Name: unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen
Uploaded: 2017-01-20T13:00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen at JoVE.com

אנו מודים כריסטין Kerschbamer, תומאס Letschka, סבין Oettl, מרגוט Raffeiner, ופלוריאן Senoner ממרכז המחקר Laimburg ו Mirelle בורחס Dias Schnetzer מ Dualsystems ביוטק AG לתמיכה טכנית ג&#39;וליה סטרובל להגהה את כתב היד. עבודה זו בוצעה כחלק הפרויקט APPL2.0 ו מומנה בחלקה על ידי המחוז האוטונומי של בוזן / Bolzano, איטליה ואת Consortium אפל דרום-טירולי.

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

במסך Y2H, החלבון מפעיל הפוטנציאל הוא שיתוף הביע עם חלבונים אינטראקציה היפותטי שונים (שלב 7). כל כפיל שמרים גדל מכיל את הפיתיון אלא interactor שונה (בפוטנציה). חלבוני האינטראקציה מקודדים בתוך ספריית cDNA כי הוא משובט לתוך פלסמידים טרף. הפיתיון ואת טרף פלסמידים כל קוד שיתוף cistronically עבור חלק גורם שעתוק שמרים. במקרה של אינטראקציה פיזית בין הפיתיון (מפעיל) וכן interactor פלסמיד מקודד טרף, חלקים גורמים שני שעתוק (התחום מחייב DNA ואת תחום ההפעלה) מאוחדים, וביטוי גן הכתב מושרה. השמרים הם מסוגלים לגדול על צלחות מבחר histidine- ו אדנין המדולדל SD. הסוג של ספריית cDNA טרף תלוי המפעיל הוקרן צריך להיבחר בהתאם. וקטור טרף פיתיון, כמו גם זן השמרים, חייב להיות תואם. במסך זה, ה- DNA LexA מחייב מושלם ואת domai ההפעלה Gal4n שמש יחידות גורמות שעתוק שמרים התואמות. ספריית cDNA ניתן לבנות בנפרד, בהתאמה אישית, או שהושג באופן מסחרי. הכנת ספריית טרף cDNA אינה חלק של פרוטוקול זה. בפרוטוקול זה, ספריית cDNA בהקמה עצמית, מנורמלת מן RNA של עלי domestica x Malus שמשה ו משובטת לתוך pGAD-HA 41. המפעיל (פיתיון) -expressing זן שמרים הפך עם הספרייה הטרפה, ומשכפל נבחר על צלחות מבחר histidine- ו אדנין המדולדל SD. כדי לחלץ DNA פלסמיד מן המושבות שמרים, ערכת מיני פלסמיד דנ&quot;א טור לחיידקים מומלץ בשילוב עם צעד הפרעה מכנית באמצעות חרוזי זכוכית לשפר תמוגה שמרים (שלב 8). בשנת טיהור פלסמיד זה, את הפיתיון וקטור טרף יהיה מטוהרים במקביל בריכוזים נמוכים יחסית. עם זאת, כמות ה- DNA פלסמיד הוא מספיק כדי לזהות את השותף אינטראקציה באמצעות שנינות רצףHout לפני התפשטות פלסמיד (שלב 8.4). כחלופה, ה- DNA מטוהר בשלב 8.4 ניתן להפוך חיידק מוכשר שנבחר עם עמידות לאנטיביוטיקה בתיווך וקטור טרף (למשל, אמפיצילין במקרה של pGAD-HA). .ה שנבחרה coli מושב לשאת רק את הפלסמיד ספריית pGAD-HA, וטיהור פלסמיד תשואה גבוהה יכולה להתבצע עם שיבוטים אלה. השינוי המוצלח של pLexA-N ו- pGAD-HA בונה משלים את טריפטופן לאוצין auxotrophy של NMY51. אינטראקציה בין המפעיל לבין חלבון (מקודד על pGAD-HA) מוביל ההפעלה של מערכת כתב NMY51 זנים. במקרה של הפעלה עצמית, NMY51 טרנספורמציה עם המפעיל להביע pLexA-N בשילוב עם וקטור הספרייה הריק pGAD-HA גדל על צלחות סלקטיבית חסרות TRP-Leu-שלו-ADE, בשל ההפעלה הרצויה של מערכת כתב NMY51 40. The-ההפעלה העצמית יכולה להיות weak ויכול להתרחש בהיעדר TRP-Leu-שלו, או את ההפעלה יכולה להיות חזקה התאפיינה בגידול על TRP-Leu-שלו-ADE צלחות 41. עצמית הפעלה יכולה לגרום רקע מסיבי של שיבוטים חיוביים שגויים מסך Y2H בפועל. כדי למנוע זאת, מבחן עצמי ההפעלה עם הפיתיון חייב להתנהל, שבו וקטור להביע מפעיל הוא טרנספורמציה שיתוף עם וקטור הספרייה הריקה. בהגדרה זו ניסיוני, ביטוי גני כתב אסור להיגרם. אם הפעלה עצמית (כלומר, צמיחה על צלחות סלקטיבית) גלויה את הבדיקה, המדיום יכול להיות השלים עם ריכוזים שונים של 3-אמינו-1,2,4-triazole 45 (3-AT). 3-AT הוא מעכב של dehydratase imidazoleglycerol-פוספט (HIS3), אנזים חשוב במהלך ביוסינתזה היסטידין 46. תוספת של 3-AT יכולה להפחית את ההשפעות החלשות של הפעלה עצמית במהלך מסכי Y2H 47,48. ריכוזים שונים של 3-AT צריכים להיבדק. בפרוטוקול זה, 1 - 40 מ&quot;מ 3-AT שמש. הריכוז הנמוך ביותר שמוביל לדיכוי של הפעלה עצמית צריך לאחר מכן לשמש מסך Y2H. הצלחות סלקטיבית של assay עצמית ההפעלה ניתן יהיה להעריך רק אם צלחות SD-TRP-Leu של שיתוף טרנספורמציה לכלול מספר מספיק של שיבוטים. בתור ≥ אינדיקציה 500 מושבות בכל 90 מ&quot;מ (קוטר) בצלחת פטרי מספיקות. כדי לקבוע את יעילות transfection המדויקת, מומלץ להכין דילולים סידוריים של שמרי שיתוף טרנספורמציה להפיץ אותם על צלחות SD-TRP-Leu. כדי לצמצם את תופעת הפעלה עצמית, המפעיל ניתן לשכפל לתוך pLexA-C, וקטור ביטוי פיתיון, המשלב את תג LexA אל C- הסופי של החלבון. האוריינטציה של תג לקס-A יכול להחליש הפעלה עצמית 24. עם זאת, אין זה אפשרי בכל מקרה להפחית או לבטל הפעלה עצמית. היווצרותמושבות אדומות או אדמדמות מצביעות על אינטראקציה חלשה או חיובית-כוזבת. גן כתב ade2 של NMY51 מופעל רק כאשר מדובר על אינטראקציה בין חלבונים, אשר בבלוקים בתורו ההצטברות של צבע אדום זן שמרים זה 40. בהעדר אינטראקציה, NMY51 הם אדמדם, ואילו מושבות נושאת interactors החזק לבנות. התצפית של צבע המושבה על צלחות בחירה ובכך מספקת רמז חשוב נוסף לשפוט אם מושבות בהתאמה הם interactors true- או חיוביות שגויות. זה בסופו של דבר צורך להתאים או לשנות את גדרות assay מסוימות ביחס לאופי הפיתיון ואת מאפייני האינטראקציה. בשלב זה, מספר השיפורים וטכניקות הנגזרות של Y2H המשותף הוקם כדי לאפשר הניתוח של אינטראקציות חלבון קשות למדי במערכות מארחת שונות. סקירה על ידי ואח Stynen. 49 מטפלnd מתאר היבטים שונים של Y2H, השיפורים שלה, ועיבודים, ובכך מספק מידע שימושי על איך לבחור את assay לאינטראקציה הנאות. מסכי Y2H וטכניקות נגזרות הפכו בשימוש נרחב בתחומי מחקר שונים, בכל המקום בו זיהוי של אינטראקציות חלבון בינארי נדרש. גם אם מבוצעים בקרות קריטיות, כגון בדיקות עצמי הפעלה של פיתיון אחד-על-אחד מחדש טרנספורמציות של חלבוני אינטראקציה המזוהה, Y2H נוטה לייצר תוצאות שווא 26, 50, 51. השמרים כמודל הוא לא מתאים לכל מחקרי האינטראקציה. שמרים אינם מהווים בהכרח בסביבת הסלולר שתומכת שינוי שלאחר translational המתאים וקיפול של כל חלבון 24. יתר על כן, בקביעת Y2H, החלבונים הם ביטוי יתר, והבעית שאינם שליטהבראשות האמרגן הטבעי שלהם. Y2H מאלץ שותפי האינטראקציה חלבוניים לגרעין, אשר אינו בהכרח יעד subcellular הטבעי שלהם. הנסיבות הסלולר יליד האינטראקציה ובכך לא יבואו לידי ביטוי על ידי שמרים עשוי להוביל לתוצאות false-negative או חיוביות שגויות. רוב Y2H מבוססים על השלמה שמרים auxotrophy כעיקרון סלקטיבית. מבחר תזונתי זה מאופיין רגישות גבוהה, אך במחיר של הסלקטיביות ירד לעומת אחרים (למשל, כתב chromogenic) מבחנים 49. אם הפעלה עצמית unreducible (ראה לעיל) או מגבלות אחרות להתרחש עבור מפעיל מסוים, Y2H אינו assay מתאים 25. בלוח 1 ואיור 1, התוצאות הצפויות של מבחן ההפעלה העצמית מקבלות. היעדרם של אינטראקציות ריאליות (כלומר, שליליים שגוי) יכול להיגרם על ידי רעילות חלבון, חלבון translational שגוי<html> עיבוד, הפרעה סטרית של אינטראקציה, שותפים אינטראקציה מיוצגות כראוי בספרייה טרף, לוקליזציה קרום של הפיתיון, או חסר כל המרכיבים הדרושים על האינטראקציה 24. מומלץ דה נובו להגביר את הגן באורך מלא של חלבון אינטראקציה זיהה מן cDNA, subclone אותו pGAD-HA, ולבצע assay אינטראקציה אחד-על-אחד על ידי הפיכת pGAD-HA שנוצר לבנות לתוך הפיתיון להביע זן NMY51. זה הכרחי מאז נצפה interactor הנוכחי בספריית הטרף יכול רק להיות שבר של חלבון גדול. עם זאת, המידע עבור הגן באורך מלא בהתאמה נגיש רק אם נתוני רצף גנומי transcriptomic ניכרים זמינים. פרוטוקול טרנספורמציה עבור assay העצמית ההפעלה המתוארת כאן יכול להיות מיושם על כזה assay אחד-על-אחד, ואת האינטראקציה בין הפיתיון ואת interactor חייבת להיות לשחזור. תחת = &quot;jove_content&quot;&gt; אינטראקציות מזוהות מסך Y2H חייב תמיד להיות מאושרים על ידי טכניקה נוספת עצמאית. טכניקה עצמאית זה חייבת להיות קרובה יותר בסביבה הטבעית של האינטראקציה בין החלבונים בפועל. במקרה של ATP_00189 מפעיל phytoplasmal, האינטראקציה עם גורמי שעתוק TCP של domestica x Malus אומתה planta עם השלמה פלורסנט bimolecular (BiFC) ב ניקוטיאנה benthamiana פרוטופלאסט 28 (לא חלק של פרוטוקול זה). ATP_00189 חלבון מפעיל נגזרה מאלי פ הפתוגן צמח. ב Planta BiFC ובכך נבחר כדי לאמת אינטראקציות ATP_00189 עם גורמי שעתוק domestica x Malus בעבר שזוהו Y2H 28. BiFC הוא assay אינטראקציה בין חלבונים שאינו דורש טרנסלוקציה subcellular של חלבוני אינטראקציה לגרעין כדי להפעיל את מערכת הכתב &lt;sup class = &quot;Xref&quot;&gt; 52. יתר על כן, ב Planta הביטוי ומכונה שינוי מחק את הסביבה של האינטראקציה הטבעית בין מפעיל חיידקי הצמח ב מארח מפעלה. עם זאת, מסך גלובלי באמצעות BiFC הוא לא ריאלי. ישנם מספר צעדים בפרוטוקול כי יש להתייחס בזהירות. כאשר הם מגבירים את הגן של עניין (שלב 4), חשוב לשלול כי פריימרים נקשרים ל- DNA הצמח. לפיכך, DNA מצמחים שאינם נגועים חייב להיכלל כביקורת שלילית. הרצף של הגן של עניין לא חייב להכיל את אתרי הגבלת EcoRI ו סאלי המשמשים השיבוט כיוונית של הכנס. אם הרצף אכן מכיל את האתרים הללו, אנזימי הגבלה שונים עבור שיבוט חייבים להיבחר. שינוי שמרים הוא שיטה מרכזית במהלך בפרוטוקול זה. יעילות Transfection תלויה המיומן של תאי שמרים, הכדאיות שלהם, מדינת הצמיחה, ואת איכות transfection reagאף אוזן גרון 53, 54. בשביל הפרוטוקול המוצע, מומלץ מאוד להשתמש שמרים מצלחות טריות לא מבוגרים שבועות (כל זמן ב 4 ° C) בעת ביצוע טרנספורמציות. לעתים קרובות, את הצמיחה של שמרי טרנספורמציה מתעכבת כאשר תרבויות נוזלות סלקטיבית הם מחוסנים עם מושבות צלחות אגרו ישנות. כמו כן הוא מועיל להשתמש תרבות המתנע נוזלית כמו בידוד עבור הניסויים בפועל ולא להשתמש השמרים ישירות מהצלחת. יעילות נמוכה כאשר transfecting טרף לתוך השמרים להביע פיתיון יכול להוביל underrepresentation של חלבוני טרף מסוימים (interactors פוטנציאל) ולכן יכול להטות את המסך כולו. בפרוטוקול זה, יעילות transfection שמרים של ~ 150,000 CFU / DNA transfected מיקרוגרם ב Y2H עבד היטב. לדעת את הפגמים וחסרונות של טכניקת Y2H ו לפרש את התוצאות בצורה ביקורתית וראויה הוא הכרחי כדי לצייר את הקורect מסקנות. מבחני Y2H ואת הנגזרים שמשו במשך שנים רבות עברו שיפורים רבים והתאמות ביחס למאפייני הפיתיון השונים, לוקליזציה subcellular של האינטראקציה, השותפים המחייבים הצפויים, וגורמים אחרים שעשויים להידרש האינטראקציה (ראו 55 Y3H, 56, 57). לאחרונה, מסך Y2H מבוסס מערך הפותחים המאפשרים אוטומטית, ניתוח תפוקה גבוהה של פיתיונות רבים נגד מ&#39;פושט 58. העתיד ביותר טמון סיכוי בגישות אוטומציה תפוקה גבוהה כדי assay זה כדי לאפשר להבהרת מסלולי איתות מורכבות interactomes בתחומי מחקר שונים.

<html> מסכי השני היברידי שמרים (Y2H) פותחו לפני כ 27 שנים 1 ויש לי מאז היה בשימוש נרחב בתחומים שונים כדי לקבוע אינטראקציות חלבון-חלבון מסוימים 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 . האינטראקציה הפיסית של מפעיל חיידקים עם חלבון מטרה מארחת היא לעתים קרובות התנאי מוקדם המניפולציה התפקודית של חלבון המטרה הזאת. ניתוח אינטראקציות אלה עבר המוקד של מגזרים שונים של זיהום ביולוגיה 12, 13, 14, 15,&quot;&gt; 16, 17, 18. העיקרון של מסך Y2H הוא שהאינטראקציה של שני חלבונים מוביל הכינון מחדש של גורם שעתוק פונקציונלי שמניע את הביטוי של גני כתב. המפעיל הידוע (&quot; הפיתיון &quot;) הוא קבע translationally לתחום ה- DNA מחייב (DBD) של גורם השעתוק, ושותפי אינטראקצית הפוטנציאל (להלן: &quot;טרף&quot;) הם התמזגו לתחום ההפעלה (AD) של גורם שעתוק בהתאמה. מאז שותף האינטראקציה אינו ידוע, ספרייה של פוטנציאל interactors משובט לתוך מה שנקרא &quot;הטרף-הספרייה.&quot; בדרך כלל, ספרייה זו נעשית על ידי שיבוט cDNAs לתוך פלסמיד ביטוי וקטור הטרף מתאים קידוד לספירה תואמת הווקטור-הפיתיון המקודד DBD. במקרה של אינטראקציה, את גורמי שעתוק מחדש להשרות את הביטוי של גני כתב, המאפשרים את בחירת הצמיחה בדרך כלל של שמרים.זיהוי של interactors מושג על ידי רצף הפלסמיד טרף עם פריימרים פלסמיד ספציפי. חיידקים פיתחו אסטרטגיות שונות כדי להפעיל ולנצל את חילוף החומרים של המארח שלהם או כדי להתחמק ממנגנוני ההגנה ומפרישים מולקולות מפעיל באמצעות מערכות הפרשת חיידקים שונים 19, 20, 21. קביעת השותפים המחייבים של effectors החיידקים אלה היא אפוא הצעד הראשון בזיהוי מסלול מניפולציות המארח. זה מוביל הבנה משופרת של המנגנונים פתוגניות הספציפיים. מסכי Y2H מבוצעים לזהות אינטראקציות מפעילות חיידקים במהלך phytoplasmoses, ולעתים קרובות, Y2H הוא ניסוי ראשוני מכריע עבור האפיון הנוסף של מנגנוני הפתוגניות מולקולריים במחקר phytoplasma 22, 23. עם זאת, נפגשתיאור הוד ברוב הפרסומים די נדיר, וטכניקות אלו במיקור חוץ לעתים קרובות לחברות הביוטק. כדי למשוך תשומת לב את הכדאיות של שיטה זו, פרוטוקול זה מספק צעד אחר צעד במידע כדי לזהות שותפי אינטראקציה של מולקולת מפעיל חיידקים המארח שלו טבעי. למרות השימוש הנרחב ואת המחשבה קדימה המהירה של מסך Y2H, זה אסור לשכוח כי אינטראקציות מסוימות עשויות לא להתרחש במערכת השמרים. זאת בשל העובדה כי תא השמרים משמש כסוג של &quot;in vivo תגובת כלי&quot; עם מגבלותינו ביולוגיות מסוימות. כמה מחברים התייחס היתרונות והחסרונות של Y2H ונגזרותיו 11, 24, 25, 26, 27. שיקולים כלליים הם, למשל, כי תא שמרים אולי לא לספק את המתאיםביטוי גנים, (שלאחר) translational, או תנאי translocational עבור החלבונים בהתאמה נלמד. זה יכול להוביל לתוצאות false-negative במסך. אינטראקציות חיוביות בתורו יכול להיות חפצים ו עשויים לא להתרחש במצב טבעי (כלומר, במקרה של effectors ב המארח המתאים). זהו אפוא הכרחיים כדי לאשר את האינטראקציות ממערכת ביטוי שמרי Heterologous עם מבחן אינטראקציה עצמאי מערכת ביולוגית יותר קשורה זה לזה. במחקר זה, השותפים המחייב של ATP_00189 מפעיל מן הפתוגן צמח שאינו לעיבוד Candidatus Phytoplasma מאלי (פ מאלי) זוהו. התוצאות מספקות תובנה חשובות על המנגנונים המולקולריים שבבסיס פיתוח הסימפטום של התפשטות התפוחה 28, מחלה הגורמת להפסדים כלכליים גבוהים באזורים תפוחים וגדל מושפעים באירופה 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1514">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:565px;">Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:211px;">Applichem</td>
			<td style="width:324px;">A6284</td>
			<td style="width:415px;">for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trishydroxymethylaminomethane (Tris)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodiumchloride (NaCl)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2942</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2937</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">N-Lauroylsarcosin sodium salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A7402</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ammonium acetate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>9688</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1108</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3928</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>51976</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNAse</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2760</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chloroform:Isoamyl 24:1</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1935</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proofreading Polymerase (e.g. iProof)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>203433</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EcoRI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SalI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0641</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1493</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td>for self-activation assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Arginine Monohydrochloride&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3680</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Isoleucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3642</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-lysine Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3448</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Methionine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3897</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Phenylalanine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3464</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Threonine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3946</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tyrosine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3401</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Uracile</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0667</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Valine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3406</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Adenine Hemisulfate Salt&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1596</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.22 &#181;m Pore Filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16541</td>
			<td>for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Histidine Monohydrochloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3719</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Leucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3496</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tryptophane&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3410</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Nitrogen Base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51483</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1349</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-1</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peptone</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2208</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyethylene Glycol 4000 (PEG)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1249</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3478</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Salmon Sperm DNA&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2159</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-719</td>
			<td>for Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PLN350</td>
			<td>for plasmid purification from yeast and bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acid Washed Glass Beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>for plasmid purification from yeast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0839</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Extract</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1552</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z368245 (Sigma)</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bait vector (e.g. pLexA-N)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Prey vector (e.g. pGAD-HA)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control prey vector (e.g. pLexA-p53)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control bait vector (e.g. pACT-largeT)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C640003</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3&#916;200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>676 051</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td>for quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free)</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2500010</td>
			<td>for PCR and DNA works</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpell</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0301</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile filter (0.22 &#181;m; Polyethersulfone))</td>
			<td>VWR-International</td>
			<td>514-0073 (European Catalogue number)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 90 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633180</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 150 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>639161</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer (e.g. BioPhotometer)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>550507804</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WB7</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Western Blot Equipment</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>diverse</td>
			<td>for protein detection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dNTPs</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2201210</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 ml; 1000 ml; 2000 ml) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z232793, Z232858, Z232866</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaking Incubator (e.g. GFL 3031)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3031</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>KB 53 (E3.1)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825)</td>
			<td>Omniwash</td>
			<td>IF 825</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2 ml, 1.5 ml and 2.0 ml Reaction Vials (Polypropylene)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10-1000 &#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>diverse</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SPR-L-S01</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3617000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T4-Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fridge (4&#176;C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>81.767.580.4</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Freezer (-20&#176;C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>G5216</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Graduated Cylinder (e.g. Brand)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z327352; Z327417; Z327441&#160;&#160;</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S55701</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2)</td>
			<td>Integra-Biosciences</td>
			<td>155000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cuvettes for Electroporation (1 mm)</td>
			<td>Molecular Bio Products</td>
			<td>5510-11</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electroporator (e.g. Eporator)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 ml)</td>
			<td>VWR-International&#160;</td>
			<td>525-0403 (European Catalogue number)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 ml)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dithiothreitol (DTT, e.g. DTT, 1M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM))</td>
			<td>Ambion&#160;</td>
			<td>AM8110G (distributed by Thermo Scientific)</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2021 Sigma&#160;</td>
			<td>for yeast culture (ready-made mix)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen

Unravelling המנגנונים המולקולריים של גילויי המחלה חשוב להבין פתולוגיות ופיתוח סימפטום במדעי הצמח. חיידקים פיתחו אסטרטגיות שונות כדי לתפעל מטבוליזם המארח שלהם לתועלתם. מניפולציה חיידקי זה בשילוב לעיתים קרובות עם פיתוח סימפטום חמור או מוות של הצמחים הנגועים. קביעת המולקולות הספציפיות חיידקי אחראי המניפולציה המארחת הפכה תחום חשוב במחקר מיקרוביולוגית. לאחר זיהוי של מולקולות חיידקים אלה, שנקראו &quot;effectors,&quot; חשוב להבהיר את תפקידם. גישה פשוטה לבדוק את רמת התפקוד של מפעיל הוא לזהות שותף מחייב חלבוניים שלה מארח הטבעי באמצעות מסך שמרים השני היברידי (Y2H). בדרך כלל המארח בחובו רבי שותפים מחייבים פוטנציאל שלא ניתן לחזות במידה מספקת על ידי כל אלגוריתם ממוחשב. לפיכך הבחירה הטובה ביותר perfoRM מסך עם מפעיל היפותטי נגד ספרייה שלמה של חלבונים מארחים לידי ביטוי. זה מאתגר במיוחד אם הגורם הסיבתי הוא ניתן לעיבוד חקלאי כמו phytoplasma. פרוטוקול זה מספק צעד אחר צעד הוראות טיהור DNA מצמח מארח וודי phytoplasma נגוע, ההגברה של מפעיל הפוטנציאל, ואת ההזדהות הבאה של שותף האינטראקציה המולקולרי של הצמח עם מסך Y2H. למרות מסכי Y2H משמשים, קיימת מגמה לבצע מיקור חוץ של הטכניקה הזו לחברות ביוטכנולוגיה המציעות את שירות Y2H במחיר. פרוטוקול זה מספק הוראות כיצד לבצע Y2H בכל מעבדה בביולוגיה מולקולרית מצוידת בהגינות תוך שימוש בטכניקות מעבדה סטנדרטיות.

לפני מסך Y2H בפועל יכול להתבצע הפיתיון חייב להיבדק על-הפעלה עצמית. זו מושגת על ידי הפיכת וקטור ביטוי פיתיון יחד עם וקטור ספריית טרף הריק ובדיקת צמיחה על צלחות סלקטיבית. כדי לנתח אם ATP_00189 חלבון phytoplasmal הוא-הפעלה עצמית, המבחן עצמי ההפעלה בוצע כמתואר בסעיף 5. פלסמיד הפיתיון המשלימה את TRP ואת הטרף פלסמיד auxotrophy Leu של ס cerevisiae NMY51 40. טרנספורמציה-שיתוף מוצלחת ובכך מתאפיינת בצמיחה על צלחות סלקטיבית חסרות TRP ו Leu. אינטראקציה של פיתיון חלבון טרף מוביל שלם של auxotrophy שלו ade של NMY51. אם הפעלה עצמית על ידי הפיתיון בהעדר אינטראקציה מופיעה, השמרים גדלו על צלחות סלקטיבית החסרות שלו ADE. עצמית חזקה וחלשההפעלה יכולה להתרחש. עצמית הפעלה חזקה של הפיתיון מאופיינת בצמיחה של שמרים טרנספורמציה-שיתוף על צלחות מבחר TRP-Leu--ADE שלו מדולדל. עצמית הפעלה חלשה מובילה לצמיחה על TRP-Leu-שלו אבל לא על צלחות מבחר TRP-Leu--ADE שלו מדולדלת. בקרות חיוביות נאות הן הכרחיות עבור בפירוש תוצאות של assay-ההפעלה העצמית. סיכום של התוצאות הצפויות של assay עצמית ההפעלה ופירושם מסופק בטבלה 1 ו דמיינו באיור 1. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> איור 1: דוגמא של בדיקות פיתיון עצמית הפעלה של פיתיון לפני ביצוע מסך Y2H. ס cerevisiae NMY51 היה שיתוף הפך עם אינטראקציה הפיתיון (Plex-p53) וטרף (PACT-largeT) כביקורת חיובית (פאנל משמאל: AC) חברה הפעלת עצמית חלש פלוס טרף ריק Libraוקטור ר&quot;י (פנל באמצע: DF) ו פיתיון עצמי הפעלה לא בתוספת וקטור ספריית טרף ריק (פנל מימין: GI). השמרים שיתוף טרנספורמציה היו בתרבית על צלחות SD חסר TRP ו Leu (הפאנל העליון: א, ד, ז), TRP, Leu ו שלו (פאנל באמצע: B, E, H) TRP, Leu, שלו ADE (נמוך לוח: ג, ו, ט). בחירה על המדיום חסר TRP ו Leu הוא פקד חיובי על שיתוף טרנספורמציה מוצלחת, כמו וקטור הפיתיון משלים את auxotrophy TRP ואת וקטור הצד טרף Leu auxotrophy של NMY51 (צמיחה על-Leu SD-TRP). במקרה של אינטראקציה בין הפיתיון טרף או הפעלה עצמית של הפיתיון, ביטוי הכתב של NMY51 מופעלת ומשלים את auxotrophy שלו ADE (הצמיחה על SD-TRP-Leu-שלו-ADE). מופעלת עצמית חלשה מאופיינת בצמיחה על SD-TRP-Leu-שלו צלחות (פנל באמצע, DF). עצמית הפעלה חלשה של פיתיון חייבת להצטמצם לפני לניתוח הפיתיוןב מסך Y2H, למשל על ידי הוספת 3-AT אל התקשורת סלקטיבית. depletions חומצת אמינו מסומן &quot;-&quot; בשם מדיה בהתאמה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> אף לא אחד </td><td> מושבות </td><td> אין צמיחה </td><td> אין צמיחה </td><td> אין צמיחה </td><td> אין צמיחה </td></tr><tr><td> אף לא אחד </td><td> pGAD-HA </td><td> אין צמיחה </td><td> מושבות </td><td> אין צמיחה </td><td> אין צמיחה </td><td> אין צמיחה </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> אף לא אחד </td><td> מושבות </td><td> אין צמיחה </td><td> אין צמיחה </td><td> אין צמיחה </td><td> אין צמיחה </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> pGAD-HA </td><td> מושבות </td><td> מושבות </td><td&gt; מושבות </td><td> אין צמיחה </td><td> אין צמיחה </td></tr><tr><td> pLexA-p53 </td><td> ברית-largeT </td><td> מושבות </td><td> מושבות </td><td> מושבות </td><td> מושבות </td><td> מושבות </td></tr><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> pGAD-HA </td><td> מושבות </td><td> מושבות </td><td> מושבות </td><td> אין צמיחה </td><td> אין צמיחה </td></tr></tbody></table> טבלה 1: התוצאות הצפויות ב assay פיתיון עצמית ההפעלה. הפיכתו של ס cerevisiae NMY51 מניבה בצמיחת הפרש על תקשורת סלקטיבית על בסיס המאפיינים של פיתיון שיתוף טרנספורמציה ונטרפים. צמיחה על צלחות סלקטיבית הוערכה על הטרנספורמציה של שילובים שונים וקטור (AF) לאחר דגירה 72 שעות ב 30 מעלות צלזיוס. עצמית הפעלה חלשה מאופיינת בצמיחה שמרים על Leu-SD-TRP-שלו עצמית הפעלה חזקה על ידי צמיחה על plat מבחר SD-TRP-Leu--ADE שלוes בהיעדר שותף אינטראקציה. ATP_00189 מפעיל phytoplasmal מקודד pLexA-N אינו תערוכת הפעלה עצמית, אשר מאופיינת על ידי חוסר היכולת של וקטור פיתיון טרנספורמציה NMY51 לגדול בהעדר ואייד שלו. בהתאם הפיתיון, מסך Y2H יכול להרוויח שיבוטים שמרים רבים גדל על צלחות סלקטיבית. כל הם צריכים להיות הבנים מנותחים ונבדקים לעובדים בפרישה אפשרית. גם אם ספריית cDNA מנורמלת נוצלה בעבר, סביר מאוד כי interactor מיוצגת שיבוטים שונים. בהתאם טכניקת שכפול הספרייה, אפשר גם כי רק שברי הגן המלא מוכנס כמה וקטורים טרפים. לפיכך רצוי דה נובו להגביר (מ cDNA) ו subclone הגן באורך מלא של interactor וכדי לבחון את האינטראקציה בניתוח Y2H אחד-על-אחד (איור 2). <img aLT = &quot;איור 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55,150 / 55150fig2.jpg&quot; /&gt; איור 2: דוגמה של אינטראקציה בין הפיתיון טרף בניסוי Y2H. שמרי השני היברידי (Y2H) מסך בוצע פלסמידים של שיבוטי interactor חיוביים היו מטוהרים. וקטור הטרף היה רצף לבין שותפי אינטראקצית מארח Malus domestica x MdTCP24 ו MdTCP25 זוהו. כתוצאת MdTCP34 בקרה שלילית (בגינם לא interactor זוהה מסך ספריית Y2H) היה subcloned במקביל. הגנים באורך המלאים היו מוגברים מ cDNA התפוח, subcloned לתוך וקטור הטרף (שיתוף cistronically להביע לספירת תחום ההפעלה) ואת דה נובו-טרנספורמציה שיתוף עם וקטור הפיתיון המבטא את ATP_00189 מפעיל החיידקים מצמיד את תחום ה- DNA המחייבת (BD). נתון זה נלקח מתוך 28. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גדול</a>גרסה של נתון זה.

Watch this Scientific Journal Video about Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen at JoVE.com

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

חלבונים מפעיל בקטריאלי חשובים לקביעת זיהומים מוצלחים. פרוטוקול זה מתאר את זיהוי ניסיוני של שותפים מחייבים חלבוניים של חלבון מפעיל חיידקים המארחים הצמח הטבעי שלה. זיהוי אינטראקציות מפעיל אלה באמצעות השנייה היברידי מסכי שמרים הפך לכלי חשוב נפרם אסטרטגיות פתוגניות מולקולריות.

Unravelling תפקידו של מפעיל בקטריאלי מ פתוגן צמחים ללא לעיבוד בעזרת שמרי מסך דו-היברידי

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

שימוש בלוציפראז לזיהומים חיידקיים תמונה ב עכברים

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

הפלישה של תאים אנושיים על ידי פתוגן חיידקי

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

שימוש במודל EpiAirway לאפיון לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

אינדוקציה של מחלת שתל נגד מארח ו<em&gt; In Vivo</em&gt; ניטור תא T תוך שימוש במודל Murine MHC התאמה

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

כימות של קולוניזציה Sporogenesis פטרייתי, ולאחר הפקה של mycotoxins שימוש bioassays-Kernel

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; דגם עכבר: תרומות הפתוגן ומארח לומדים קוליטיס המדבק

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

הפרדה אוטומטית של<em&gt; ג elegans</em&gt; יישבו variably ידי פתוגן חיידקים

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

זיהוי Cortex שבר במהלך בקטריאלי Spore נביטה

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...