Name: unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen
Uploaded: 2017-01-20T13:00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen at JoVE.com

हम पांडुलिपि proofreading के लिए Laimburg रिसर्च सेंटर और तकनीकी सहायता के लिए Dualsystems बायोटेक एजी और जूलिया Strobl से Mirelle बोर्जेस डायस Schnetzer से क्रिस्टीन Kerschbamer, थॉमस Letschka, सबीन Oettl, मार्गोट Raffeiner, और फ्लोरियन Senoner धन्यवाद। इस काम APPL2.0 परियोजना के हिस्से के रूप में प्रदर्शन किया गया था और आंशिक रूप से Bozen / बोलजानो, इटली के स्वायत्त प्रांत और दक्षिण Tyrolean एप्पल कंसोर्टियम द्वारा वित्त पोषित किया गया।

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

<html> खमीर दो संकर स्क्रीन (Y2H), 11 के बारे में 27 साल पहले 1 विकसित और के बाद से व्यापक रूप से विशिष्ट प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 निर्धारित करने के लिए विभिन्न क्षेत्रों में इस्तेमाल किया गया है रहे थे । एक मेजबान के लक्ष्य प्रोटीन के साथ एक जीवाणु प्रेरक के भौतिक बातचीत अक्सर इस लक्ष्य प्रोटीन के कार्यात्मक हेरफेर के लिए पूर्व शर्त है। इन मुलाकातों का विश्लेषण संक्रमण जीव विज्ञान 12, 13, 14, 15 के कई अलग अलग क्षेत्रों का ध्यान केंद्रित करने के लिए ले जाया गया है,&quot;&gt; 16, 17, 18। Y2H स्क्रीन का सिद्धांत है कि दो प्रोटीन की बातचीत एक कार्यात्मक प्रतिलेखन कारक है कि रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति ड्राइव के पुनर्गठन की ओर जाता है। जाना जाता प्रेरक (&quot; चारा &quot;) translationally जुड़े हुए है डीएनए बाध्यकारी डोमेन प्रतिलेखन कारक की (DBD), और संभावित बातचीत भागीदारों ( &quot;शिकार&quot;) संबंधित प्रतिलेखन कारक की सक्रियता के डोमेन (ई) से जुड़े हुए हैं। चूंकि बातचीत साथी अज्ञात, क्षमता का एक पुस्तकालय है interactors एक उपयुक्त शिकार वेक्टर अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में cDNAs क्लोनिंग विज्ञापन है कि चारा-वेक्टर इनकोडिंग DBD के साथ संगत है एन्कोडिंग द्वारा तथाकथित में क्लोन है &quot;शिकार पुस्तकालय।&quot; आम तौर पर, इस पुस्तकालय बना है। एक बातचीत के मामले में, पुनर्गठन प्रतिलेखन कारक रिपोर्टर जीन है, जो आम तौर पर खमीर के विकास चयन सक्षम की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित। Theinteractors की पहचान प्लाज्मिड विशिष्ट प्राइमरों के साथ शिकार प्लाज्मिड अनुक्रमण द्वारा हासिल की है। बैक्टीरिया में हेरफेर और अपने मेजबान की चयापचय शोषण या सुरक्षा तंत्र से बचने और विभिन्न जीवाणु स्राव सिस्टम 19, 20, 21 के माध्यम से प्रेरक अणुओं का स्राव करने के लिए विभिन्न रणनीतियों को विकसित किया है। इन बैक्टीरियल प्रभावोत्पादक के बंधन भागीदारों का निर्धारण इस प्रकार की मेजबानी में चालाकी से मार्ग की पहचान करने में पहला कदम है। इस विशिष्ट pathogenicity तंत्र का एक बेहतर समझ की ओर जाता है। Y2H स्क्रीन phytoplasmoses दौरान बैक्टीरियल प्रेरक बातचीत की पहचान करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं, और अक्सर, Y2H phytoplasma अनुसंधान 22, 23 में आणविक pathogenicity तंत्र के आगे लक्षण वर्णन के लिए एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक प्रयोग है। हालांकि, मुलाकातसबसे प्रकाशनों में विभागाध्यक्ष विवरण नहीं बल्कि दुर्लभ है, और इन तकनीकों अक्सर बायोटेक कंपनियों को आउटसोर्स कर रहे हैं। इस विधि की व्यवहार्यता की ओर ध्यान आकर्षित करने के लिए, इस प्रोटोकॉल कदम-दर-कदम जानकारी अपनी प्राकृतिक मेजबान में एक जीवाणु प्रेरक अणु की बातचीत भागीदारों की पहचान करने के लिए प्रदान करता है। व्यापक उपयोग और Y2H स्क्रीन के तेजी से आगे दृष्टिकोण के बावजूद, यह नहीं भूलना चाहिए कि कुछ बातचीत खमीर प्रणाली में घटित नहीं हो सकता है। यह सच है कि खमीर सेल कुछ जैविक सीमाओं के साथ &quot;इन विवो प्रतिक्रिया पोत&quot; का एक प्रकार के रूप में प्रयोग किया जाता है के कारण है। कई लेखकों फायदे और Y2H और उसके डेरिवेटिव 11, 24, 25, 26, 27 के नुकसान को संबोधित किया है। जनरल विचार उदाहरण के लिए, कर रहे हैं, कि खमीर सेल उचित नहीं प्रदान कर सकता हैजीन अभिव्यक्ति, (पोस्ट) translational, या संबंधित प्रोटीन के लिए translocational की स्थिति का अध्ययन किया जा रहा है। इस स्क्रीन में झूठी नकारात्मक परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। सकारात्मक बातचीत के बदले में कलाकृतियों हो सकता है और (उचित मेजबानी में यानी, प्रभावोत्पादक के मामले में) प्राकृतिक स्थिति में होते नहीं हो सकता है। इस प्रकार यह एक अधिक बारीकी से संबंधित जैविक प्रणाली में एक स्वतंत्र बातचीत परीक्षण के साथ heterologous खमीर अभिव्यक्ति प्रणाली से बातचीत की पुष्टि के लिए अपरिहार्य है। इस अध्ययन में, गैर-कृषि योग्य संयंत्र रोगज़नक़ Candidatus Phytoplasma माली (पी माली) से प्रेरक ATP_00189 के बंधन भागीदारों की पहचान की गई। परिणाम सेब प्रसार 28, एक रोग है कि यूरोप में 29 प्रभावित सेब उत्पादक क्षेत्रों में उच्च आर्थिक नुकसान का कारण बनता है के लक्षण विकास अंतर्निहित आणविक तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1514">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:565px;">Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:211px;">Applichem</td>
			<td style="width:324px;">A6284</td>
			<td style="width:415px;">for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trishydroxymethylaminomethane (Tris)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodiumchloride (NaCl)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2942</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2937</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">N-Lauroylsarcosin sodium salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A7402</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ammonium acetate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>9688</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1108</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3928</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>51976</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNAse</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2760</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chloroform:Isoamyl 24:1</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1935</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proofreading Polymerase (e.g. iProof)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>203433</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EcoRI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SalI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0641</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1493</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td>for self-activation assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Arginine Monohydrochloride&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3680</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Isoleucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3642</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-lysine Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3448</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Methionine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3897</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Phenylalanine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3464</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Threonine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3946</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tyrosine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3401</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Uracile</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0667</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Valine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3406</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Adenine Hemisulfate Salt&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1596</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.22 &#181;m Pore Filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16541</td>
			<td>for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Histidine Monohydrochloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3719</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Leucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3496</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tryptophane&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3410</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Nitrogen Base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51483</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1349</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-1</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peptone</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2208</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyethylene Glycol 4000 (PEG)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1249</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3478</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Salmon Sperm DNA&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2159</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-719</td>
			<td>for Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PLN350</td>
			<td>for plasmid purification from yeast and bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acid Washed Glass Beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>for plasmid purification from yeast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0839</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Extract</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1552</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z368245 (Sigma)</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bait vector (e.g. pLexA-N)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Prey vector (e.g. pGAD-HA)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control prey vector (e.g. pLexA-p53)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control bait vector (e.g. pACT-largeT)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C640003</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3&#916;200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>676 051</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td>for quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free)</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2500010</td>
			<td>for PCR and DNA works</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpell</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0301</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile filter (0.22 &#181;m; Polyethersulfone))</td>
			<td>VWR-International</td>
			<td>514-0073 (European Catalogue number)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 90 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633180</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 150 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>639161</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer (e.g. BioPhotometer)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>550507804</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WB7</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Western Blot Equipment</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>diverse</td>
			<td>for protein detection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dNTPs</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2201210</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 ml; 1000 ml; 2000 ml) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z232793, Z232858, Z232866</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaking Incubator (e.g. GFL 3031)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3031</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>KB 53 (E3.1)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825)</td>
			<td>Omniwash</td>
			<td>IF 825</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2 ml, 1.5 ml and 2.0 ml Reaction Vials (Polypropylene)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10-1000 &#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>diverse</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SPR-L-S01</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3617000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T4-Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fridge (4&#176;C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>81.767.580.4</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Freezer (-20&#176;C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>G5216</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Graduated Cylinder (e.g. Brand)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z327352; Z327417; Z327441&#160;&#160;</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S55701</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2)</td>
			<td>Integra-Biosciences</td>
			<td>155000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cuvettes for Electroporation (1 mm)</td>
			<td>Molecular Bio Products</td>
			<td>5510-11</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electroporator (e.g. Eporator)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 ml)</td>
			<td>VWR-International&#160;</td>
			<td>525-0403 (European Catalogue number)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 ml)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dithiothreitol (DTT, e.g. DTT, 1M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM))</td>
			<td>Ambion&#160;</td>
			<td>AM8110G (distributed by Thermo Scientific)</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2021 Sigma&#160;</td>
			<td>for yeast culture (ready-made mix)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen

बीमारी अभिव्यक्तियों के आणविक तंत्र Unravelling संयंत्र विज्ञान के क्षेत्र में विकृतियों और लक्षण विकास को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। बैक्टीरिया अपने स्वयं के लाभ के लिए अपने मेजबान चयापचय में हेरफेर करने के लिए अलग रणनीति विकसित किया है। यह जीवाणु हेरफेर अक्सर गंभीर लक्षण विकास या प्रभावित पौधों की मौत के साथ युग्मित है। मेजबान हेरफेर के लिए जिम्मेदार विशिष्ट जीवाणु अणुओं का निर्धारण सूक्ष्मजीवविज्ञानी अनुसंधान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण क्षेत्र बन गया है। इन बैक्टीरिया के अणुओं कहा जाता है, की पहचान करने के बाद &quot;प्रभावोत्पादक,&quot; यह उनके कार्य को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक स्पष्ट दृष्टिकोण निर्धारित करने के लिए एक प्रेरक का कार्य एक खमीर दो संकर (Y2H) स्क्रीन के माध्यम से अपनी प्राकृतिक मेजबानी में अपने प्रोटीन बाध्यकारी साथी की पहचान है। आम तौर पर मेजबान कई संभावित बंधन भागीदारों कि सिलिको एल्गोरिथ्म में से किसी ने पर्याप्त भविष्यवाणी नहीं की जा सकती है, बंदरगाहों। यह इस प्रकार perfo करने के लिए सबसे अच्छा विकल्प हैमेजबान व्यक्त प्रोटीन की एक पूरी पुस्तकालय के खिलाफ काल्पनिक प्रेरक के साथ एक स्क्रीन RM। यह विशेष रूप से चुनौती दे रहा है, तो प्रेरणा का एजेंट phytoplasma तरह अकृष्य है। इस प्रोटोकॉल एक phytoplasma संक्रमित वुडी मेजबान संयंत्र, संभावित प्रेरक के प्रवर्धन, और एक Y2H स्क्रीन के साथ पौधे की आणविक बातचीत साथी के बाद पहचान से डीएनए शुद्धि के लिए कदम दर कदम निर्देश प्रदान करता है। हालांकि Y2H स्क्रीन आमतौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं, वहाँ जैव प्रौद्योगिकी कंपनियों को लागत से Y2H सेवा की पेशकश करने के लिए इस तकनीक को आउटसोर्स करने के लिए एक प्रवृत्ति है। इस प्रोटोकॉल कैसे किसी भी शालीनता से सुसज्जित आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशाला मानक प्रयोगशाला तकनीक का उपयोग कर एक Y2H प्रदर्शन करने पर निर्देश प्रदान करता है।

पहले वास्तविक Y2H स्क्रीन प्रदर्शन किया जा सकता चारा आत्म सक्रियण के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए। यह खाली शिकार पुस्तकालय वेक्टर के साथ मिलकर चारा अभिव्यक्ति वेक्टर बदलने और चयनात्मक प्लेटों पर विकास की जाँच करके हासिल की है। कि क्या phytoplasmal प्रोटीन ATP_00189 आत्म सक्रिय है का विश्लेषण करने के लिए, आत्म सक्रियण परीक्षण खंड 5. चारा प्लाज्मिड टीआरपी के पूरक है और शिकार एस cerevisiae NMY51 40 के लियू auxotrophy प्लाज्मिड में वर्णित के रूप में प्रदर्शन किया गया था। एक सफल सह-परिवर्तन इस प्रकार टीआरपी और लियू कमी चयनात्मक प्लेटों पर विकास की विशेषता है। चारा और शिकार प्रोटीन की बातचीत NMY51 के बारे में उनकी और एडीई auxotrophy की एक पूरक की ओर जाता है। एक बातचीत के अभाव में आत्म सक्रियण चारा द्वारा प्रकट होता है, खमीर और उसकी एडीई कमी चयनात्मक प्लेटों पर बढ़ता है। मजबूत और कमजोर आत्मसक्रियण हो सकता है। चारा की मजबूत आत्म सक्रियण टीआरपी-Leu-his-एडीई समाप्त चयन प्लेटों पर सह तब्दील खमीर के विकास की विशेषता है। उसकी टीआरपी-Leu-नहीं बल्कि टीआरपी-Leu-his-एडीई समाप्त चयन प्लेटों पर कमजोर आत्म सक्रियण पर विकास की ओर जाता है। उचित सकारात्मक नियंत्रण आत्म सक्रियण परख के परिणामों की व्याख्या के लिए अपरिहार्य हैं। और आत्म सक्रियण परख की उम्मीद परिणामों के एक सारांश उनकी व्याख्या तालिका 1 में प्रदान की है और चित्रा 1 में कल्पना की है। <img alt="आकृति 1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> चित्रा 1: एक Y2H स्क्रीन प्रदर्शन से पहले एक चारा का चारा स्व-सक्रियण टेस्ट का उदाहरण है। , एक कमजोर आत्म को सक्रिय करने के साथ साथ एक खाली शिकार तुला: एस cerevisiae NMY51 चारा बातचीत (Plex-P53) और एक सकारात्मक नियंत्रण (एसी बाएं पैनल) के रूप में शिकार (संधि-larget) के साथ सह तब्दील हो गया थाRY वेक्टर (मध्यम पैनल: DF) और एक नहीं स्वयं को सक्रिय चारा प्लस एक खाली शिकार पुस्तकालय वेक्टर (सही पैनल: सैनिक)। , टीआरपी, लियू और उसके (मध्यम पैनल: बी, ई, एच): सह तब्दील खमीर एसडी टीआरपी और लियू (ए, डी, जी ऊपरी पैनल) की कमी प्लेटों पर सुसंस्कृत थे और टीआरपी, लियू, उसके और एडीई (कम पैनल: सी, एफ, i)। चारे के रूप में वेक्टर टीआरपी auxotrophy और शिकार वेक्टर NMY51 (एसडी टीआरपी-लियू विकास) के लियू auxotrophy पूरक मध्यम कमी टीआरपी और लियू पर चयन, सफल सह-परिवर्तन के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण है। चारा और शिकार या प्रलोभन के एक स्वयं सक्रियण के बीच एक संवाद के मामले में, NMY51 के संवाददाता अभिव्यक्ति पर बदल दिया और उसकी और एडीई auxotrophy (एसडी टीआरपी-Leu-his-एडीई विकास) का पूरक है। एक कमजोर आत्म सक्रियण पर एसडी टीआरपी-Leu-अपने प्लेटों विकास की विशेषता है (मध्यम पैनल, डीएफ)। एक चारा की कमजोर आत्म सक्रियण चारा का विश्लेषण करने के लिए पूर्व में कम किया जाना चाहिएएक Y2H स्क्रीन में, चयनात्मक मीडिया के लिए 3-एटी जोड़कर उदा। संबंधित मीडिया नाम पर - एमिनो एसिड depletions के साथ संकेत कर रहे हैं। &quot;&quot; <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pLexA-एन-atp00189 </td><td> कोई नहीं </td><td> कालोनियों </td><td> कोई विकास नहीं </td><td> कोई विकास नहीं </td><td> कोई विकास नहीं </td><td> कोई विकास नहीं </td></tr><tr><td> कोई नहीं </td><td> pGAD हा </td><td> कोई विकास नहीं </td><td> कालोनियों </td><td> कोई विकास नहीं </td><td> कोई विकास नहीं </td><td> कोई विकास नहीं </td></tr><tr><td> pLexA-एन </td><td> कोई नहीं </td><td> कालोनियों </td><td> कोई विकास नहीं </td><td> कोई विकास नहीं </td><td> कोई विकास नहीं </td><td> कोई विकास नहीं </td></tr><tr><td> pLexA-एन </td><td> pGAD हा </td><td> कालोनियों </td><td> कालोनियों </td><td&gt; कालोनियों </td><td> कोई विकास नहीं </td><td> कोई विकास नहीं </td></tr><tr><td> pLexA-P53 </td><td> समझौता-larget </td><td> कालोनियों </td><td> कालोनियों </td><td> कालोनियों </td><td> कालोनियों </td><td> कालोनियों </td></tr><tr><td> pLexA-एन-atp00189 </td><td> pGAD हा </td><td> कालोनियों </td><td> कालोनियों </td><td> कालोनियों </td><td> कोई विकास नहीं </td><td> कोई विकास नहीं </td></tr></tbody></table> तालिका 1: एक चारा स्व-सक्रियण परख में अपेक्षित परिणाम। एस cerevisiae NMY51 के परिवर्तन के सह-बदल चारा और शिकार की विशेषताओं के आधार पर चयनात्मक मीडिया पर अंतर विकास में अर्जित करता है। चयनात्मक प्लेटों पर वृद्धि 30 डिग्री सेल्सियस पर विभिन्न संयोजनों वेक्टर (वायुसेना) 72 ज ऊष्मायन के बाद के परिवर्तन पर मूल्यांकन किया गया था। कमजोर आत्म सक्रियण पर खमीर विकास की विशेषता है एसडी टीआरपी-Leu-अपने और मजबूत आत्म सक्रियण पर एसडी टीआरपी-Leu-his-एडीई चयन बेनी विकास द्वाराएक बातचीत साथी के अभाव में es। pLexA-एन इनकोडिंग phytoplasmal प्रेरक ATP_00189 आत्म सक्रियण, जो चारा वेक्टर तब्दील NMY51 उसकी और एडीई के अभाव में विकसित करने के लिए असमर्थता द्वारा विशेषता है प्रदर्शन नहीं करता है। चारा पर निर्भर करता है, एक Y2H स्क्रीन चयनात्मक प्लेटों पर बढ़ रही है कई खमीर क्लोन हासिल कर सकते हैं। सभी क्लोन का विश्लेषण किया और संभव redundancies के लिए जाँच की जानी चाहिए। यहां तक ​​कि अगर एक सामान्यीकृत सीडीएनए पुस्तकालय इस्तेमाल किया गया है, यह बहुत संभावना है कि एक interactor कई अलग अलग क्लोन में प्रतिनिधित्व किया है। पुस्तकालय क्लोनिंग तकनीक पर निर्भर करता है, यह भी संभव है कि पूर्ण जीन के ही टुकड़े कुछ शिकार वैक्टर में डाला जाता है। यह इस प्रकार नए सिरे से (सीडीएनए से) बढ़ाना और interactor की पूरी लंबाई जीन subclone और एक एक-से-एक Y2H विश्लेषण (चित्रा 2) में बातचीत का परीक्षण करने की सलाह दी जाती है। <img aएलटी = &quot;चित्रा 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55150 / 55150fig2.jpg&quot; /&gt; चित्रा 2: एक Y2H प्रयोग में चारा और शिकार के बीच एक संवाद का उदाहरण है। एक खमीर दो संकर (Y2H) स्क्रीन प्रदर्शन किया गया था और सकारात्मक interactor क्लोन से plasmids शुद्ध किया गया। शिकार वेक्टर अनुक्रम किया गया था और Malus domestica एक्स मेजबान बातचीत भागीदारों के MdTCP24 और MdTCP25 पहचान की गई। एक नकारात्मक नियंत्रण MdTCP34 (जिसके लिए कोई interactor Y2H पुस्तकालय स्क्रीन में पहचान की गई थी) के रूप में समानांतर में subcloned था। पूरी लंबाई जीन सेब सीडीएनए से परिलक्षित कर रहे थे, शिकार वेक्टर (सह cistronically सक्रियण डोमेन ई व्यक्त) और में subcloned नए सिरे से चारा वेक्टर बैक्टीरियल प्रेरक ATP_00189 डीएनए बाध्यकारी डोमेन (बी) के लिए मिलकर व्यक्त के साथ सह-बदल दिया। यह आंकड़ा 28 से लिया जाता है। <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें</a>यह आंकड़ा का संस्करण।

Watch this Scientific Journal Video about Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen at JoVE.com

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

बैक्टीरियल प्रेरक प्रोटीन सफल संक्रमणों की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस प्रोटोकॉल अपनी प्राकृतिक संयंत्र की मेजबानी में एक जीवाणु प्रेरक प्रोटीन की प्रोटीन बाध्यकारी भागीदारों की प्रयोगात्मक पहचान का वर्णन है। खमीर दो संकर स्क्रीन के माध्यम से इन प्रेरक बातचीत की पहचान आणविक pathogenicity रणनीतियों को उजागर करने में एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है।

एक गैर-कृषि योग्य संयंत्र पैथोजन से एक जीवाणु प्रेरक के फंक्शन Unravelling एक खमीर दो संकर स्क्रीन का उपयोग

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

चूहे में छवि बैक्टीरियल संक्रमणों के लिए luciferase का उपयोग

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

मानव कोशिकाओं के एक बैक्टीरियल पैथोजन द्वारा आक्रमण

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

बैक्टीरियल आसंजन के अध्ययन में कतरें तनाव का परिचय

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

लंबे समय तक मेजबान रोगज़नक़ सहभागिता निस्र्पक के लिए EpiAirway मॉडल का उपयोग

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग के प्रेरण और<em&gt; Vivo में</em&gt; टी सेल निगरानी एक MHC-मिलान murine मॉडल का उपयोग

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

फफूंद की औपनिवेशीकरण, रेणूजनक और mycotoxins का उत्पादन की मात्रा कर्नेल bioassays का उपयोग

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; माउस मॉडल: अध्ययन संक्रामक बृहदांत्रशोथ पैथोजन और मेजबान योगदान

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

स्वचालित पृथक्करण<em&gt; सी. एलिगेंस</em&gt; अस्थायित्व से एक जीवाणु रोगज़नक़ द्वारा उपनिवेश

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

कॉर्टेक्स टुकड़े का पता लगाने के बैक्टीरियल बीजाणु अंकुरण के दौरान

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

आकलन रेटिना microglial phagocytic समारोह<em&gt; Vivo</em&gt; एक से फ्लो आधारित परख का उपयोग

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...