Name: unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen
Uploaded: 2017-01-20T13:00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen at JoVE.com

Wir danken Christine Kerschbamer, Thomas Letschka, Sabine Oettl, Margot Raffeiner und Florian Senoner vom Versuchszentrum Laimburg und Mirelle Borges Dias Schnetzer von Dualsystems Biotech AG für die technische Unterstützung und Julia Strobl für das Manuskript Korrektur. Diese Arbeit wurde im Rahmen des APPL2.0 Projekt durchgeführt und wurde von der Autonomen Provinz Bozen / Bolzano, Italien und dem Südtiroler Apfelkonsortium teilweise finanziert.

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Im Y2H Bildschirm wird das Potential Effektor-Protein mit verschiedenen hypothetischen interagierende Proteine ​​(Schritt 7) co-exprimiert wird. Jeder wachsende Hefe Klon enthält den Köder, aber eine (potentiell) unterschiedliche Interaktor. Die interagierenden Proteine ​​werden in einer cDNA-Bibliothek codiert wird, die in die Beute Plasmide kloniert wird. Der Köder und die Beute Plasmide jedes Co-cistronically-Code für einen Teil eines Hefe-Transkriptionsfaktors. Im Falle einer physikalischen Wechselwirkung zwischen Köder (Effektorzellen) und einer Beute plasmid-kodierten Interaktor die beiden Transkriptionsfaktor Teile (die DNA-Bindungsdomäne und die Aktivierungsdomäne) vereinigt sind, und die Expression des Reportergens induziert wird. Die Hefe in der Lage, auf Histidin und Adenin-verarmten SD-Selektionsplatten zu wachsen. Die Art der Beute cDNA-Bibliothek ist abhängig von der abgeschirmten Effektor und muss entsprechend gewählt werden. Die Beute und Köder Vektor, sowie der Hefestamm, müssen kompatibel sein. In diesem Bildschirm Bindung eine LexA DNA-Domäne und die Gal4 Aktivierung domain wurden als kompatibel Hefe-Transkriptionsfaktor-Einheiten eingesetzt. Die cDNA-Bibliothek kann individuell konstruiert werden, nach Maß, oder im Handel erhalten. Die Herstellung der cDNA Beute-Bibliothek ist nicht Teil dieses Protokolls. In diesem Protokoll wird ein selbst erstellter, normalisierte cDNA - Bibliothek aus der RNA von Malus x domestica Blätter verwendet wurde und kloniert in pGAD-HA 41. Der Effektor (Köder) Hefestamm exprimierenden wurde mit der Beute-Bibliothek transformiert, und Klone wurden auf Histidin und Adenin-verarmten SD-Selektionsplatten ausgewählt. Plasmid-DNA aus den Hefekolonien, ein säulenbasierte DNA Plasmid Mini Kit für Bakterien Extrakt in Kombination mit einer mechanischen Störung Schritt unter Verwendung von Glasperlen empfohlen, Hefe Lyse (Schritt 8) verbessern. In diesem Plasmid Reinigung wird der Köder und die Beute Vektor gereinigt in relativ geringen Konzentrationen gleichzeitig werden. Jedoch ist die Menge an Plasmid DNA genug, um das Wechselwirkungspartner durch Sequenzierung wit zu identifizierenhout vor Plasmid Ausbreitung (Schritt 8.4). Als Alternative gereinigte DNA in Schritt 8.4 kann in kompetente E. coli und ausgewählt mit Beute - Vektor-vermittelter Antibiotikaresistenz transformiert werden (zB das Ampicillin bei pGAD-HA). Die ausgewählte E. coli - Kolonien tragen nur die pGAD-HA Bibliothek Plasmid und High-Yield - Plasmid Reinigung kann mit diesen Klonen durchgeführt werden. Auch die erfolgreiche Transformation von pLexA-N und pGAD-HA-Konstrukte ergänzt das Tryptophan und Leucin-Auxotrophie von NMY51. Eine Wechselwirkung zwischen dem Effektor und einem Protein (kodiert auf pGAD-HA) führt zur Aktivierung des Reportersystems in NMY51 Stämmen. Im Fall der Selbstaktivierung, NMY51 mit dem Effektor transformierte pLexA-N in Kombination mit dem leeren Bibliotheksvektor pGAD-HA wächst auf selektiven Platten fehlt trp-leu-his-ade aufgrund der unerwünschten Aktivierung des NMY51 Reportersystems exprimiert 40. Die Selbstaktivierung kann w seineak und in Abwesenheit von trp-leu-his oder die Aktivierung durch Wachstum stark sein kann und dadurch auf trp-leu-his-ade Platten 41 auftreten können. Selbstaktivierung kann einen massiven Hintergrund von falsch-positiven Klonen im eigentlichen Y2H Bildschirm verursachen. Um dies zu vermeiden, muss eine Selbstaktivierungstest mit dem Köder werden durchgeführt, in dem der Effektor-exprimierenden Vektor co-transformiert mit dem leeren Vektor-Bibliothek. In dieser experimentellen Einstellung, Reportergenexpression muss nicht induziert werden. Wenn Selbstaktivierung ( das heißt Wachstum auf selektiven Platten) in dem Test sichtbar ist, kann das Medium mit unterschiedlichen Konzentrationen von 3-Amino-1,2,4-triazol 45 (3-AT) ergänzt werden. 3-AT ist ein Inhibitor der imidazoleglycerol-phosphat - Dehydratase (HIS3), ein Enzym wichtig während Histidinbiosynthese 46. Die Supplementation mit 3-AT können die schwachen Effekte der Selbstaktivierung während Y2H Bildschirme 47, reduzieren48. Verschiedene Konzentrationen von 3-AT sollte getestet werden. In diesem Protokoll, 1-40 mM 3-AT wurden verwendet. Die niedrigste Konzentration, die Selbstaktivierung zur Unterdrückung führt sollten anschließend im Y2H Bildschirm verwendet werden. Die selektiven Platten des Selbstaktivierungstest kann nur dann, wenn die SD-trp-leu-Platten der eine ausreichende Anzahl von Klonen enthalten Cotransformation ausgewertet werden. Als Hinweis ≥ 500 Kolonien pro 90 mm (Durchmesser) Petrischale ausreichend sind. Um die genaue Transfektionseffizienz zu bestimmen, wird empfohlen, serielle Verdünnungen der co-transformierter Hefe herzustellen und sie auf SD-trp-leu-Platten zu verteilen. Selbstaktivierung zu reduzieren, kann der Effektor in pLexA-C geklont werden, ein Köder-Expressionsvektor, der das LexA-Tag an den C-Terminus des Proteins verbindet. Die Orientierung der Lex-A - Tag kann Selbstaktivierung 24 dämpfen. Jedoch ist es nicht möglich, in jedem Falle zu verringern oder zu Selbstaktivierung abzuschaffen. Die Formation derrot oder rötlich Kolonien deutet auf eine schwache oder falsch-positive Interaktion. Der ade2 Reportergen von NMY51 wird nur aktiviert , wenn es um eine Interaktion von Protein-Protein kommt, was wiederum blockiert die Akkumulation eines roten Farbstoffes in diesem Hefestamm 40. In Abwesenheit einer Wechselwirkung sind NMY51 rötlich, während die Kolonien tragenden starke Interaktoren weiß sind. Die Beobachtung der Koloniefarbe auf den Selektionsplatten ist somit ein weiterer wichtiger Hinweis, um zu beurteilen, ob die jeweiligen Kolonien Echt- oder falsch-positiven Interaktoren. Es ist schließlich notwendig, anzupassen oder bestimmte Testeinstellungen ändern in Bezug auf die Art der Köder und die Interaktion Eigenschaften. Mittlerweile wurden eine Reihe von Verbesserungen und derivative Techniken des gemeinsamen Y2H etabliert für die Analyse von sehr schwierig Protein-Interaktionen in verschiedenen Host-Systemen zu ermöglichen. Eine Überprüfung von Stynen et al. 49 Adressen and beschreibt verschiedene Aspekte der Y2H, seine Verbesserungen und Anpassungen und liefert somit wertvolle Informationen darüber, wie die entsprechende Interaktion Test zu wählen. Y2H Bildschirme und abgeleitete Techniken weit verbreitet in verschiedenen Forschungsbereichen eingesetzt werden, wo auch immer Identifizierung von binären Protein-Interaktionen erforderlich ist. Selbst wenn kritische Kontrollen durchgeführt werden, wie beispielsweise Selbstaktivierungstests des Köders und ein-zu-eins - Wieder Transformationen der identifizierten interagierende Proteine, die Y2H anfällig falsche Ergebnisse liefern 26, 50, 51. Die Hefe als Modell für alle Interaktionsstudien nicht geeignet. Hefe nicht notwendigerweise eine zelluläre Umgebung dar, die die entsprechende posttranslationale Modifikation und Faltung für jedes 24 - Protein unterstützt. Weiterhin ist in der Y2H Einstellung werden die Proteine ​​überexprimiert, und ihre Expression ist nicht die Kontrolledurch ihren natürlichen Promotor führte. Die Y2H zwingt die proteinösen Bindungspartner an den Zellkern, die nicht notwendigerweise ihre natürliche subzellulären Ziel. Die nativen zellulären Umstände der Interaktion kann somit nicht von der Hefe reflektiert werden und zu falsch negativen oder falsch-positiven Ergebnissen führen kann. Die meisten Y2H werden auf Hefe-Auxotrophie Komplementation als selektives Prinzip. Diese Ernährungs Auswahl wird durch eine hohe Empfindlichkeit aus, aber auf Kosten einer verringerten Selektivität im Vergleich zu anderen (beispielsweise chromogene reporter) -Assays 49. Wenn unreducible Selbstaktivierung (siehe oben) oder andere Beschränkungen auftreten , für eine bestimmte Effektorfunktion ist die Y2H kein geeigneter Test 25. In Tabelle 1 und Abbildung 1, die erwarteten Ergebnisse des Selbstaktivierungstest gegeben. Das Fehlen von realen Interaktionen (dh falsche Negative) durch Protein Toxizität, fehlerhafte translationale Protein verursacht werdenVerarbeitung, sterische Hinderung der Interaktion, unterrepräsentierte Interaktionspartner in der Beute Bibliothek, Membranlokalisierung des Köders oder fehlenden Komponenten , die für die Interaktion 24. Es wird empfohlen, de novo verstärken das Volllängen - Gen des identifizierten interagierenden Proteins aus cDNA, subklonieren es in pGAD-HA, und führen eine Eins-zu-Eins - Wechselwirkungsassay die erzeugte pGAD-HA - Konstrukt in den Köder-exprimierenden durch Transformieren NMY51 Stamm. Dies ist notwendig, da die beobachtete Interaktors in dem Beute-Bibliothek nur ein Fragment eines größeren Proteins sein könnte. Jedoch ist die Information für die jeweiligen Volllängen-Gen nur zugänglich, wenn beträchtliche genomischen und transkriptomischen Sequenzdaten verfügbar sind. Das Transformationsprotokoll für das Selbstaktivierungstest hier beschrieben sind, können für eine solche Eins-zu-Eins-Assays angewendet werden, und die Wechselwirkung zwischen dem Bait und dem Interaktor reproduzierbar sein müssen. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Wechselwirkungen in einem Y2H Bildschirm identifiziert muss immer von einer anderen unabhängigen Technik bestätigt werden. Diese unabhängige Technik muss auf die natürliche Umgebung des eigentlichen Protein-Protein-Wechselwirkung näher sein. In dem Fall des phytoplasmal Effektor ATP_00189 wurde die Wechselwirkung mit den TCP - Transkriptionsfaktoren von Malus x domestica in planta mit bimolekularen fluoreszierendes Komplementation (BiFC) in Nicotiana benthamiana prüft Protoplasten 28 (nicht Teil des Protokolls). Der Effektor-Protein ATP_00189 wurde aus der Pflanze Erreger P. mali abgeleitet. In planta BIFC wurde somit ATP_00189 Wechselwirkungen mit den Malus x domestica Transkriptionsfaktoren zu überprüfen gewählt zuvor in dem Y2H 28 identifiziert. BiFC ist ein Protein-Protein-Interaktionsassay, der nicht die subzelluläre Translokation der interagierenden Proteine ​​in den Zellkern, um das Reportersystem zur Aktivierung erfordert &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 52. Darüber hinaus ahmt die in planta - Expression und Modifikation Maschinen die Umgebung der natürlichen Interaktion zwischen Pflanze bakterielle Effektor in seiner Wirtspflanze. Allerdings ist ein globaler Bildschirm BIFC mit nicht durchführbar ist. Es gibt mehrere Schritte in dem Protokoll, das sorgfältig behandelt werden müssen. Wenn das Gen von Interesse zu verstärken (Schritt 4), ist es wichtig zu bestimmen, dass Primer an Pflanzen-DNA binden. Somit DNA aus nicht-infizierten Pflanzen müssen als negative Kontrolle einbezogen. Die Sequenz des Gens von Interesse nicht enthalten die EcoRI und SalI-Restriktionsstellen, die für die gerichtete Klonierung des Einsatzes verwendet werden. Wenn die Sequenz diese Seiten enthält, müssen verschiedene Restriktionsenzyme für das Klonen ausgewählt werden. Hefe-Transformation ist eine zentrale Methode während dieses Protokolls. Die Transfektionseffizienz ist abhängig von der Kompetenz der Hefezellen, ihre Lebensfähigkeit, den Wachstumszustand, und die Qualität der Transfektion REAGent 53, 54. Für das vorgeschlagene Protokoll wird dringend empfohlen, Hefe zu verwenden, die aus frischen Platten nicht älter als zwei Wochen (gehalten bei 4 ° C), wenn die Transformationen durchführen. Oft wird das Wachstum der transformierten Hefe verzögert, wenn selektive Flüssigkulturen mit Kolonien aus alten Agarplatten inokuliert. Es ist auch hilfreich, um eine flüssige Starterkultur als Inokulum für den tatsächlichen Experimente zu verwenden und nicht die Hefe von der Platte direkt zu verwenden. Geringe Effizienz bei der Transfektion der Beute in den Köder-exprimierenden Hefe kann auf die Unterrepräsentation bestimmter Beuteproteine ​​(potentielle Interaktionspartner) führen und den gesamten Bildschirm so schräg kann. In diesem Protokoll wird ein Hefe-Transfektionseffizienz von ~ 150.000 cfu / &amp; mgr; g DNA transfiziert in der Y2H funktionierte gut. die Mängel und Nachteile des Y2H Technik zu kennen und die Ergebnisse in einer kritischen und in geeigneter Weise zu interpretieren ist unverzichtbar, um die korr Zeichnungect Schlussfolgerungen. Y2H Assays und die Derivate werden seit vielen Jahren verwendet und haben viele Verbesserungen und Anpassungen in Bezug auf die verschiedenen Ködercharakteristik, die subzelluläre Lokalisierung der Wechselwirkung, die erwarteten Bindungspartner und andere Faktoren unterzogen, die für die Interaktion erforderlich sein könnten (siehe Y3H 55, 56, 57). Vor kurzem Array-basierten Y2H Bildschirme entwickelt worden, die für automatisierte Hochdurchsatz - Analyse zahlreicher Ködern gegen Millionen preys 58 ermöglichen. Die Zukunft liegt höchstwahrscheinlich in der Automatisierung und Hochdurchsatz-Ansätze zu diesem Test für die Aufklärung komplexer Signalwege und Interaktom in verschiedenen Forschungsbereichen zu ermöglichen.

<html> Hefe - Zwei-Hybrid - Screens (Y2H) wurden 1 vor etwa 27 Jahren entwickelt und haben seitdem breite Anwendung in verschiedenen Gebieten verwendet worden , um spezifische Protein-Protein - Wechselwirkungen zu bestimmen , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 . Die physikalische Wechselwirkung eines bakteriellen Effektor mit einem Host-Zielprotein ist oft Voraussetzung für die funktionelle Manipulation dieses Zielproteins. Diese Interaktionen analysieren hat in den Fokus der vielen verschiedenen Bereichen der Infektion 12 Biologie bewegt, 13, 14, 15,&quot;&gt; 16, 17, 18. Das Prinzip des Y2H Bildschirm ist , dass die Wechselwirkung der beiden Proteine in die Rekonstitution eines funktionellen Transkriptionsfaktors führt, der die Expression von Reportergenen antreibt. Die bekannte Effektor (der&quot; Köder &quot;) translatorisch verschmolzenen an die DNA-Bindungsdomäne (DBD) des Transkriptionsfaktors, und die möglichen Wechselwirkungspartner (die &quot;Beute&quot;) an die Aktivierungsdomäne (AD) der jeweiligen Transkriptionsfaktor fusioniert ist. Da der Wechselwirkungspartner unbekannt ist, eine Bibliothek von potentiellen Interaktoren in die so genannte geklont &quot;Beute-Bibliothek&quot;. Normalerweise diese Bibliothek durch Klonieren von cDNAs in einen geeigneten Beute-Vektor Expressionsplasmid codierend das AD hergestellt ist, die mit dem Köder-Vektor kodiert DBD. bei einer Wechselwirkung kompatibel ist, die rekonstituiert Transkriptionsfaktoren die Expression von Reportergenen, induzieren, die im allgemeinen das Wachstum von Hefe-Auswahl zu ermöglichen. dieIdentifizierung der Interaktionspartner wird durch die Sequenzierung der Beute Plasmid mit Plasmid-spezifischen Primer erreicht. Bakterien haben verschiedene Strategien entwickelt , zu manipulieren und ihre Host-Stoffwechsel verwerten oder Abwehrmechanismen zu umgehen und Effektor - Molekülen über verschiedene Bakterien Sekretion Systeme 19, 20, 21 absondern. die Bindungspartner dieser bakteriellen Effektoren bestimmen, ist daher der erste Schritt in der Stellweges in dem Host zu identifizieren. Dies führt zu einem verbesserten Verständnis der spezifischen Mechanismen Pathogenität. Y2H Bildschirme werden durchgeführt , bakterielle Effektor Interaktionen während phytoplasmoses zu identifizieren, und oft ist ein entscheidender Y2H anfänglichen Experiment zur weiteren Charakterisierung der molekularen Mechanismen Pathogenität in phytoplasma Forschung 22, 23. Doch das trafin den meisten Publikationen hod Beschreibung ist eher selten, und diese Techniken werden oft an Biotech-Unternehmen ausgelagert. Um die Aufmerksamkeit auf die Durchführbarkeit dieses Verfahrens zeichnen, dieses Protokoll liefert eine Schritt-für-Schritt-Informationen Interaktionspartner eines bakteriellen Effektor-Molekül in seinem natürlichen Wirt identifizieren. Trotz der breiten Nutzung und den schnellen Vorlauf Ansatz von Y2H Bildschirme, darf nicht vergessen werden, dass bestimmte Interaktionen nicht in der Hefe-System auftreten könnten. Dies ist aufgrund der Tatsache , dass die Hefezelle als eine Art von &quot;in vivo Reaktionsbehälter&quot; mit bestimmten biologischen Einschränkungen verwendet. Mehrere Autoren haben die Vor- und Nachteile von Y2H und seine Derivate 11, 24, 25, 27 26, gerichtet. Allgemeine Überlegungen sind beispielsweise, dass die Hefezelle nicht die entsprechende bieten könnteGenexpression, (post-) translationale oder translocational Bedingungen für die jeweiligen Proteine ​​untersucht. Dies kann auf dem Bildschirm zu falsch negativen Ergebnissen führen. Positive Wechselwirkungen können wiederum Artefakte und in der natürlichen Situation (dh im Fall von Effektoren in den geeigneten Wirt) auftreten , möglicherweise nicht. Es ist daher unerlässlich, um die Wechselwirkungen von der heterologen Hefe-Expressionssystem mit einem unabhängigen Interaktionstest in einem eng verwandten biologischen Systems zu bestätigen. In dieser Studie wurden identifiziert die Bindungspartner der Effektor ATP_00189 aus dem nicht-kultivierbaren Pflanze Erreger Candidatus Phytoplasma mali (P. mali). Die Ergebnisse liefern wichtige Einblicke in die molekularen Mechanismen , die Symptomentwicklung von Apple proliferation zugrunde liegenden 28, eine Krankheit , die hohe wirtschaftliche Verluste in den betroffenen Apfelanbauregionen in Europa 29 verursacht.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1514">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:565px;">Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:211px;">Applichem</td>
			<td style="width:324px;">A6284</td>
			<td style="width:415px;">for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trishydroxymethylaminomethane (Tris)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodiumchloride (NaCl)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2942</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2937</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">N-Lauroylsarcosin sodium salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A7402</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ammonium acetate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>9688</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1108</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3928</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>51976</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNAse</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2760</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chloroform:Isoamyl 24:1</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1935</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proofreading Polymerase (e.g. iProof)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>203433</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EcoRI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SalI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0641</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1493</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td>for self-activation assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Arginine Monohydrochloride&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3680</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Isoleucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3642</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-lysine Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3448</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Methionine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3897</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Phenylalanine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3464</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Threonine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3946</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tyrosine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3401</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Uracile</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0667</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Valine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3406</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Adenine Hemisulfate Salt&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1596</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.22 &#181;m Pore Filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16541</td>
			<td>for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Histidine Monohydrochloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3719</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Leucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3496</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tryptophane&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3410</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Nitrogen Base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51483</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1349</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-1</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peptone</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2208</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyethylene Glycol 4000 (PEG)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1249</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3478</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Salmon Sperm DNA&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2159</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-719</td>
			<td>for Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PLN350</td>
			<td>for plasmid purification from yeast and bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acid Washed Glass Beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>for plasmid purification from yeast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0839</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Extract</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1552</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z368245 (Sigma)</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bait vector (e.g. pLexA-N)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Prey vector (e.g. pGAD-HA)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control prey vector (e.g. pLexA-p53)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control bait vector (e.g. pACT-largeT)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C640003</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3&#916;200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>676 051</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td>for quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free)</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2500010</td>
			<td>for PCR and DNA works</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpell</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0301</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile filter (0.22 &#181;m; Polyethersulfone))</td>
			<td>VWR-International</td>
			<td>514-0073 (European Catalogue number)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 90 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633180</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 150 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>639161</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer (e.g. BioPhotometer)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>550507804</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WB7</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Western Blot Equipment</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>diverse</td>
			<td>for protein detection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dNTPs</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2201210</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 ml; 1000 ml; 2000 ml) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z232793, Z232858, Z232866</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaking Incubator (e.g. GFL 3031)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3031</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>KB 53 (E3.1)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825)</td>
			<td>Omniwash</td>
			<td>IF 825</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2 ml, 1.5 ml and 2.0 ml Reaction Vials (Polypropylene)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10-1000 &#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>diverse</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SPR-L-S01</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3617000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T4-Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fridge (4&#176;C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>81.767.580.4</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Freezer (-20&#176;C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>G5216</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Graduated Cylinder (e.g. Brand)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z327352; Z327417; Z327441&#160;&#160;</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S55701</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2)</td>
			<td>Integra-Biosciences</td>
			<td>155000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cuvettes for Electroporation (1 mm)</td>
			<td>Molecular Bio Products</td>
			<td>5510-11</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electroporator (e.g. Eporator)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 ml)</td>
			<td>VWR-International&#160;</td>
			<td>525-0403 (European Catalogue number)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 ml)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dithiothreitol (DTT, e.g. DTT, 1M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM))</td>
			<td>Ambion&#160;</td>
			<td>AM8110G (distributed by Thermo Scientific)</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2021 Sigma&#160;</td>
			<td>for yeast culture (ready-made mix)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen

Die Entwirrung der molekularen Mechanismen der Krankheitsmanifestationen ist wichtig, Pathologien und Symptomentwicklung in der Pflanzenwissenschaft zu verstehen. Bakterien haben verschiedene Strategien entwickelt, ihre Wirts Stoffwechsel zu ihrem eigenen Vorteil zu manipulieren. Diese bakterielle Manipulation ist oft verbunden mit schweren Symptomentwicklung oder dem Tod der betroffenen Pflanzen. Die Bestimmung der spezifischen bakteriellen Moleküle verantwortlich für die Host-Manipulation ist ein wichtiger Bereich in der mikrobiologischen Forschung geworden. Nach der Identifizierung dieser Bakterien-Moleküle, die sogenannten &quot;Effektoren&quot;, ist es wichtig, ihre Funktion aufzuklären. Ein einfacher Ansatz die Funktion eines Effektor zu bestimmen, ist seine proteinösen Bindungspartner in seinem natürlichen Wirt über eine Hefe-Zwei-Hybrid (Y2H) Bildschirm zu identifizieren. Normalerweise birgt der Host zahlreiche potentielle Bindungspartner , die nicht ausreichend durch ein beliebiges in silico - Algorithmus vorhergesagt werden kann. Es ist daher die beste Wahl, um perform einen Bildschirm mit dem hypothetischen Effektor gegen eine ganze Bibliothek von exprimierten Wirtsproteine. Es ist besonders schwierig, wenn der Erreger wie phytoplasma kultivierbaren ist. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die DNA-Aufreinigung aus einem phytoplasma-infizierten holzig Wirtspflanze, die Verstärkung des potentiellen Effektor, und die anschließende Identifizierung der molekularen Interaktionspartner der Anlage mit einem Y2H Bildschirm. Obwohl Y2H Bildschirme häufig verwendet werden, gibt es einen Trend, diese Technik zu Biotech-Unternehmen auszulagern, die den Y2H Service zu einem Preis anbieten. Dieses Protokoll bietet Anweisungen, wie ein Y2H in jedem anständig ausgestatteten molekularbiologischen Labor unter Verwendung von Standardlabortechniken auszuführen.

Vor dem eigentlichen kann Y2H Bildschirm der Köder durchgeführt werden müssen für Selbstaktivierung getestet werden. Dies wird durch die Umwandlung der Köder Expressionsvektor zusammen mit dem leeren Beute Bibliothek Vektor und Überprüfung Wachstum auf selektiven Platten erreicht. Um zu analysieren , ob die phytoplasmal Protein ATP_00189 selbstaktivierende ist, wurde die Selbstaktivierung Test in Abschnitt 5. Der Köderplasmid ergänzt den trp und die Beute Plasmid , das das leu Auxotrophie von S. cerevisiae NMY51 40 wie beschrieben durchgeführt. Eine erfolgreiche Co-Transformation wird also durch Wachstum auf selektiven Platten fehlen trp und leu gekennzeichnet. Die Wechselwirkung des Köder und Beute-Protein führt zu einer Komplementierung der seine und ade Auxotrophie von NMY51. Wenn Selbstaktivierung durch den Köder in der Abwesenheit einer Wechselwirkung auftritt, wächst die Hefe auf selektiven Platten seiner und ade fehlt. Starke und schwache SelbstAktivierung auftreten. Starke Selbstaktivierung des Köders wird durch Wachstum des co-transformierte Hefe auf trp-leu-his-ade abgereicherten Selektionsplatten gekennzeichnet. Schwache Selbstaktivierung führt zu Wachstum auf trp-leu-his aber nicht auf trp-leu-his-ade abgereicherten Selektionsplatten. Die richtige positive Kontrollen sind unverzichtbar für die Ergebnisse der Selbstaktivierungstest zu interpretieren. Eine Zusammenfassung der erwarteten Ergebnisse der Selbstaktivierungstest und deren Interpretation ist in Tabelle 1 und visualisiert in Abbildung 1 zur Verfügung gestellt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> Abbildung 1: Beispiel von Bait Selbstaktivierung Tests eines Bait Bevor ein Y2H Bildschirm durchführen. S. cerevisiae NMY51 wurde co-transformiert mit zusammenwirkenden Köder (pLEX-p53) und Beute (PACT larget) als eine positive Kontrolle (linkes Bild: ac), einem schwach selbstaktivierende plus eine leere Beute library - Vektor (Mitteltafel: df) und eine nicht selbstaktivierende Köder plus eine leere Beute Bibliothek Vektor (rechtes Bild: gi). Die Co-transformierten Hefe wurden auf SD - Platten fehlen trp und leu (oberes Bild: a, d, g), trp, leu und sein (Mitteltafel: b, e, h) und trp, leu, sein und ade (unterer Panel: c, f, i). Die Auswahl auf Medium ohne trp und leu ist eine positive Kontrolle für die erfolgreiche Co-Transformation, wie der Köder Vektor, der das trp Auxotrophie und die Beute Vektor der leu Auxotrophie von NMY51 (Wachstum auf SD-trp-leu) ergänzt. Im Falle einer Wechselwirkung zwischen Köder und Beute oder eine Selbstaktivierung des Köders wird der Reporterexpression von NMY51 eingeschaltet und ergänzt die His- und ade Auxotrophie (Wachstum auf SD-trp-leu-his-ADE). Ein schwaches Selbstaktivierung wird durch Wachstum auf SD-trp-leu-his - Platten (Mitteltafel, df) gekennzeichnet. Schwache Selbstaktivierung eines Köders müssen für die Analyse der Köder vor vermindert werdenin einem Y2H Bildschirm, zum Beispiel durch Zugabe von 3-AT zur selektiven Medien. Aminosäure Depletionen sind angegeben mit &quot;-&quot; in den jeweiligen Mediennamen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> keiner </td><td> Kolonien </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td></tr><tr><td> keiner </td><td> pGAD-HA </td><td> kein Wachstum </td><td> Kolonien </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> keiner </td><td> Kolonien </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> pGAD-HA </td><td> Kolonien </td><td> Kolonien </td><td&gt; Kolonien </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td></tr><tr><td> pLexA-p53 </td><td> PACT larget </td><td> Kolonien </td><td> Kolonien </td><td> Kolonien </td><td> Kolonien </td><td> Kolonien </td></tr><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> pGAD-HA </td><td> Kolonien </td><td> Kolonien </td><td> Kolonien </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Erwartete Ergebnisse in einem Bait Selbstaktivierungstest. Die Transformation von S. cerevisiae NMY51 ergibt in Differential Wachstum auf Selektivmedien basierend auf den Eigenschaften von cotransformiert Köder und Beute. Wachstum auf selektiven Platten wurde bei 30 ° C nach der Transformation von verschiedenen Vektor-Kombinationen (af) nach 72 h Inkubation ausgewertet. Schwache Selbstaktivierung wird durch das Wachstum der Hefe auf SD-trp-leu-his und starke Selbstaktivierung durch Wachstum auf SD-trp-leu-his-ade Auswahl plat gekennzeichnetes in Abwesenheit eines Interaktionspartner. Die pLexA-N kodierten phytoplasmal Effektor ATP_00189 zeigt keine Selbstaktivierung, die durch die Unfähigkeit des Bait-Vektor gekennzeichnet ist NMY51 transformiert in Abwesenheit seines und ADE zu wachsen. Je nach dem Köder kann ein Y2H Bildschirm zahlreiche Hefe-Klone wachsen auf selektiven Platten gewinnen. Alle Klone müssen für mögliche Redundanzen analysiert und geprüft werden. Selbst wenn eine normalisierte cDNA-Bibliothek verwendet worden ist, ist es sehr wahrscheinlich, dass ein Interaktors in vielen verschiedenen Klone repräsentiert wird. In Abhängigkeit von der Bibliothek Klonierungstechnik ist es auch möglich, daß nur Fragmente des vollständigen Gens in einigen Beutevektoren eingefügt werden. Es ist daher ratsam, die de novo verstärken (von cDNA) und subklonieren das Gen voller Länge des Interaktors und die Interaktion zu testen in einer Eins-zu-Eins - Y2H Analyse (Abbildung 2). <img alt = &quot;2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55150 / 55150fig2.jpg&quot; /&gt; Abbildung 2: Beispiel einer Wechselwirkung zwischen Köder und Beute in einem Y2H Experiment. Ein Hefe-Zwei-Hybrid (Y2H) Bildschirm wurde durchgeführt, und Plasmide, die aus positiven Interaktor Klone wurden gereinigt. Die Beute Vektor wurde sequenziert und die Host - Interaktionspartner Malus x domestica MdTCP24 und MdTCP25 wurden identifiziert. Als Negativkontrolle MdTCP34 (für die keine Interaktor in der Y2H Bibliothek Bildschirm identifiziert) wurde parallel subkloniert. Die volle Länge Gene wurden aus Apfel cDNA amplifiziert, subkloniert in dem Beute - Vektor (co-cistronically der Aktivierungsdomäne AD exprimierenden) und de novo co-transformiert mit dem Bait - Vektor des bakteriellen Effektor ATP_00189 an die DNA - Bindungsdomäne (BD) gekoppelt ausdrückt. Diese Zahl wird von 28 genommen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier ein</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">um zu vergrößern</a>Version dieser Figur.

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Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Bakterielle Effektor-Proteine ​​sind wichtig für den Aufbau erfolgreicher Infektionen. Dieses Protokoll beschreibt die experimentelle Identifizierung von proteinösen Bindungspartner eines bakteriellen Effektor-Protein in seiner natürlichen pflanzlichen Wirt. Die Identifizierung dieser Effektor - Wechselwirkungen über Hefe - Zwei-Hybrid - Screens ist ein wichtiges Instrument in entwirren molekularen Pathogenität Strategien werden.

Die Entwirrung der Funktion eines bakteriellen Effektor aus einem nicht-kultivierter Pflanzenschädling eine Hefe mit Zwei-Hybrid-Screen

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