Name: unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen
Uploaded: 2017-01-20T13:00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen at JoVE.com

Vi takker Christine Kerschbamer, Thomas Letschka, Sabine Oettl, Margot Raffeiner, og Florian Senoner fra Laimburg Forskningscenter og Mirelle Borges Dias Schnetzer fra Dualsystems Biotech AG til teknisk support og Julia Strobl for korrekturlæsning manuskriptet. Dette arbejde blev udført som en del af APPL2.0 projektet og blev delvist finansieret af den selvstyrende provins Bozen / Bolzano, Italien og sydtyrolske Apple Consortium.

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

I Y2H skærmen, er den potentielle effektor-protein co-udtrykkes med forskellige hypotetiske interagerende proteiner (trin 7). Hver voksende gær klon indeholder lokkemaden, men en (potentielt) forskellig interaktør. De interagerende proteiner er kodet i et cDNA-bibliotek, der er klonet ind i prey plasmider. Agn og byttet plasmider hver co-cistronically kode for en del af en gærtransskriptionsfaktor. I tilfælde af en fysisk interaktion mellem lokkemaden (effektor) og en bytte plasmid-kodet interactor er de to transkriptionsfaktor dele (det DNA-bindende domæne og aktiveringsdomænet) forenet, og reportergenet ekspression induceres. Gæren er i stand til at vokse på histidin- og adenin-udtømte SD selektionsskåle. Den slags byttedyr cDNA-bibliotek er afhængig af screenede effektor og skal vælges i overensstemmelse hermed. Byttet og agn vektor, samt gærstammen, skal være kompatible. I denne skærm, en LexA DNA-bindende domæne og GAL4 aktiverende domain blev anvendt som kompatible gærtransskriptionsfaktor enheder. CDNA bibliotek kan individuelt konstrueret, specialfremstillede eller kommercielt opnået. Forberedelsen af ​​cDNA bytte bibliotek er ikke en del af denne protokol. I denne protokol, blev egenproducerede, normaliseret cDNA bibliotek fra RNA af Malus x domestica blade brugt og klonet ind pGAD-HA 41. Effektor (lokkemad) udtrykkende gærstamme blev transformeret med bytte bibliotek og kloner blev selekteret på histidin- og adenin-udtømte SD selektionsskåle. For at ekstrahere plasmid-DNA fra gær kolonier, er en kolonne-baserede DNA-plasmid mini kit for bakterier anbefales i kombination med en mekanisk sprængning trin anvendelse af glasperler til forbedring gær lysis (trin 8). I dette plasmid oprensning, vil agn og bytte vektor oprenses samtidigt i relativt lave koncentrationer. Men mængden af ​​plasmid-DNA er nok til at identificere interaktionen partner gennem sekventering witHout forudgående plasmid formering (trin 8.4). Som et alternativ kan DNA oprenset i trin 8.4 transformeres ind i kompetente E. coli og udvalgt med prey vektor-formidlet antibiotikaresistens (f.eks, ampicillin den i tilfælde af pGAD-HA). Den valgte E. coli kolonier bærer kun pGAD-HA bibliotek plasmid, og højt udbytte plasmid oprensning kan udføres med disse kloner. Den vellykkede transformation af pLexA-N og pGAD-HA-konstruktioner supplerer tryptophan og leucin auxotrofi af NMY51. En interaktion mellem effektor og et protein (kodet på pGAD-HA) fører til aktivering af reporter-system i NMY51 stammer. I tilfælde af selv-aktivering, NMY51 transformeret med effektor udtrykkende pLexA-N i kombination med det tomme bibliotek vektor pGAD-HA vokser på selektive plader, der mangler trp-leu-his-ade, på grund af den uønskede aktivering af NMY51 reportersystemet 40. Den selv-aktivering kan være wEAK og kan forekomme i fravær af trp-leu-his, eller aktiveringen kan være stærk og karakteriseret ved vækst på trp-leu-his-ade plader 41. Self-aktivering kan forårsage en massiv baggrund af falsk-positive kloner i selve Y2H skærmen. For at undgå dette, skal en selv-aktivering test med agn gennemføres, hvor effektor-udtrykkende vektor er co-transformeret med den tomme bibliotek vektoren. I denne eksperimentelle indstilling skal reportergenekspression ikke induceres. Hvis selv-aktivering (dvs. vækst på selektive plader) er synlig i testen, kan mediet suppleres med forskellige koncentrationer af 3-amino-1,2,4-triazol 45 (3-AT). 3-AT er en inhibitor af imidazoleglycerol-phosphat-dehydratase (HIS3), et enzym vigtigt under histidin-biosyntese 46. Tilskud af 3-AT kan mindske de svage virkninger af selv-aktivering under Y2H skærme 47,48. Forskellige koncentrationer af 3-AT bør afprøves. I denne protokol, 1 - blev 40 mM 3-AT anvendes. Den laveste koncentration, der fører til undertrykkelsen af ​​selv-aktivering bør efterfølgende anvendes i Y2H skærmen. De selektive plader i den selvstændige aktivering assay kan kun evalueres, hvis SD-trp-leu plader af co-transformation indeholder et tilstrækkeligt antal kloner. Som en indikation ≥ 500 kolonier pr 90-mm (diameter) petriskål er tilstrækkelige. At bestemme den nøjagtige transfektionseffektivitet, anbefales det at fremstille serielle fortyndinger af co-transformeret gær og fordele dem på SD-trp-leu-plader. For at reducere selv-aktivering, kan effektoren klones i pLexA-C, en lokkemad ekspressionsvektor, der sammensmelter LexA tag til C-terminalen af ​​proteinet. Orienteringen af Lex-Et tag kan dæmpe selvaktivering 24. Det er imidlertid ikke muligt i alle tilfælde at reducere eller afskaffe selv-aktivering. Dannelsen afrøde eller rødlige kolonier indikerer en svag eller falsk-positivt samspil. ADE2 reportergen af NMY51 aktiveres kun, når det kommer til en protein-protein-interaktion, hvilket igen blokerer ophobning af et rødt farvestof i denne gærstamme 40. I mangel af en interaktion, NMY51 er rødlig, mens kolonier bærer stærke interaktionskandidater er hvide. Observationen af ​​kolonien farve på markeringen pladerne giver således et yderligere vigtigt tip til at bedømme, om de respektive kolonier er sandt-eller falsk-positive interaktionskandidater. Det er efterhånden nødvendigt at tilpasse eller ændre visse assay indstillinger med hensyn til arten af ​​agn og interaktionsegenskaberne. På nuværende tidspunkt har en række forbedringer og afledte teknikker for den fælles Y2H blevet etableret for at muliggøre analyse af temmelig vanskelige protein-interaktioner i forskellige værtssystemer. En gennemgang af Stynen et al. 49 adresser ennd beskriver forskellige aspekter af Y2H, dens forbedringer, og tilpasninger, og dermed giver nyttige oplysninger om, hvordan du vælger den passende interaktion analysen. Y2H skærme og afledte teknikker er blevet meget udbredt i forskellige forskningsområder, uanset hvor identifikation af binære protein-interaktioner er påkrævet. Selvom udføres kritiske kontrol, såsom selv-aktivering test af agn og en-til-en re-transformationer af de identificerede interagerende proteiner, den Y2H er tilbøjelige til at producere falske resultater 26, 50, 51. Gæren som model er ikke egnet til alle interaktionsundersøgelser. Gær er ikke nødvendigvis udgør et cellulært miljø, der understøtter den passende post-translationel modifikation og foldning for hver protein 24. Desuden er det i indstillingen Y2H, proteinerne overudtrykt, og deres ekspression er ikke kontrolledet af deres naturlige promotor. Den Y2H tvinger proteinholdige interaktionspartnere til kernen, hvilket ikke nødvendigvis deres naturlige subcellulære destination. De indfødte cellulære omstændigheder ved interaktion kan således ikke afspejles af gæren og kan føre til falsk negative eller falsk-positive resultater. Mest Y2H er baseret på gær auxotrofi komplementation som en selektiv princip. Denne ernæringsmæssige valg er kendetegnet ved høj følsomhed, men på bekostning af nedsat selektivitet sammenlignet med andre (f.eks kromogent reporter) assays 49. Hvis unreducible selv-aktivering (se ovenfor) eller andre begrænsninger opstår for en bestemt effektor, at Y2H ikke er en hensigtsmæssig analyse 25. I tabel 1 og figur 1, er de forventede resultater i den selvstændige aktivering test som anført. Fraværet af reelle interaktioner (dvs. falske negativer) kan være forårsaget af protein toksicitet, ukorrekt translationel proteinforarbejdning, sterisk hindring af interaktion, underrepræsenterede interaktion partnere i bytte bibliotek, membran lokalisering af agn, eller manglende komponenter, der er nødvendige for samspillet 24. Det anbefales at de novo amplificere fuld-længde gen af det identificerede interagerende protein fra cDNA, subklone det ind pGAD-HA, og udfør en en-til-en interaktion assay ved at transformere den frembragte pGAD-HA-konstruktion i lokkemaden-udtrykkende NMY51 stamme. Dette er nødvendigt, da den observerede interactor stede i bytte bibliotek måske kun et fragment af et større protein. Men oplysningerne til de respektive fuld-længde gen er kun tilgængelige, hvis betydelige genomisk og transkriptomisk sekvens data er tilgængelige. Transformationen protokol for selvaktivering assay her beskrevne kan anvendes til en sådan en en-til-en-analysen, og samspillet mellem agn og interaktør skal være reproducerbar. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Interaktioner identificeret i en Y2H skærm skal altid bekræftes af en anden uafhængig teknik. Denne uafhængige teknik skal være tættere på naturlige indstilling af den faktiske protein-protein-interaktion. I tilfælde af phytoplasmal effektor ATP_00189 blev samspil med TCP transkriptionsfaktorer af Malus x domestica verificeret i planta med bimolekylær fluorescerende komplementering (BiFC) i Nicotiana benthamiana protoplaster 28 (ikke en del af denne protokol). Den effektor protein ATP_00189 stammer fra planten patogen P. mali. I planta BiFC blev således valgt at verificere ATP_00189 interaktioner med Malus x domestica transkriptionsfaktorer tidligere identificeret i Y2H 28. BiFC er et protein-protein-interaktion assay, der ikke kræver den subcellulære translokation af de interagerende proteiner til kernen for at aktivere reportersystemet &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 52. Desuden i planta udtryk og modifikation maskiner efterligner miljøet af den naturlige interaktion mellem anlægget bakteriel effektor i sin fabrik vært. Men en global skærm ved hjælp BiFC ikke er mulig. Der er flere trin i den protokol, skal omhyggeligt behandlet. Når amplifikation af genet af interesse (trin 4), er det vigtigt at udelukke, at primerne binder til plante-DNA. Således må DNA fra ikke-inficerede planter indgå som en negativ kontrol. Sekvensen af ​​genet af interesse skal ikke indeholde EcoRI- og Sall-restriktionssteder, der bruges til den retningsbestemte kloning af insertet. Hvis rækkefølgen ikke indeholder disse steder, skal forskellige restriktionsenzymer til kloning vælges. Gær transformation er en central metode i denne protokol. Transfektionseffektivitet afhænger kompetence af gærcellerne, deres levedygtighed, vækst tilstand, og kvaliteten af ​​transfektion reagent 53, 54. For den foreslåede protokol, er det stærkt anbefales at bruge gær fra friske plader ikke er ældre end to uger (holdes ved 4 ° C) ved udførelse af transformationer. Ofte er væksten af ​​transformerede gær udsættes, når selektive flydende kulturer podes med kolonier fra gamle agarplader. Det er også nyttigt at anvende en flydende syrevækkerkultur som inokulum til de faktiske eksperimenter og ikke anvende gæren direkte fra pladen. Lav effektivitet når transfektion byttet ind agn-udtrykkende gær kan føre til underrepræsentation af visse prey-proteiner (potentielle interaktionskandidater) og kan således forvrænge hele skærmen. I denne protokol, en gær transfektion effektiviteten af ​​~ 150.000 cfu / ug transficeret DNA i Y2H fungeret godt. Kendskab fejlene og ulemper ved den Y2H teknik og fortolkning af resultaterne i en kritisk og hensigtsmæssig måde er nødvendig for at tegne correct konklusioner. Y2H assays og derivater er blevet anvendt i mange år og har gennemgået mange forbedringer og tilpasninger med hensyn til de forskellige agn egenskaber, den subcellulære lokalisering af interaktionen, forventede bindingspartnere og andre faktorer der kan være påkrævet for interaktionen (se Y3H 55, 56, 57). For nylig er matrixbaserede Y2H skærme blevet udviklet, der tillader automatiseret, high-throughput analyse af talrige lokkemad mod millioner af byttedyr 58. Fremtiden sandsynligvis ligger i automatisering og high-throughput tilgange til dette assay for at muliggøre belysning af komplekse signalveje og interactomes i forskellige forskningsområder.

<html> Gær to-hybrid-skærme (Y2H) blev udviklet omkring 27 år siden 1 og har siden blevet anvendt bredt på forskellige områder for at bestemme specifikke protein-protein interaktioner 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 . Den fysiske interaktion mellem en bakteriel effektor med en vært target protein er ofte en forudsætning for den funktionelle manipulation af dette målprotein. Analyse disse interaktioner er flyttet til fokus for mange forskellige sektorer af infektion biologi 12, 13, 14, 15,&quot;&gt; 16, 17, 18. Princippet i Y2H skærm er, at vekselvirkningen af to proteiner fører til rekonstituering af en funktionel transskriptionsfaktor, som driver ekspressionen af reportergener. Den kendte effektor (den&quot; lokkemad &quot;) er translationelt fusioneret til det DNA-bindende domæne (DBD) af transkriptionsfaktoren, og det potentielle samspil partnere (den &quot;bytte&quot;) er fusioneret til det aktiverende domæne (AD) af det respektive transskriptionsfaktor. Da det interagerende partner er ukendt, et bibliotek af potentiel interaktionskandidater klones ind i såkaldte &quot;bytte-bibliotek.&quot; Normalt er dette bibliotek fremstillet ved at klone cDNA&#39;er i en passende bytte vektor ekspressionsplasmid der koder for AD, som er forenelig med agn-vektoren indkodet DBD. i tilfælde af en interaktion, den rekonstituerede transkriptionsfaktorer inducere ekspressionen af ​​reportergener, der generelt muliggør væksten udvælgelse af gær. denidentifikation af interaktionskandidater opnås ved sekventering af byttedyr plasmid med plasmid-specifikke primere. Bakterier har udviklet forskellige strategier til at manipulere og udnytte deres vært stofskifte eller at unddrage sig forsvarsmekanismer og udskiller effektor molekyler via forskellige bakterielle sekretion systemer 19, 20, 21. Bestemmelse af de bindende partnere i disse bakterielle effektorer er således det første skridt i at identificere den manipulerede pathway i værten. Dette fører til en bedre forståelse af de specifikke sygdomsfremkaldende evne mekanismer. Y2H skærme er udført for at identificere bakterielle effektor interaktioner under phytoplasmoses, og ofte, Y2H er en afgørende indledende forsøg til yderligere karakterisering af molekylære patogenicitet mekanismer i fytoplasma forskning 22, 23. Imidlertid met,hod beskrivelse i de fleste publikationer er temmelig knappe, og disse teknikker er ofte outsourcet til biotekvirksomheder. For at gøre opmærksom på muligheden for denne metode, denne protokol giver trin-for-trin oplysninger til at identificere interaktion partnere i en bakteriel effektormolekyle i sin naturlige vært. På trods af den udbredte anvendelse og hurtigt fremad tilgang Y2H skærme, må det ikke glemmes, at visse interaktioner ikke kan opstå i gæren systemet. Dette skyldes det faktum, at gærcellen anvendes som en slags &quot;in vivo reaktionsbeholder&quot; med visse biologiske begrænsninger. Flere forfattere har behandlet de fordele og ulemper ved Y2H og dets derivater 11, 24, 25, 26, 27. Generelle betragtninger er for eksempel, at gærcellen ikke kan give den relevantegenekspression, (post-) translationel eller translocational betingelser for de respektive proteiner blev undersøgt. Dette kan føre til falsk negative resultater i skærmen. Positive interaktioner kan igen være artefakter og måske ikke forekomme i den naturlige situation (dvs. i tilfælde af effektorer i passende vært). Det er således nødvendigt at bekræfte interaktionerne fra heterologe gærekspressionssystem med en uafhængig interaktion test i en nærmere beslægtet biologisk system. I denne undersøgelse blev de bindende partnere af effektor ATP_00189 fra ikke-dyrkbare plantepatogen Kandidat fytoplasma mali (P. mali) identificeret. Resultaterne giver et vigtigt indblik i de molekylære mekanismer bag den symptom udvikling af æble spredning 28, en sygdom, der forårsager store økonomiske tab i påvirket æble-voksende regioner i Europa 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1514">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:565px;">Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:211px;">Applichem</td>
			<td style="width:324px;">A6284</td>
			<td style="width:415px;">for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trishydroxymethylaminomethane (Tris)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodiumchloride (NaCl)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2942</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2937</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">N-Lauroylsarcosin sodium salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A7402</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ammonium acetate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>9688</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1108</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3928</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>51976</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNAse</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2760</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chloroform:Isoamyl 24:1</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1935</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proofreading Polymerase (e.g. iProof)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>203433</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EcoRI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SalI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0641</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1493</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td>for self-activation assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Arginine Monohydrochloride&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3680</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Isoleucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3642</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-lysine Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3448</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Methionine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3897</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Phenylalanine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3464</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Threonine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3946</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tyrosine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3401</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Uracile</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0667</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Valine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3406</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Adenine Hemisulfate Salt&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1596</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.22 &#181;m Pore Filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16541</td>
			<td>for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Histidine Monohydrochloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3719</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Leucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3496</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tryptophane&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3410</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Nitrogen Base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51483</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1349</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-1</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peptone</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2208</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyethylene Glycol 4000 (PEG)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1249</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3478</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Salmon Sperm DNA&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2159</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-719</td>
			<td>for Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PLN350</td>
			<td>for plasmid purification from yeast and bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acid Washed Glass Beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>for plasmid purification from yeast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0839</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Extract</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1552</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z368245 (Sigma)</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bait vector (e.g. pLexA-N)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Prey vector (e.g. pGAD-HA)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control prey vector (e.g. pLexA-p53)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control bait vector (e.g. pACT-largeT)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C640003</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3&#916;200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>676 051</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td>for quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free)</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2500010</td>
			<td>for PCR and DNA works</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpell</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0301</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile filter (0.22 &#181;m; Polyethersulfone))</td>
			<td>VWR-International</td>
			<td>514-0073 (European Catalogue number)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 90 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633180</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 150 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>639161</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer (e.g. BioPhotometer)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>550507804</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WB7</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Western Blot Equipment</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>diverse</td>
			<td>for protein detection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dNTPs</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2201210</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 ml; 1000 ml; 2000 ml) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z232793, Z232858, Z232866</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaking Incubator (e.g. GFL 3031)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3031</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>KB 53 (E3.1)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825)</td>
			<td>Omniwash</td>
			<td>IF 825</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2 ml, 1.5 ml and 2.0 ml Reaction Vials (Polypropylene)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10-1000 &#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>diverse</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SPR-L-S01</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3617000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T4-Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fridge (4&#176;C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>81.767.580.4</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Freezer (-20&#176;C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>G5216</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Graduated Cylinder (e.g. Brand)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z327352; Z327417; Z327441&#160;&#160;</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S55701</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2)</td>
			<td>Integra-Biosciences</td>
			<td>155000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cuvettes for Electroporation (1 mm)</td>
			<td>Molecular Bio Products</td>
			<td>5510-11</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electroporator (e.g. Eporator)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 ml)</td>
			<td>VWR-International&#160;</td>
			<td>525-0403 (European Catalogue number)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 ml)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dithiothreitol (DTT, e.g. DTT, 1M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM))</td>
			<td>Ambion&#160;</td>
			<td>AM8110G (distributed by Thermo Scientific)</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2021 Sigma&#160;</td>
			<td>for yeast culture (ready-made mix)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen

Opklaringen de molekylære mekanismer i sygdomsmanifestationer er vigtigt at forstå patologier og symptom udvikling i plante videnskab. Bakterier har udviklet forskellige strategier til at manipulere deres vært stofskifte til deres egen fordel. Denne bakterie manipulation er ofte kombineret med alvorlig symptom udvikling eller død af de berørte anlæg. Bestemmelse af specifikke bakterielle molekyler, der er ansvarlige for værten manipulation er blevet et vigtigt område i mikrobiologisk forskning. Efter identifikationen af ​​disse bakterielle molekyler, kaldet &quot;effektorer&quot;, er det vigtigt at belyse deres funktion. En enkel tilgang til at bestemme funktionen af ​​en effektor er at identificere sin proteinholdige bindende partner i sin naturlige vært via en gær to-hybrid (Y2H) skærm. Normalt værten huser talrige potentielle bindingspartnere der ikke kan forudsiges tilstrækkelig ved enhver in silico algoritme. Det er således det bedste valg til PERFOrm en skærm med den hypotetiske effektor mod et helt bibliotek af udtrykte værtsproteiner. Det er især en udfordring, hvis det agens er dyrkbare ligesom fytoplasma. Denne protokol giver trin-for-trin instruktioner til DNA-oprensning fra en fytoplasma-inficerede woody værtsplante, forstærkningen af ​​den potentielle effektor, og den efterfølgende identifikation af anlæggets molekylære interaktion partner med en Y2H skærm. Selvom Y2H skærme er almindeligt anvendt, er der en tendens til at outsource denne teknik til biotekvirksomheder, der tilbyder Y2H tjeneste til en pris. Denne protokol giver vejledning i at udføre en Y2H i enhver anstændigt udstyret molekylærbiologisk laboratorium ved hjælp af standard laboratorieteknikker.

Før den egentlige Y2H skærmen kan udføres på krogen skal testes for selv-aktivering. Dette opnås ved at transformere agn ekspressionsvektoren sammen med det tomme bytte bibliotek vektor og kontrol vækst på selektive plader. For at analysere, om phytoplasmal protein ATP_00189 er selv-aktiverende blev selvaktivering test som beskrevet i afsnit 5. agn plasmid supplerer trp og bytte plasmid leu auxotrofien af S. cerevisiae NMY51 40. En vellykket co-transformation er således kendetegnet ved vækst på selektive plader mangler trp og leu. Interaktion af agn og et bytte protein fører til en komplettering af hans og ade auxotrofi af NMY51. Hvis selv-aktivering ved lokkemaden i fravær af en interaktion vises, gæren vokser på selektive plader mangler hans og ade. Stærk og svag selv-aktivering kan forekomme. Stærk selvstændig aktivering af lokkemaden er kendetegnet ved væksten af ​​co-transformeret gær på trp-leu-his-ade depleteret selektionsskåle. Svag selv-aktivering fører til vækst på trp-leu-his, men ikke på trp-leu-his-ade depleteret selektionsskåle. Korrekt positive kontroller er uundværlige for at fortolke resultaterne af selvaktivering assay. Et resumé af de forventede resultater i den selvstændige aktivering assay og deres fortolkning er tilvejebragt i tabel 1 og visualiseret i figur 1. <img alt="figur 1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> Figur 1: Eksempel på Bait Self-aktivering Test af en Bait før Performing en Y2H Screen. S. cerevisiae NMY51 blev co-transformeret med interagerende agn (pLEX-p53) og byttedyr (pACT-indikativpris) som en positiv kontrol (venstre panel: ac), en svagt selvaktiverende plus en tom bytte library vektor (midterste panel: df) og en ikke selv-aktiverende lokkemad plus en tom bytte bibliotek vektor (højre panel: gi). Den co-transformeret gær blev dyrket på SD-plader, der mangler trp og leu (øvre panel: a, d, g), trp, leu og hans (midterste panel: B, E, H) og trp, leu, hans og ade (lavere panel: c, f, i). Selektion på medium uden trp og leu er en positiv kontrol for vellykket co-transformation, som lokkemaden vektor supplerer trp auxotrofi og byttedyr vektor leu auxotrofi af NMY51 (vækst på SD-trp-leu). I tilfælde af en interaktion mellem agn og byttedyr eller en selvstændig aktivering af agn, er reporteren ekspression af NMY51 tændt og supplerer hans og ade auxotrofi (vækst på SD-trp-leu-his-ade). En svag self-aktivering er karakteriseret ved vækst på SD-trp-Leu-hans plader (midterste panel, df). Svag selv-aktivering af en lokkemad skal formindskes forud for analyse lokkemadeni en Y2H skærm, fx ved tilsætning af 3-AT til selektive medier. Aminosyre udtynding er angivet med &quot;-&quot; i de respektive medier navn. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> ingen </td><td> kolonier </td><td> ingen vækst </td><td> ingen vækst </td><td> ingen vækst </td><td> ingen vækst </td></tr><tr><td> ingen </td><td> pGAD-HA </td><td> ingen vækst </td><td> kolonier </td><td> ingen vækst </td><td> ingen vækst </td><td> ingen vækst </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> ingen </td><td> kolonier </td><td> ingen vækst </td><td> ingen vækst </td><td> ingen vækst </td><td> ingen vækst </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> pGAD-HA </td><td> kolonier </td><td> kolonier </td><td&gt; kolonier </td><td> ingen vækst </td><td> ingen vækst </td></tr><tr><td> pLexA-p53 </td><td> pACT-indikativpris </td><td> kolonier </td><td> kolonier </td><td> kolonier </td><td> kolonier </td><td> kolonier </td></tr><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> pGAD-HA </td><td> kolonier </td><td> kolonier </td><td> kolonier </td><td> ingen vækst </td><td> ingen vækst </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Forventede resultater i en Bait Self-aktivering Assay. Omdannelsen af S. cerevisiae NMY51 giver i differential vækst på selektive medier baseret på egenskaberne af co-transformeret agn og bytte. Vækst på selektive plader blev evalueret efter transformation af forskellige vektor-kombinationer (AF) efter 72 timers inkubering ved 30 ° C. Svag selv-aktivering er kendetegnet ved gærvækst på SD-trp-leu-hans og stærk selv-aktivering ved vækst på SD-trp-leu-his-ade udvælgelse plates i mangel af en interaktion partner. Den pLexA-N kodet phytoplasmal effektor ATP_00189 ikke udviser selv-aktivering, som er kendetegnet ved manglende evne til agn vektor transformeret NMY51 at vokse i fravær af hans og ade. Afhængigt af agn, kan en Y2H skærm får talrige gærkloner vokser på selektive plader. Alle kloner skal analyseres og kontrolleres for eventuelle afskedigelser. Selv hvis der er anvendt en normaliseret cDNA bibliotek, er det meget sandsynligt, at en interaktør er repræsenteret i mange forskellige kloner. Afhængigt af biblioteket kloningsteknik, er det også muligt, at kun fragmenter af det fulde gen indsættes i nogle bytte vektorer. Det er således tilrådeligt at de novo amplificere (fra cDNA) og subklone genet i fuld længde af interaktør og at teste interaktion i en en-til-en Y2H analyse (figur 2). <img alt = &quot;Figur 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55.150 / 55150fig2.jpg&quot; /&gt; Figur 2: Eksempel på en interaktion mellem Bait og Prey i en Y2H Experiment. En gær to-hybrid (Y2H) skærm blev udført, og plasmider fra positive interactor kloner blev renset. Den bytte vektor blev sekventeret og Malus x domestica vært interaktion partnere MdTCP24 og MdTCP25 blev identificeret. Som en negativ kontrol MdTCP34 (hvor der ikke interaktør blev identificeret i Y2H biblioteket skærmen) blev subklonet parallelt. Generne fuld længde blev amplificeret fra æble-cDNA, subklonet i bytte vektor (co-cistronically udtrykker det aktiverende domæne AD) og de novo co-transformeret med agn vektor, der udtrykker det bakterielle effektor ATP_00189 koblet til det DNA-bindende domæne (BD). Dette tal er taget fra 28. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se et større</a>version af denne figur.

Watch this Scientific Journal Video about Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen at JoVE.com

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Bakterielle effektor proteiner er vigtige for at etablere succesfulde infektioner. Denne protokol beskriver den eksperimentelle identifikation af proteinholdige bindingspartnere af en bakteriel effektor-protein i dets naturlige plantevært. Identifikation disse effektor interaktioner via gær to-hybrid-skærme er blevet et vigtigt redskab i optrevling molekylære patogenicitet strategier.

Opklaringen af ​​funktion en Bakteriel Effector fra et ikke-dyrkbare Plant patogener Ved hjælp af en Gær To hybrid skærm

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induktion af graft-versus-host sygdom og<em&gt; In Vivo</em&gt; T Cell Monitoring Brug en MHC-matchet murin model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

Kvantificering af svampekolonisering, sporedannelse, og produktionen af ​​mycotoksiner brugen af ​​kernel Bioassays

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Den<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: Undersøgelse Patogen og Host Bidrag til infektiøs colitis

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automatiseret Adskillelse af<em&gt; C. elegans</em&gt; Variabel koloniseret af et bakterielt patogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Afsløring Cortex Fragmenter Under Bakteriel Spore Spiring

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Vurdering Retinal mikrogliaceller fagocytotisk funktion<em&gt; In vivo</em&gt; Brug en flowcytometri-baseret assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Opklaringen af ​​funktion en Bakteriel Effector fra et ikke-dyrkbare Plant patogener Ved hjælp af en Gær To hybrid skærm

Opklaringen af funktion en Bakteriel Effector fra et ikke-dyrkbare Plant patogener Ved hjælp af en Gær To hybrid skærm