Name: unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen
Uploaded: 2017-01-20T13:00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen at JoVE.com

Vi takker Christine Kerschbamer, Thomas Letschka, Sabine Oettl, Margot Raffeiner, og Florian Senoner fra Laimburg Research Centre og Mirelle Borges Dias Schnetzer fra Dualsystems Biotech AG for teknisk support og Julia Strobl for korrekturlesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble utført som en del av APPL2.0 prosjektet og ble delvis finansiert av den autonome provinsen Bozen / Bolzano, Italia og Sør tyrolsk Apple Consortium.

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

I Y2H skjermen, er potensialet effektorproteinet co-uttrykkes med ulike hypotetiske samspill proteiner (trinn 7). Hver voksende gjær klone inneholder agn, men en (potensielt) annerledes Interactor. De samvirkende proteiner er kodet i en cDNA-bibliotek som er klonet inn i plasmider byttedyr. Agn og byttedyr plasmider hver co-cistronically kode for en del av en gjær transkripsjonsfaktor. I tilfelle av en fysisk interaksjon mellom agnet (effektor) og en byttet plasmid-kodet Interactor, er de to transkripsjonsfaktor deler (det DNA-bindende domene og aktiverings domene) forent, og reportergenet ekspresjonen induseres. Den gjær er i stand til å vokse på histidine- og adenin-utarmet SD seleksjonsskålene. Den type av byttedyr cDNA bibliotek er avhengig av den screenet effektor og må velges tilsvarende. Byttet og agn vektor, så vel som gjærstamme, må være kompatible. I denne skjermen, en Lexa DNA-bindende domene og Gal4 aktivering domain ble anvendt som de kompatible gjær transkripsjonsfaktor-enheter. CDNA-bibliotek kan være individuelt konstruert, skreddersydde, eller kommersielt oppnådd. Utarbeidelse av cDNA byttedyr bibliotek er ikke en del av denne protokollen. I denne protokollen, ble en selvkonstruert, normalisert cDNA bibliotek fra RNA av Malus x domestica bladene brukes og klonet inn pGAD-HA 41. Effektoren (agn) -expressing gjærstamme ble transformert med byttedyr bibliotek, og kloner ble selektert på histidine- og adenin-utarmet SD seleksjonsskålene. For å ekstrahere plasmid-DNA fra gjærkolonier blir en kolonne basert DNA plasmid mini-kit for bakterier ved kombinasjon med en mekanisk ødeleggelse trinn ved anvendelse av glasskuler for å forbedre gjær lyse (trinn 8). I dette plasmid rensing, vil agnet og byttet vektoren skal renses samtidig i forholdsvis lave konsentrasjoner. Imidlertid er mengden av plasmid DNA som er nok til å identifisere interaksjonen partner gjennom sekvensering vettHout før plasmid forplantning (trinn 8.4). Som et alternativ kan DNA ble renset i trinn 8.4 blir transformert inn i kompetente E. coli og selektert med byttedyr vektor-formidlet antibiotika resistens (f.eks ampicillin det i tilfelle av pGAD-HA). Den valgte E. coli kolonier bære bare pGAD-HA bibliotek plasmid, og high-yield plasmid rensing kan utføres med disse kloner. Den vellykkede transformasjon av pLexA-N og pGAD-HA konstruksjoner utfyller tryptofan og leucine auxotrofi av NMY51. En interaksjon mellom effektor og et protein (kodet på pGAD-HA) fører til aktivering av reportersystem i NMY51 stammer. I tilfelle av selvaktivering, NMY51 transformert med effektor som uttrykker pLexA-N i kombinasjon med den tomme bibliotek vektoren pGAD-HA vokser på selektive plater mangler trp-leu-his-ade, på grunn av uønsket aktivering av NMY51 rapportørsystemet 40. Den selvaktivering kan være wEAK og kan forekomme i fravær av trp-leu-sin, eller aktiveringen kan være sterk og karakterisert ved vekst på trp-leu-his-ade plater 41. Selv-aktivering kan føre til en massiv bakgrunn av falsk-positive kloner i selve Y2H skjermen. For å unngå dette, må en selvaktiveringstesten med agn bli utført, hvor effektor-uttrykkende vektor er ko-transformert med den tomme vektoren biblioteket. I denne eksperimentelle innstillingen, må reporter genekspresjon ikke fremkalles. Dersom selvaktivering (det vil si vekst på selektive plater) er synlig i testen, kan mediet være supplert med forskjellige konsentrasjoner av 3-amino-1,2,4-triazol 45 (3-AT). 3-AT er en inhibitor av imidazoleglycerol-fosfat-dehydratase (HIS3), et enzym som er viktig i løpet av histidin biosyntese 46. Tilskudd med 3-AT kan redusere de svake effekten av selv-aktivering under Y2H skjermer 47,48. Forskjellige konsentrasjoner av 3-AT bør testes. I denne protokollen, en - ble 40 mm 3-AT brukt. Den laveste konsentrasjonen som fører til undertrykkelse av selv-aktivering senere skulle bli brukt i Y2H skjermen. De selektive plater av den selvaktiveringstest kan bare vurderes hvis SD-trp-Leu plater av den ko-transformasjonen inneholde et tilstrekkelig antall kloner. Som en indikasjon ≥ 500 kolonier pr 90 mm (diameter) petriskål er tilstrekkelig. For å fastslå den eksakte transfeksjon effektivitet, anbefales det å forberede serielle fortynninger av co-transformert gjær og å spre dem på SD-trp-Leu plater. For å redusere selv-aktivering, kan effektor bli klonet inn i pLexA-C, et agn ekspresjonsvektor som smelter lexa koden til den C-terminale enden av proteinet. Orienteringen av Lex-A tag kan svekke selvaktivering 24. Det er imidlertid ikke mulig i alle tilfeller å redusere eller oppheve selvaktivering. Dannelsen avrød eller rødlig kolonier indikerer en svak eller falsk-positiv samhandling. Den ADE2 reportergen av NMY51 aktiveres kun når det kommer til et protein-protein interaksjon, som i sin tur blokkerer oppbygging av et rødt fargestoff i denne gjærstamme 40. I fravær av en interaksjon, NMY51 er rødlig, mens koloniene som bærer sterke interactors er hvite. Observasjonen av kolonien farge på seleksjonsplater gir dermed en ytterligere viktig hint for å bedømme om de respektive koloniene er sant-eller falske positive interactors. Det er til slutt nødvendig å tilpasse eller endre visse innstillinger assay med hensyn til arten av agn og interaksjons egenskaper. Nå er det etablert en rekke forbedringer og avledede teknikker av felles Y2H å tillate analyse av heller vanskelige protein interaksjoner i forskjellige vertssystemer. En gjennomgang av Stynen et al. 49-adresser ennd beskriver ulike aspekter av Y2H, sine forbedringer, og tilpasninger, og dermed gir nyttig informasjon om hvordan du velger riktig samspill analysen. Y2H skjermer og avledet teknikker har blitt mye brukt i ulike forskningsfelt, hvor identifisering av binære protein interaksjoner er nødvendig. Selv om kritiske kontroller blir utført, slik som selvaktiveringstester av agn og en-til-en re-transformasjoner av de identifiserte samspill proteiner, er det Y2H tilbøyelige til å produsere falske resultater 26, 50, 51. Den gjær som en modell er ikke egnet for alle interaksjonsstudier. Gjær ikke nødvendigvis utgjør et cellulært miljø som støtter den aktuelle post-translasjonell modifikasjon og folding for hvert protein 24. Videre er det i den Y2H omgivelser, proteinene blir over-uttrykt, og deres ekspresjon er ikke styreledet av deres naturlige promoter. Den Y2H tvinger de proteinholdige interaksjonspartnere til kjernen, noe som ikke nødvendigvis er deres naturlige subcellulære bestemmelsessted. De innfødte cellulære omstendighetene samspillet dermed ikke bli reflektert av gjær og kan føre til falske negative eller falske positive resultater. Mest Y2H er basert på komplementering gjær auxotrofi som et selektivt prinsipp. Dette ernæringsmessige valget er kjennetegnet ved høy følsomhet, men på bekostning av redusert selektivitet i forhold til andre (f.eks kromogen reporter)-analysene 49. Hvis ureduserbare selv-aktivering (se ovenfor) eller andre begrensninger forekommer for en bestemt effektorfunksjon, er det ikke Y2H et passende assay 25. I tabell 1 og figur 1, blir de forventede resultatene av den selvaktiveringstesten er gitt. Fraværet av reelle interaksjoner (dvs. falske negativer) kan være forårsaket av protein toksisitet feil translatoriske proteinprosessering, sterisk hindring av samspillet, underrepresenterte samhandlingspartnere i byttet bibliotek, membran lokalisering av agn, eller manglende komponenter som er nødvendige for samhandling 24. Det anbefales til de novo forsterke full-lengde gen av de identifiserte samspill proteinet fra cDNA, subklone det inn i pGAD-HA, og utføre en en-til-en interaksjon assay ved å transformere den genererte pGAD-HA konstruere inn i agn-uttrykk NMY51 belastning. Dette er nødvendig fordi den observerte Interactor tilstede i byttet biblioteket kan bare være et fragment av et større protein. Men informasjonen for den respektive full lengde genet er bare tilgjengelig hvis betydelig genomisk og transcriptomic sekvens data er tilgjengelig. Transformasjonen protokoll for den selvaktiveringstest som er beskrevet her kan anvendes for en slik én-til-én analyse, og interaksjonen mellom agn og den Interactor må være reproduserbare. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Interaksjoner identifisert i en Y2H skjermen må alltid bekreftes av en annen uavhengig teknikk. Denne uavhengige teknikk må være nærmere den naturlige innstilling av selve protein-protein interaksjon. I tilfelle av phytoplasmal effektor ATP_00189 ble samhandlingen med TCP transkripsjonsfaktorer av Malus x domestica verifiseres i planta med bimolecular fluorescerende complementation (BiFC) i Nicotiana benthamiana protoplaster 28 (ikke en del av denne protokollen). Effektoren protein ATP_00189 ble avledet fra planten patogen P. mali. I planta BiFC ble dermed valgt å verifisere ATP_00189 samhandling med Malus x domestica transkripsjonsfaktorer tidligere er identifisert i Y2H 28. BiFC er et protein-protein interaksjon assay som ikke krever den subcellulære translokasjon av de samvirkende proteiner til kjernen for å aktivere rapportørsystemet &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 52. Videre i planta uttrykk og modifikasjon maskiner etterligner miljøet av den naturlige samspillet mellom anlegget bakterielle effektor i sitt anlegg vert. Imidlertid er en global skjermen ved hjelp BiFC ikke gjennomførbart. Det er flere trinn i protokollen som må nøye opp. Når forsterke genet av interesse (trinn 4), er det viktig å utelukke at primerne binder seg til plante-DNA. Således DNA fra ikke-infiserte plantene skal inngå som en negativ kontroll. Sekvensen av genet av interesse, må ikke inneholde EcoRI- og Sall-restriksjonsseter som anvendes for retnings kloning av innsatsen. Hvis sekvensen ikke inneholder disse områdene, må forskjellige restriksjonsenzymer for kloning velges. Gjær transformasjon er en sentral metode i løpet av denne protokollen. Transfeksjonseffektiviteten avhenger kompetansen av gjærcellene, deres levedyktighet, veksten tilstand, og kvaliteten på transfeksjon Reagent 53, 54. For den foreslåtte protokollen, er det sterkt anbefalt å bruke gjær fra ferske plater ikke eldre enn to uker (holdt ved 4 ° C) når du utfører transformasjoner. Ofte er veksten av transformerte gjær forsinket når selektive flytende kulturer inokuleres med kolonier fra gamle agarplater. Det er også nyttig å anvende en flytende starterkultur som et inokulum for den faktiske eksperimenter og ikke å bruke gjær direkte fra platen. Lav effektivitet når trans byttet i agn-uttrykke gjær kan føre til underrepresentasjon av visse byttedyr proteiner (potensielle interactors) og kan dermed forskyve hele skjermen. I denne protokollen, en gjær transfeksjon effektivitet på ~ 150 000 cfu / ug transfektert DNA i Y2H fungerte bra. Kjenne feil og ulempene ved Y2H teknikk og tolke resultatene på en kritisk og hensiktsmessig måte er uunnværlig for å tegne korrect konklusjoner. Y2H analyser og derivater er blitt brukt i mange år og har vært gjenstand for mange forbedringer og tilpasninger med hensyn til de forskjellige agn egenskaper, den subcellulære lokalisering av interaksjon, de forventede bindingspartnere, og andre faktorer som kan være nødvendig for interaksjon (se Y3H 55, 56, 57). Nylig har arraybaserte Y2H skjermer blitt utviklet som muliggjør automatisert, high-throughput analyser av en rekke baits mot millioner av byttedyr 58. Den mest sannsynlige fremtidige ligger i automatisering og high-throughput tilnærminger til denne analysen for å muliggjøre belysning av komplekse signalveier og interactomes i forskjellige forskningsfelt.

<html> Gjær to-hybrid skjermer (Y2H) ble utviklet for ca. 27 år siden 1, og har siden vært mye brukt i ulike felt for å bestemme spesifikke protein-protein interaksjoner 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 . Den fysiske interaksjon av en bakteriell effektor med en vert målprotein er ofte en forutsetning for den funksjonelle manipulering av denne målprotein. Analysere disse interaksjoner har flyttet til fokus for mange ulike sektorer av infeksjon biologi 12, 13, 14, 15,&quot;&gt; 16, 17, 18. Prinsippet for Y2H skjermen er at vekselvirkningen mellom to proteiner fører til omdanning av et funksjonelt transkripsjonsfaktor som driver ekspresjonen av reportergener. Det kjente effektor (&quot; agn &quot;) er translatorisk smeltet til det DNA-bindende domene (DBD) av transkripsjonsfaktor, og de potensielle interaksjonspartnere (det &quot;bytte&quot;) er fusjonert til aktiveringsdomenet (AD) av den respektive transkripsjonsfaktor. Siden samspill partner er ukjent, et bibliotek av potensiell interactors er klonet inn i den såkalte &quot;bytte-bibliotek.&quot; normalt er dette bibliotek laget ved kloning av cDNA i en passende bytte vektor ekspresjonsplasmid som koder for det AD som er kompatibel med agn-vektor kodet DBD. i tilfelle av en interaksjon, er rekonstituerte transkripsjonsfaktorer induserer ekspresjon av rapportørgener, noe som vanligvis gjør at veksten utvalg av gjær. denidentifikasjon av interactors er oppnådd ved sekvensering av plasmidet byttet med plasmid-spesifikke primere. Bakterier har utviklet ulike strategier for å manipulere og utnytte deres verts stoffskifte eller for å unngå forsvarsmekanismer og skiller effektor molekyler via ulike bakterie sekresjon systemer 19, 20, 21. Bestemme bindingspartnere av disse bakterie effektorer er dermed det første skrittet i å identifisere den manipulerte sti i verten. Dette fører til en bedre forståelse av de konkrete patogenitet mekanismer. Y2H skjermene er utført for å identifisere bakterie effektor interaksjoner under phytoplasmoses, og ofte er Y2H et viktig innledende eksperiment for ytterligere karakterisering av molekylære mekanismer patogenitet i phytoplasma forskning 22, 23. Imidlertid møttehod beskrivelse i de fleste publikasjonene er ganske knappe, og disse teknikkene er ofte outsourcet til bioteknologiselskaper. Å trekke oppmerksomheten mot muligheten for denne metoden, gir denne protokollen trinn-for-trinn-informasjon til å identifisere interaksjonspartnere til en bakteriell effektor molekylet i sin naturlige vert. Til tross for den utstrakte bruken og spole frem tilnærming Y2H skjermer, må det ikke glemmes at visse interaksjoner ikke kan oppstå i gjær system. Dette skyldes det faktum at gjærcellen er brukt som en slags &quot;in vivo reaksjonsbeholder&quot; med visse biologiske begrensninger. Flere forfattere har behandlet de fordeler og ulemper ved Y2H og dets derivater 11, 24, 25, 26, 27. Generelle betraktninger er, for eksempel, at gjærcellen ikke kan gi den riktigegenuttrykk, (post-) translasjonsforskning, eller translocational forhold for de respektive proteiner som studeres. Dette kan føre til falske negative resultater i skjermen. Positive interaksjoner kan i sin tur være gjenstander og kan ikke forekomme i den naturlige situasjon (dvs. i tilfelle av effektorer i den passende vert). Det er således uunnværlig for å bekrefte interaksjonen fra den heterologe gjærekspresjon system med en uavhengig interaksjonstest i en mer nært beslektet biologisk system. I denne studien ble bindende partnere av effektor ATP_00189 fra den ikke-dyrkbar plante patogen Candidatus phytoplasma mali (P. mali) identifisert. Resultatene gir viktig innsikt i de molekylære mekanismene bak symptomutvikling av eple spredning 28, en sykdom som forårsaker høye økonomiske tap i berørte eple voksende regioner i Europa 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1514">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:565px;">Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:211px;">Applichem</td>
			<td style="width:324px;">A6284</td>
			<td style="width:415px;">for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trishydroxymethylaminomethane (Tris)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodiumchloride (NaCl)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2942</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2937</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">N-Lauroylsarcosin sodium salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A7402</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ammonium acetate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>9688</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1108</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3928</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>51976</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNAse</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2760</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chloroform:Isoamyl 24:1</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1935</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proofreading Polymerase (e.g. iProof)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>203433</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EcoRI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SalI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0641</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1493</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td>for self-activation assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Arginine Monohydrochloride&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3680</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Isoleucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3642</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-lysine Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3448</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Methionine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3897</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Phenylalanine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3464</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Threonine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3946</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tyrosine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3401</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Uracile</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0667</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Valine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3406</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Adenine Hemisulfate Salt&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1596</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.22 &#181;m Pore Filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16541</td>
			<td>for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Histidine Monohydrochloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3719</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Leucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3496</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tryptophane&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3410</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Nitrogen Base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51483</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1349</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-1</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peptone</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2208</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyethylene Glycol 4000 (PEG)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1249</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3478</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Salmon Sperm DNA&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2159</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-719</td>
			<td>for Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PLN350</td>
			<td>for plasmid purification from yeast and bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acid Washed Glass Beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>for plasmid purification from yeast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0839</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Extract</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1552</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z368245 (Sigma)</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bait vector (e.g. pLexA-N)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Prey vector (e.g. pGAD-HA)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control prey vector (e.g. pLexA-p53)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control bait vector (e.g. pACT-largeT)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C640003</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3&#916;200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>676 051</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td>for quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free)</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2500010</td>
			<td>for PCR and DNA works</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpell</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0301</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile filter (0.22 &#181;m; Polyethersulfone))</td>
			<td>VWR-International</td>
			<td>514-0073 (European Catalogue number)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 90 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633180</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 150 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>639161</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer (e.g. BioPhotometer)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>550507804</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WB7</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Western Blot Equipment</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>diverse</td>
			<td>for protein detection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dNTPs</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2201210</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 ml; 1000 ml; 2000 ml) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z232793, Z232858, Z232866</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaking Incubator (e.g. GFL 3031)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3031</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>KB 53 (E3.1)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825)</td>
			<td>Omniwash</td>
			<td>IF 825</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2 ml, 1.5 ml and 2.0 ml Reaction Vials (Polypropylene)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10-1000 &#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>diverse</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SPR-L-S01</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3617000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T4-Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fridge (4&#176;C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>81.767.580.4</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Freezer (-20&#176;C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>G5216</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Graduated Cylinder (e.g. Brand)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z327352; Z327417; Z327441&#160;&#160;</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S55701</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2)</td>
			<td>Integra-Biosciences</td>
			<td>155000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cuvettes for Electroporation (1 mm)</td>
			<td>Molecular Bio Products</td>
			<td>5510-11</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electroporator (e.g. Eporator)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 ml)</td>
			<td>VWR-International&#160;</td>
			<td>525-0403 (European Catalogue number)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 ml)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dithiothreitol (DTT, e.g. DTT, 1M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM))</td>
			<td>Ambion&#160;</td>
			<td>AM8110G (distributed by Thermo Scientific)</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2021 Sigma&#160;</td>
			<td>for yeast culture (ready-made mix)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen

Unravelling de molekylære mekanismene for sykdomstegnene er viktig å forstå sykdommer og symptomutvikling i plantevitenskap. Bakterier har utviklet seg ulike strategier for å manipulere sine verts metabolismen til sin egen fordel. Dette bakteriell manipulasjon er ofte kombinert med alvorlig symptom utvikling eller død av de berørte anleggene. Bestemme spesifikke bakterie molekylene ansvarlige for verts manipulasjon er blitt et viktig felt i mikrobiologisk forskning. Etter identifiseringen av disse bakterielle molekyler, som kalles &quot;effektorer&quot;, er det viktig å klargjøre deres funksjon. En enkel metode for å bestemme funksjonen av en effektor er å identifisere dets proteinholdige bindingspartner i sin naturlige vert via et gjær to-hybrid (Y2H) skjerm. Normalt vert havner mange potensielle bindingspartnere som ikke kan forutses tilstrekkelig med noen i silico algoritme. Det er derfor det beste valget for å PERFOrm en skjerm med den hypotetiske effektor mot et helt bibliotek av uttrykte verts proteiner. Det er spesielt utfordrende hvis den utløsende agent er uncultivable som phytoplasma. Denne protokollen gir trinnvise instruksjoner for DNA-rensing fra en phytoplasma-infisert woody vertsplanten, forsterkning av potensialet effektor, og den påfølgende identifikasjon av fabrikkens molekylær interaksjon partner med en Y2H skjerm. Selv om Y2H skjermer blir ofte brukt, det er en trend å outsource denne teknikken til bioteknologiske selskaper som tilbyr den Y2H tjenesten til en pris. Denne protokollen gir instruksjoner om hvordan du utfører en Y2H i enhver anstendig utstyrt molekylærbiologi laboratorium ved hjelp av standard laboratorieteknikker.

Før selve Y2H skjermen kan utføres agnet må testes for selvaktivering. Dette oppnås ved å omdanne agnet ekspresjonsvektoren sammen med den tomme byttet biblioteket vektor og kontrollere vekst på selektive plater. For å analysere om phytoplasmal protein ATP_00189 er selvaktiverende, ble selvaktiveringstest utført som beskrevet i kapittel 5. agn plasmidet utfyller trp og byttet plasmid den leu auxotrofi av S. cerevisiae NMY51 40. En vellykket co-transformasjon er således preget av vekst på selektive plater mangler trp og leu. Samspill mellom agn og byttedyr protein fører til et supplement til hans og ade auxotrofi av NMY51. Dersom selvaktivering av agnet i fravær av en påvirkning på, vokser gjær på selektive plater som mangler sitt og ade. Sterk og svak selvaktivering kan forekomme. Sterk egenaktivering av agnet er karakterisert ved vekst av det ko-transformert gjær på trp-leu-his-ade utarmet seleksjonsskålene. Svak selvaktivering som fører til vekst på trp-leu-his men ikke på trp-leu-his-ade utarmet seleksjonsskålene. Riktig positive kontroller er uunnværlig for å tolke resultatene av den selvaktiveringstest. En oppsummering av forventede resultatene av den selvaktiveringstest og deres tolkning er gitt i tabell 1 og anskueliggjort på figur 1. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> Figur 1: Eksempel på Bait Selvaktiverings Tester av en Bait Før du utfører en Y2H Screen. S. cerevisiae NMY51 ble co-transformert med samspill agn (Plex-p53) og byttedyr (pACT-Larget) som en positiv kontroll (venstre panel: ac), et svakt selvaktiverende pluss en tom byttedyr library vektor (midtre panelet: df) og en ikke selvaktiverende agn pluss en tom byttedyr bibliotek vektor (panel høyre: GI). Den ko-transformert gjær ble dyrket i SD-plater mangler trp og leu (øvre panel: a, d, g), trp, leu og hans (midtre panel: b, e, h) og Trp, Leu, hans og ade (nedre panel: c, f, i). Utvalg på middels mangler trp og leu er en positiv kontroll for vellykket co-transformasjon, som agn vektor utfyller trp auxotrofi og byttet vektor leu auxotrofi av NMY51 (vekst på SD-trp-leu). Ved et samspill mellom agn og byttedyr eller en selv aktivering av agn, er reporter uttrykk for NMY51 slått på og utfyller hans og ade auxotrofi (vekst på SD-trp-leu-sin-ade). En svak selvaktivering er preget av vekst på SD-trp-Leu-hans plater (midtpanelet, df). Svak egenaktivering av et åte, må være redusert som før for å analysere agneti en Y2H skjerm, for eksempel ved tilsetning av 3-AT den selektive media. Aminosyre nedbryting, er angitt med &quot;-&quot; i den respektive medienavn. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> none </td><td> kolonier </td><td> ingen vekst </td><td> ingen vekst </td><td> ingen vekst </td><td> ingen vekst </td></tr><tr><td> none </td><td> pGAD-HA </td><td> ingen vekst </td><td> kolonier </td><td> ingen vekst </td><td> ingen vekst </td><td> ingen vekst </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> none </td><td> kolonier </td><td> ingen vekst </td><td> ingen vekst </td><td> ingen vekst </td><td> ingen vekst </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> pGAD-HA </td><td> kolonier </td><td> kolonier </td><td&gt; kolonier </td><td> ingen vekst </td><td> ingen vekst </td></tr><tr><td> pLexA-p53 </td><td> pACT-Larget </td><td> kolonier </td><td> kolonier </td><td> kolonier </td><td> kolonier </td><td> kolonier </td></tr><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> pGAD-HA </td><td> kolonier </td><td> kolonier </td><td> kolonier </td><td> ingen vekst </td><td> ingen vekst </td></tr></tbody></table> Tabell 1: Forventet Resultater i en Bait Self-aktivering analysen. Omformingen av S. cerevisiae NMY51 gir i differensial vekst på selektive medier basert på egenskapene til co-transform agn og byttedyr. Vekst på selektive plater ble evaluert ved transformasjon av ulike vektorkombinasjoner (AF) etter 72 timers inkubasjon ved 30 ° C. Svak selvaktivering er karakterisert ved gjærvekst på SD-trp-leu-his og sterk egenaktivering ved vekst på SD-trp-leu-his-ade utvalg plates i fravær av en interaksjon partner. Den pLexA-N kodet phytoplasmal effektor ATP_00189 ikke oppviser selv-aktivering, som er kjennetegnet ved den manglende evne av agnet vektoren transformeres NMY51 til å vokse i fravær av hans og ade. Avhengig av agn, kan en Y2H skjermen får mange gjær kloner vokser på selektive plater. Alle kloner må analyseres og sjekkes for mulige oppsigelser. Selv om en normalisert cDNA-bibliotek har blitt brukt, er det meget sannsynlig at en Interactor er representert i mange forskjellige kloner. Avhengig av biblioteket kloning teknikk, er det også mulig at bare fragmenter av hele genet er satt inn i en del byttedyr vektorer. Det er derfor tilrådelig å forsterke de novo (fra cDNA) og subklone hele lengden genet av Interactor og å teste interaksjon i en en-til-en Y2H analyse (Figur 2). <img alt = &quot;Figur 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55150 / 55150fig2.jpg&quot; /&gt; Figur 2: Eksempel på en Samspill mellom agn og byttedyr i en Y2H Experiment. En gjær to-hybrid (Y2H) skjerm ble utført og plasmider fra positive Interactor kloner ble renset. Byttet vektor ble sekvensert og Malus x domestica vert interaksjonspartnere MdTCP24 og MdTCP25 ble identifisert. Som en negativ kontroll MdTCP34 (som det ikke Interactor ble identifisert i Y2H biblioteket skjermen) ble subklonet i parallell. Den fulle lengde gener ble amplifisert fra eple cDNA subklonet inn i byttet vektor (co-cistronically uttrykker aktiveringsdomenet AD) og de novo ko-transformert med agn vektor som uttrykker det bakterielle effektor ATP_00189 koplet til det DNA-bindende domene (BD). Dette tallet er hentet fra 28. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se et større</a>versjon av denne figuren.

Watch this Scientific Journal Video about Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen at JoVE.com

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Bakterielle effektor-proteiner er viktig for å etablere vellykkede infeksjoner. Denne protokollen beskriver den eksperimentelle identifisering av proteinholdige bindingspartnere for et bakterielt effektor protein i dets naturlige plantevert. Identifisere disse effektor interaksjoner via gjær to-hybrid-skjermer er blitt et viktig verktøy i å rakne molekylære patogenitet strategier.

Unravelling funksjons av en bakteriell Effector fra en ikke-dyrkbar Plant Patogen Ved hjelp av en gjær to-hybrid skjerm

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induksjon av transplantat-mot-vert-sykdom og<em&gt; In Vivo</em&gt; T Cell overvåking ved hjelp av en MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

Kvantifisering av Fungal Colonization, Sporogenesis, og produksjon av mykotoksiner Bruk Kernel bioassay

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Den<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mus Modell: Studerer patogen og Host Bidrag til infeksiøs kolitt

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automatisert Separering av<em&gt; C. elegans</em&gt; Trinnløs kolonisert av en bakteriell Patogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Oppdager Cortex Fragmenter Under Bakteriell Spore Spiring

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Vurdere Netthinne microglial fagocyttfunksjon<em&gt; I Vivo</em&gt; Ved hjelp av en flowcytometrisystemer basert analyse

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...