Name: unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen
Uploaded: 2017-01-20T13:00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen at JoVE.com

私たちは、原稿を校正するための技術支援のためのDualsystemsバイオテックAGとジュリアシュトローブルからLaimburg研究センターとMirelleボルヘスディアスSchnetzerからクリスティンKerschbamer、トーマスLetschka、ザビーネOettl、マーゴットラファイナー、フロリアンSenonerに感謝します。この作品はAPPL2.0プロジェクトの一環として実施し、部分的にボルツァーノ/ボルツァーノ、イタリアの自治州と南チロルアップルコンソーシアムによって資金を供給されました。

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

Y2H画面では、潜在的なエフェクタータンパク質は、異なる仮想的な相互作用するタンパク質（ステップ7）と共発現です。各成長酵母クローンは、餌が、（潜在的に）異なる相互作用物質が含まれています。相互作用するタンパク質は、獲物プラスミド中にクローニングされたcDNAライブラリーでエンコードされています。ベイトとプレイは、酵母転写因子の一部は、各共同cistronicallyコードをプラスミド。ベイト（エフェクター）と獲物プラスミドにコードされた相互作用物質の間の物理的相互作用の場合には、2つの転写因子部分（DNA結合ドメインおよび活性化ドメイン）が一体化され、そしてレポーター遺伝子の発現が誘導されます。酵母はヒスチジンおよびアデニン枯渇SD選択プレート上で増殖することができます。獲物cDNAライブラリーの種類をスクリーニングエフェクターに依存し、それに応じて選択されなければなりません。獲物とベイトベクター、ならびに酵母株は、互換性がなければなりません。この画面では、LexAのDNA結合ドメインとGAL4活性化domainは互換性のある酵母転写因子単位として使用しました。 cDNAライブラリーは、個別にカスタム得商業製、又は、構成することができます。 cDNAの獲物ライブラリーの調製は、このプロトコルの一部ではありません。このプロトコルでは、 マリュス第X domestica葉のRNAからの自己構築し、正規化されたcDNAライブラリーを使用し、pGAD-HA 41にクローニングしました。酵母株を発現性エフェクター（ベイト）は獲物ライブラリーで形質転換し、クローンはヒスチジンおよびアデニン枯渇SD選択プレート上で選択しました。酵母コロニーからプラスミドDNAを抽出するには、細菌の列ベースのDNAプラスミドミニキットは、酵母溶解（ステップ8）を改善するために、ガラスビーズを用いて機械的破壊のステップと組み合わせてお勧めします。このプラスミド精製では、ベイトおよびプレイベクターは、比較的低濃度で同時に精製されるであろう。しかしながら、プラスミドDNAの量は、配列決定ウィット介して相互作用パートナーを同定するために十分ですハウト前プラスミド増殖（ステップ8.4）。別の方法として、ステップ8.4で精製されたDNAは、コンピテント大腸菌に形質転換することができ、（ 例えば、pGAD-HAの場合にはアンピシリン）獲物ベクター媒介抗生物質耐性により選択します。選択された大腸菌コロニーは、pGAD-HAライブラリープラスミドを運び、かつ高収率プラスミド精製は、これらのクローンを用いて行うことができます。 pLexA-NとpGAD-HA構築物を形質転換の成功はNMY51のトリプトファンおよびロイシン栄養要求性を補完します。エフェクターおよびタンパク質（pGAD-HAにコードされる）との間の相互作用はNMY51株におけるレポーターシステムの活性化をもたらします。自己活性化の場合には、NMY51が原因NMY51レポーター系の望ましくない活性化にpGAD-HAは、TRP-レウ-彼-ADEを欠く選択プレート上で成長し、空のライブラリーベクターと組み合わせてpLexA-Nを発現するエフェクターで形質転換します40。自己活性化は、ワットすることができますEAKおよびTrp-Leuの-彼の不在下で発生する可能性があります、または活性化が強くなるとのtrp-leuへ-彼-ADEプレート41上に成長することを特徴とすることができます。自己活性化は、実際のY2H画面における偽陽性クローンの大規模なバックグラウンドを引き起こす可能性があります。これを回避するために、ベイト自己活性化試験を実施しなければならない、エフェクター発現ベクターは空のライブラリーベクターで同時形質転換しました。この実験設定では、レポーター遺伝子の発現が誘導されてはなりません。自己活性化（ すなわち、選択プレート上で成長）試験で表示されている場合、媒体は、3-アミノ-1,2,4-トリアゾール45（3-AT）の種々の濃度で補充することができます。 3-ATはimidazoleglycerolリン酸デヒドラターゼ（HIS3）、ヒスチジン生合成46の間に重要な酵素の阻害剤です。 3-ATの補充は、Y2Hスクリーン47の間に自己活性化の弱い影響を低減することができます48。 3-ATの異なる濃度の試験すべきです。このプロトコルでは - 1 40mMの3-ATを使用しました。自己活性化の抑制につながる最低濃度は、その後Y2H画面で使用されるべきです。同時形質転換のSD-TRP-Leuのプレートは、クローンの十分な数が含まれている場合、自己活性化アッセイの選択プレートのみを評価することができます。表示≥として90ミリメートル（直径）ペトリ皿当たり500コロニーが十分です。正確なトランスフェクション効率を決定するために、同時形質転換した酵母の連続希釈液を準備し、SD-TRP-Leuのプレート上にそれらを広げることをお勧めします。 自己活性化を減少させるために、エフェクターはpLexA-C、タンパク質のC末端へのLexAタグを融合ベイト発現ベクターにクローニングすることができます。レックスタグの向きは、自己活性化24を減衰させることができます。しかし、自己活性化を低減または廃止するすべての場合には不可能です。の形成赤色系のコロニーが弱いまたは偽陽性の相互作用を示しています。それは、タンパク質間相互作用に来るときNMY51のADE2レポーター遺伝子のみが活性化されるターンブロックで、この酵母株40における赤色色素の蓄積。強力な相互作用を運ぶコロニーは白色である一方で相互作用が存在しない場合には、NMY51は、赤みを帯びています。選択プレート上のコロニーの色の観察は、このようにそれぞれのコロニーが真陽性または偽陽性相互作用しているかどうかを判断するために、さらに重要なヒントを提供します。 適応や餌の性質と相互作用特性に関して、特定のアッセイの設定を変更することが最終的に必要です。今では、改善と共通Y2Hの派生技術の数が異なるホスト・システムではなく、困難なタンパク質相互作用の分析を可能にするために確立されています。 Stynen らによるレビュー。 49アドレスNDはY2H、その改善、および適応のさまざまな側面を説明し、このようにして、適切な相互作用アッセイを選択する方法についての有益な情報を提供しています。 Y2Hスクリーン派生技術が広くバイナリタンパク質相互作用の同定が必要とされる限り、異なる研究分野で使用されるようになっています。重要なコントロールが、そのような餌の自己活性化試験および同定相互作用タンパク質の一対一の再変換のように、実行された場合でも、Y2Hは誤った結果26、50、51を生成しやすいです。モデルとしての酵母は、すべての相互作用の研究には適していません。酵母は、必ずしもすべてのタンパク質24のための適切な翻訳後修飾や折りたたみをサポート細胞環境を構成するものではありません。また、Y2H設定で、タンパク質が過剰発現され、それらの発現は、コントロールではありませんその天然のプロモーターが率います。 Y2Hは、必ずしもそれらの自然の細胞内宛先ではない核へのタンパク質性相互作用パートナーを強制します。相互作用のネイティブの細胞の状況は、このように酵母によって反映されない場合がありますと、偽陰性または偽陽性結果につながる可能性があります。ほとんどのY2Hは、選択原則として酵母栄養要求性の相補性に基づいています。この栄養選択は、高感度によって特徴づけられるが、他に比べて減少した選択性を犠牲にして（ 例えば、発色性レポーター）が49をアッセイされます。非還元自己活性化（上記参照）または他の制限は、特定のエフェクターのために発生した場合、Y2Hは、適切なアッセイ25ではありません。 表1及び図1に、自己活性化試験の予想結果が与えられています。実際の相互作用（ すなわち、偽陰性）の不在は、タンパク質の毒性、誤った翻訳タンパク質によって引き起こされる可能性が処理、相互作用の立体障害、過小評価獲物ライブラリ内の相互作用パートナー、餌の膜局在化、または相互作用24のために必要な不足しているコンポーネント。 餌を発現への構築、cDNAから同定された相互作用するタンパク質の完全長遺伝子を増幅pGAD-HAにそれをサブクローニングし、生成されたpGAD-HAを変換することにより、1対1の相互作用アッセイを行うデノボに推奨されますNMY51株。獲物ライブラリーに存在する観測された相互作用因子だけより大きなタンパク質の断片であるかもしれないので、これは必要です。しかし、それぞれの完全長遺伝子の情報がかなりのゲノムおよびトランスクリプトーム配列データが利用可能である場合にのみアクセス可能です。ここに記載の自己活性化アッセイのための形質転換プロトコールは、一対一のアッセイに適用することができ、かつ餌と相互作用因子との間の相互作用が再現可能でなければなりません。 マリュスののx domesticaが ニコチアナベンタミアナで二分子蛍光相補性（BIFC）と植物体で確認されたのTCP転写因子との相互作用は、28（このプロトコルの一部ではない）をプロトプラスト。エフェクタータンパク質のATP_00189は、植物病原体のP.マリから派生しました。 プランタ BIFC ではこのようにマルスのx domesticaの転写因子とのATP_00189相互作用を確認するために選ばれました 以前Y2H 28で識別されました。 BIFCは、レポーター系を活性化するために、核への相互作用するタンパク質の細胞内移行を必要としない、タンパク質 - タンパク質相互作用アッセイです&lt;SUPクラス= &quot;外部参照&quot;&gt; 52。さらに、 植物体の発現および変形例では機械がその植物宿主中の植物細菌のエフェクター間の自然の相互作用の環境を模倣します。しかし、BIFCを使用してグローバル画面は現実的ではありません。 慎重に対処しなければならないプロトコルにはいくつかのステップがあります。関心（ステップ4）の遺伝子を増幅する場合には、プライマーは、植物DNAに結合することを排除することが重要です。このように、非感染植物からのDNAは、陰性対照として含まれている必要があります。目的の遺伝子の配列は、インサートの方向性クローニングのために使用されたEcoRIおよびSalI制限部位を含んではなりません。シーケンスは、これらのサイトが含まれている場合は、クローニングのための異なる制限酵素を選択する必要があります。酵母の形質転換は、このプロトコル中の中心的なメソッドです。トランスフェクション効率は、酵母細胞、それらの生存率、増殖状態、およびトランスフェクションの質の能力に依存REAGENT 53、54。提案されたプロトコルの場合、非常に変換を実行するときに2週間（4℃で保存）よりも古くない新鮮なプレートから酵母を使用することをお勧めします。選択液体培養が古い寒天プレートからコロニーを接種されたとき、多くの場合、形質転換酵母の成長が遅れています。プレートから直接酵母を使用するように、実際の実験のための接種物としての液体スターター培養物を使用しないためにも有用です。低効率は、ベイトを発現する酵母に獲物をトランスフェクトするときは、特定の獲物タンパク質（潜在的な相互作用）の過少につながることができますので、画面全体を歪曲することができます。このプロトコルでは、Y2Hで〜15万のcfu /μgでトランスフェクトされたDNAの酵母トランスフェクション効率はよく働きました。 Y2H技術の欠陥や欠点を知り、重要かつ適切な方法で結果を解釈すると、CORRを描画することが不可欠です電気ショック療法の結論。 Y2Hアッセイおよび誘導体は、長年使用されており、異なる餌特性に対して多くの改良及び適応を受けた、相互作用の細胞内局在性は、相互作用のために必要とされるかもしれない期待結合パートナー、およびその他の要因が（参照しますY3H 55、56、57）。最近では、アレイベースのY2Hスクリーンは獲物58の何百万人に対する多数の餌の自動化、ハイスループット分析を可能にするように開発されてきました。今後は、最も可能性の高い別の研究分野における複雑なシグナル伝達経路とインタラクトームの解明を可能にするために、このアッセイに自動化と高スループットのアプローチです。

<html>酵母ツーハイブリッドスクリーニング（Y2H）は1約27年前に開発され、広く、特定のタンパク質-タンパク質相互作用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11を決定するために、様々な分野で利用されているので有しました。ホスト標的タンパク質と細菌のエフェクターの物理的相互作用は、多くの場合、この標的タンパク質の機能的操作のための前提条件です。これらの相互作用を分析して、感染生物学12、13、14、15の多くの異なるセクターの焦点に移動しました、&quot;&gt; 16、17、18。Y2Hスクリーンの原理は、2つのタンパク質の相互作用は、レポーター遺伝子の発現を駆動する機能的転写因子の再構成をもたらすことである。既知のエフェクター（「ベイト」）が翻訳的に融合させますDNA結合ドメイン転写因子（DBD）、および潜在的な相互作用パートナー（「プレイ」）の相互作用パートナーは、潜在的なライブラリ不明であるので、それぞれの転写因子の活性化ドメイン（AD）に融合されているに相互作用は、いわゆる中にクローン化された「プレイ・ライブラリー。」通常、このライブラリーはベイトベクターと互換性のDBDを符号化されている。相互作用の場合には、ADをコードする適切な獲物ベクター発現プラスミドにcDNAをクローニングすることによって作られ、再構成された転写因子は、一般的に、酵母の増殖選択を可能にする、レポーター遺伝子の発現を誘導します。相互作用物質の同定は、プラスミド特異的プライマーと獲物プラスミドを配列決定することによって達成されます。 細菌は、操作とその宿主の代謝を利用するか、防御機構を回避し、異なる細菌分泌系19、20、21を介してエフェクター分子を分泌するために様々な戦略を開発しました。これらの細菌のエフェクターの結合パートナーを決定することは、このようホストでの操作経路を特定するための最初のステップです。これは、特定の病原性のメカニズムの理解の向上につながります。 Y2Hスクリーンはphytoplasmoses中の細菌エフェクターの相互作用を同定するために実施され、多くの場合、Y2Hは、ファイトプラズマ研究22、23の分子病原性機構のさらなる特徴付けのための重要な最初の実験です。しかし、会いましたほとんどの出版物におけるHOD説明はかなり希少であり、これらの技術は、多くの場合、バイオテクノロジー企業に外注しています。この方法の実現可能性に注意を引くために、このプロトコルは、その自然宿主における細菌エフェクター分子の相互作用パートナーを識別するためのステップバイステップの情報を提供します。 幅広い用途とY2H画面の早送りアプローチにもかかわらず、それは特定の相互作用は酵母系で発生していない可能性があることを忘れてはなりません。これは、酵母細胞は、特定の生物学的な制限が「 インビボ反応容器」の一種として使用されるという事実によるものです。いくつかの著者は、Y2H及びその誘導体11、24、25、26、27の利点と欠点に対処しています。一般的な考慮事項は、酵母細胞は、適切なを提供しない場合があること、例えば、遺伝子発現、（後）の翻訳、またはそれぞれのタンパク質の転条件が検討されて。これは、画面内の偽陰性の結果につながることができます。正の相互作用は、順番にアーティファクトすることができ、（ すなわち、適切な宿主内でのエフェクターの場合には）自然な状況で発生していない可能性があります。より密接に関連する生物学的システムにおける独立した相互作用試験で異種酵母発現系の相互作用を確認することが不可欠です。 本研究では、非耕作植物病原体マリCandidatusファイトプラズマ（P.のマリ）からエフェクターATP_00189の結合パートナーを同定しました。結果は、リンゴの増殖28、欧州29に影響を受けたリンゴに成長している地域では高い経済的損失の原因となる疾患の症状の開発の根底にある分子メカニズムに重要な洞察を提供します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1514">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:565px;">Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:211px;">Applichem</td>
			<td style="width:324px;">A6284</td>
			<td style="width:415px;">for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trishydroxymethylaminomethane (Tris)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodiumchloride (NaCl)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2942</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2937</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">N-Lauroylsarcosin sodium salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A7402</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ammonium acetate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>9688</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1108</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3928</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>51976</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNAse</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2760</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chloroform:Isoamyl 24:1</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1935</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proofreading Polymerase (e.g. iProof)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>203433</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EcoRI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SalI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0641</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1493</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td>for self-activation assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Arginine Monohydrochloride&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3680</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Isoleucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3642</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-lysine Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3448</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Methionine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3897</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Phenylalanine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3464</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Threonine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3946</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tyrosine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3401</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Uracile</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0667</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Valine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3406</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Adenine Hemisulfate Salt&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1596</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.22 &#181;m Pore Filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16541</td>
			<td>for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Histidine Monohydrochloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3719</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Leucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3496</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tryptophane&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3410</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Nitrogen Base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51483</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1349</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-1</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peptone</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2208</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyethylene Glycol 4000 (PEG)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1249</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3478</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Salmon Sperm DNA&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2159</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-719</td>
			<td>for Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PLN350</td>
			<td>for plasmid purification from yeast and bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acid Washed Glass Beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>for plasmid purification from yeast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0839</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Extract</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1552</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z368245 (Sigma)</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bait vector (e.g. pLexA-N)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Prey vector (e.g. pGAD-HA)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control prey vector (e.g. pLexA-p53)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control bait vector (e.g. pACT-largeT)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C640003</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3&#916;200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>676 051</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td>for quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free)</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2500010</td>
			<td>for PCR and DNA works</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpell</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0301</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile filter (0.22 &#181;m; Polyethersulfone))</td>
			<td>VWR-International</td>
			<td>514-0073 (European Catalogue number)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 90 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633180</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 150 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>639161</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer (e.g. BioPhotometer)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>550507804</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WB7</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Western Blot Equipment</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>diverse</td>
			<td>for protein detection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dNTPs</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2201210</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 ml; 1000 ml; 2000 ml) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z232793, Z232858, Z232866</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaking Incubator (e.g. GFL 3031)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3031</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>KB 53 (E3.1)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825)</td>
			<td>Omniwash</td>
			<td>IF 825</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2 ml, 1.5 ml and 2.0 ml Reaction Vials (Polypropylene)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10-1000 &#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>diverse</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SPR-L-S01</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3617000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T4-Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fridge (4&#176;C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>81.767.580.4</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Freezer (-20&#176;C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>G5216</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Graduated Cylinder (e.g. Brand)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z327352; Z327417; Z327441&#160;&#160;</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S55701</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2)</td>
			<td>Integra-Biosciences</td>
			<td>155000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cuvettes for Electroporation (1 mm)</td>
			<td>Molecular Bio Products</td>
			<td>5510-11</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electroporator (e.g. Eporator)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 ml)</td>
			<td>VWR-International&#160;</td>
			<td>525-0403 (European Catalogue number)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 ml)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dithiothreitol (DTT, e.g. DTT, 1M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM))</td>
			<td>Ambion&#160;</td>
			<td>AM8110G (distributed by Thermo Scientific)</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2021 Sigma&#160;</td>
			<td>for yeast culture (ready-made mix)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen

病気の症状の分子機構をUnravellingする植物科学における病理および症状の発展を理解することが重要です。細菌は、自分の利益のためにそれらの宿主代謝を操作するために異なる戦略を進化させてきました。この細菌の操作は、多くの場合、重度の症状の開発や影響を受けた植物の死に連結されています。ホスト操作を担当する特定の細菌の分子を決定することは、微生物学的研究の重要な分野となっています。呼ばれるこれらの細菌の分子の同定後、「エフェクター、「彼らの機能を解明することが重要です。エフェクターの機能を決定するための直接的なアプローチは、酵母ツーハイブリッド（Y2H）画面を介して、その自然宿主でのタンパク質性結合パートナーを同定することです。通常、ホストは、 インシリコのアルゴリズム内の任意により十分に予測できない多数の潜在的な結合パートナーを保有します。したがってperfoするための最良の選択であります表現宿主タンパク質のライブラリ全体に対して仮想的なエフェクターで画面をRM。原因物質は、ファイトプラズマのような耕せないであれば、特に困難です。このプロトコルは、ファイトプラズマ感染木本宿主植物、潜在的なエフェクターの増幅、およびY2Hスクリーンでの植物の分子相互作用パートナーのその後の識別からのDNA精製のためのステップバイステップの手順を説明します。 Y2Hスクリーンが一般的に使用されているにもかかわらず、コストでY2Hサービスを提供していますバイオテクノロジー企業にこの技術をアウトソーシングする傾向があります。このプロトコルは、標準的な実験室技術を使用して任意のまともな装備の分子生物学研究室でY2Hを実行する方法について説明します。

実際Y2H画面を行うことができる前に、餌は、自己活性化のためにテストする必要があります。これは、空の餌ライブラリーベクターと共にベイト発現ベクターを形質転換し、選択プレート上での増殖を検査することによって達成されます。 ベイトプラスミドはTRPを補完し、獲物がS.セレビシエ NMY51 40のレイの栄養要求性をプラスミド部5で説明したようにphytoplasmalタンパク質ATP_00189が自己活性化であるか否かを分析するために、自己活性化試験を行いました。成功した同時形質転換は、このようにtrpおよびロイシンを欠く選択プレート上での増殖によって特徴づけられます。ベイトおよびプレイタンパク質の相互作用は、NMY51の彼とADEの栄養要求性の相補性につながります。相互作用の非存在下での餌による自己活性化が表示された場合、酵母は彼とADEを欠く選択プレート上で成長します。強者と弱者の自己活性化が発生する可能性があります。餌の強い自己活性化は、TRP-レイ-彼-ADE枯渇選択プレート上で同時形質転換した酵母の増殖を特徴とします。弱い自己活性化はなく、TRP-レイ-彼-ADE枯渇選択プレート上のtrp-leuへ-彼の成長につながります。適切な陽性対照は、自己活性化アッセイの結果を解釈するために不可欠です。自己活性化アッセイおよびそれらの解釈の期待される結果の概要を表1に提供され、 図1に可視化されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> 図1：Y2H スクリーンを実行する前に、ベイトのベイト自己活性化テストの例 。 、弱い自己活性化に加えて、空の獲物天秤座：S.セレビシエ NMY51はポジティブコントロール（AC左パネル ）として（PLEX-p53の）および獲物（PACT-largeT）餌を相互作用で同時形質転換しました。RYベクトル（ 中央のパネル：DF）とされない自己活性化餌プラス空の獲物のライブラリーベクター（ 右パネル：GI）。 、TRP、レイと彼：同時形質転換した酵母は、trpおよびレイ（、D、G上のパネル ）欠けているSDプレート上で培養した（ 中央のパネルを：B、E、H）とのtrp、レイ、彼とADE（ 下パネル：C、F、I）。ベイトベクターはNMY51のレイの栄養要求性（SD-TRP-レイ上での成長）のtrp栄養要求性と獲物のベクトルを補完するようtrpおよびレイを欠く培地上での選択は、同時形質転換の成功のための陽性対照です。ベイトおよびプレイや餌の自己活性化の間の相互作用の場合には、NMY51のレポーター発現がオンになり、彼とADEの栄養要求性（SD-TRP-レイ-彼-ADE上での成長）を補完します。弱い自己活性化は、SD-TRP-レイ-彼のプレート上で成長することを特徴とする（ 中央のパネルは、df）。餌の弱い自己活性化は、前に餌を分析するために減少されなければなりませんY2H画面において、選択培地に3-ATを添加することによって、例えば 。アミノ酸の枯渇がで示されている「 - 」それぞれのメディア名に。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td>なし</td><td>コロニー</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td></tr><tr><td>なし</td><td> pGAD-HA </td><td>全く成長しません</td><td>コロニー</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td>なし</td><td>コロニー</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> pGAD-HA </td><td>コロニー</td><td>コロニー</td><td&gt;コロニー</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td></tr><tr><td> pLexA-p53を</td><td> PACT-largeT </td><td>コロニー</td><td>コロニー</td><td>コロニー</td><td>コロニー</td><td>コロニー</td></tr><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> pGAD-HA </td><td>コロニー</td><td>コロニー</td><td>コロニー</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td></tr></tbody></table> 表1：ベイト自己活性化アッセイで予想される結果。 S.セレビシエ NMY51の変換は、同時形質転換ベイトおよびプレイの特性に基づいて選択培地上の差動の成長にもたらします。選択プレート上での増殖は、30℃で72時間のインキュベーション後の異なるベクターの組合せ（AF）の形質転換の際に評価しました。弱い自己活性化は、SD-TRP-レイ-彼-ADE選択プラット上の成長によってSD-TRP-レイ - 彼との強い自己活性化に酵母増殖によって特徴付けられます相互作用パートナーの不在下でES。 pLexA-N符号化されたphytoplasmalエフェクターATP_00189はNMY51が彼とADEの非存在下で増殖するように形質転換された餌ベクトルのできないことによって特徴づけられる自己活性化を示しません。 餌に応じて、Y2H画面は選択プレート上で増殖する多数の酵母クローンを得ることができます。全てのクローンを分析し、可能な冗長性をチェックする必要があります。正規化されたcDNAライブラリーが使用された場合でも、インタラクターは、多くの異なるクローンで表される可能性が高いです。ライブラリーのクローニング技術によって、完全な遺伝子の断片のみが、いくつかの餌ベクターに挿入することも可能です。 （cDNAから）を増幅し、相互作用物質の完全長遺伝子をサブクローニングし、1対1 Y2H分析（ 図2）での相互作用をテストするために新たにすることが賢明です。 <img aLT = &quot;図2&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 55150 / 55150fig2.jpg&quot; /&gt; 図2：Y2H 実験で、ベイトとプレイとの間の相互作用の例。酵母ツーハイブリッド（Y2H）画面を実施し、陽性の相互作用因子のクローンからプラスミドを精製しました。獲物ベクターは、配列決定したとマルスのx domesticaホスト相互作用パートナーMdTCP24とMdTCP25が同定されました。 （何の相互作用因子がY2Hライブラリ画面で確認されなかったために）ネガティブコントロールMdTCP34として並列にサブクローニングしました。完全長遺伝子は、餌ベクター（共cistronically活性化ドメインADを発現する）およびデノボ DNA結合ドメイン（BD）に接続された細菌のエフェクターATP_00189を発現ベイトベクターで同時形質転換にサブクローニングリンゴのcDNAから増幅しました。この数字は28から取得されます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">拡大表示するにはここをクリックしてください。</a>この図のバージョン。

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Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

細菌のエフェクタータンパク質は、成功した感染を確立するために重要です。このプロトコルは、その自然の植物宿主における細菌のエフェクタータンパク質のタンパク質性結合パートナーの実験的同定を記載します。酵母ツーハイブリッドスクリーニングを介してこれらのエフェクターの相互作用を同定することは、分子病原性戦略の解明に重要なツールとなっています。

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Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Research

JoVE Journal

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