر تفعيل الذات من خلال الطعم في حالة عدم وجود تفاعل، الخميرة تنمو على لوحات انتقائية تفتقر له وADE. الذاتي القوي والضعيفيمكن أن يحدث التنشيط. يتميز قوي تفعيل الذات من الطعم من نمو الخميرة تتحول شارك في TRP-ليو-له-ADE المنضب لوحات مختارة. ضعف تفعيل الذات يؤدي إلى نمو في TRP-ليو-ولكن لا على TRP-ليو-له-ADE المنضب لوحات مختارة. الضوابط الإيجابية السليمة لا غنى عنها لتفسير نتائج تفعيل الذات الفحص. ويرد موجز النتائج المتوقعة من تفعيل الذات فحص وتفسيرها في الجدول 1 وتصور في الشكل 1. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> الشكل 1: مثال لبيت التنشيط الذاتي الاختبارات من البيت قبل تنفيذ شاشة Y2H. البيرة س NMY51 وقد شارك في تحويلها مع التفاعل الطعم (بلكس-البروتين p53) وفريسة (حلف-largeT) كعنصر تحكم إيجابية (اللوحة اليسرى: ميلان)، وهو ضعيف تشغل آليا بالإضافة إلى فريسة فارغة برةناقلات راي (وسط لوحة: مدافع) والطعم لا تشغل آليا بالإضافة إلى ناقلات مكتبة فريسة فارغة (الصحيحة لوحة: غي). الخميرة متحولة التعاون ومثقف على لوحات SD تفتقر الحزب وليو (اللوحة العليا: أ، د، ز)، الحزب، ليو وله (لوحة المتوسطة: ب، ه، ح) والحزب، ليو، له وآدي (أقل لوحة: ج، و، ط). الاختيار على المتوسطة التي تفتقر إلى الحزب وليو هو السيطرة الإيجابية لنجاح المشارك التحول، كما متجه الطعم يكمل auxotrophy الحزب وناقلات فريسة للauxotrophy ليو من NMY51 (النمو على SD-TRP-ليو). في حالة وجود تفاعل بين الطعم والفريسة أو تفعيل الذات من الطعم، يتم تشغيل التعبير مراسل NMY51 على ويكمل له وauxotrophy ADE (النمو على SD-TRP-ليو-له-ADE). ويتسم ضعف تفعيل الذات من خلال النمو في SD-TRP-ليو-له لوحات (لوحة المتوسطة، مدافع). يجب أن تقلص ضعف تفعيل الذات من الطعم قبل لتحليل الطعمفي شاشة Y2H، على سبيل المثال عن طريق إضافة 3-AT إلى وسائل الإعلام الانتقائي. يشار إلى استنفاد الأحماض الأمينية مع &quot;-&quot; في اسم وسائل الإعلام المعنية. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> لا شيء </td><td> المستعمرات </td><td> أي نمو </td><td> أي نمو </td><td> أي نمو </td><td> أي نمو </td></tr><tr><td> لا شيء </td><td> pGAD-HA </td><td> أي نمو </td><td> المستعمرات </td><td> أي نمو </td><td> أي نمو </td><td> أي نمو </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> لا شيء </td><td> المستعمرات </td><td> أي نمو </td><td> أي نمو </td><td> أي نمو </td><td> أي نمو </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> pGAD-HA </td><td> المستعمرات </td><td> المستعمرات </td><td&gt; المستعمرات </td><td> أي نمو </td><td> أي نمو </td></tr><tr><td> pLexA-البروتين p53 </td><td> اتفاق-largeT </td><td> المستعمرات </td><td> المستعمرات </td><td> المستعمرات </td><td> المستعمرات </td><td> المستعمرات </td></tr><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> pGAD-HA </td><td> المستعمرات </td><td> المستعمرات </td><td> المستعمرات </td><td> أي نمو </td><td> أي نمو </td></tr></tbody></table> الجدول 1: النتائج المتوقعة في بيت التنشيط الذاتي الفحص. التحول من البيرة س NMY51 ينتج في النمو التفاضلي على وسائل الإعلام الانتقائية على أساس خصائص الطعم تتحول التعاون وفريسة. تم تقييم النمو على لوحات انتقائية على التحول من مجموعات ناقلات مختلفة (AF) بعد 72 ساعة حضانة في 30 درجة مئوية. يتميز ضعف تفعيل الذات من خلال نمو الخميرة على SD-TRP-ليو-له وقوي تفعيل الذات من خلال النمو في SD-TRP-ليو-له-ADE اختيار بلاتوفاق في ظل عدم وجود شريك التفاعل. وpLexA-N phytoplasmal المشفرة المستجيب ATP_00189 لا يحمل تفعيل الذات، والتي تتميز عدم قدرة ناقلات الطعم تتحول NMY51 أن تنمو في غياب له وADE. اعتمادا على الطعم، يمكن لشاشة Y2H كسب العديد من الحيوانات المستنسخة الخميرة تنمو على لوحات مختارة. يجب تحليل جميع الحيوانات المستنسخة والتحقق من التكرار الممكنة. حتى لو تم استخدام مكتبة [كدنا طبيعية، فمن المحتمل جدا أن interactor لتتمثل في العديد من الحيوانات المستنسخة مختلفة. اعتمادا على تقنية الاستنساخ المكتبة، فمن الممكن أيضا أن يتم إدراج سوى الفتات من الجين الكامل في بعض نواقل فريسة. بالتالي فمن المستحسن أن دي نوفو تضخيم (من كدنا]) وsubclone الجين كامل طول interactor لولاختبار التفاعل في تحليل Y2H واحد الى واحد (الشكل 2). <img aLT = &quot;الشكل 2&quot; SRC = &quot;/ ملفات / ftp_upload / 55150 / 55150fig2.jpg&quot; /&gt; الشكل 2: مثال على التفاعل بين الطعم والفريسة في تجربة Y2H. وأجريت الخميرة اثنين الهجين (Y2H) الشاشة ووتنقية البلازميدات من الحيوانات المستنسخة interactor لإيجابية. كان التسلسل متجه الفريسة وتم تحديد تفاح س DOMESTICA شركاء التفاعل المضيف MdTCP24 وMdTCP25. ونتيجة لMdTCP34 سيطرة سلبية (التي تم تحديدها لا interactor لفي الشاشة مكتبة Y2H) وsubcloned بشكل متواز. وتضخمت جينات طول كامل من كدنا] التفاح، subcloned في ناقلات فريسة (التعبير المشارك cistronically تفعيل المجال AD) ودي نوفو المشارك تحولت مع ناقلات الطعم معربا عن ATP_00189 المستجيب بكتيريا بالإضافة إلى المجال الحمض النووي ملزمة (BD). يؤخذ هذا الرقم من 28. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض أكبر</a>نسخة من هذا الرقم.

Watch this Scientific Journal Video about Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen at JoVE.com

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

البروتينات المستجيب البكتيرية مهمة لتأسيس العدوى الناجحة. يصف هذا البروتوكول تحديد التجريبي للشركاء ملزم البروتينية من بروتين المستجيب البكتيرية في مضيف النباتات الطبيعية لها. أصبح تحديد هذه التفاعلات المستجيب عبر الخميرة الشاشتين الهجين أداة مهمة في كشف استراتيجيات المرضية الجزيئية.

التكشف وظيفة من المستجيب البكتيرية من مسببات الأمراض النباتية غير الصالحة للزراعة باستخدام الخميرة شاشة ثنائية مختلطة

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Luciferase به لالتهابات جرثومية في صورة الفئران

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

غزو ​​الخلايا البشرية من قبل الممرض الجرثومي

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

استخدام نموذج لوصف EpiAirway طويل الأجل المضيف الممرض التفاعلات

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

تحريض الطعم ضد المضيف المرض و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; مراقبة الخلايا T باستخدام نموذج MHC المطابقة الفئران

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

الكمي للاستعمار الفطرية، تولد الأبواغ، وإنتاج السموم الفطرية عن طريق اختبارات بيولوجية على النواة

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

ال<em&gt; الليمونية rodentium</em&gt; نموذج الفأر: دراسة العوامل الممرضة والمضيفة المساهمات في التهاب القولون المعدية

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

الفصل الآلي لل<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; المستعمرة بنسب مختلفة من قبل الممرض الجرثومي

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

كشف اللحاء شظايا خلال البكتيرية سبور الإنبات

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

تقييم الشبكية دبقية أكلة وظيفة<em&gt; في فيفو</em&gt; باستخدام الفحص القائمة على الخلوي التدفق

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...