Name: unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen
Uploaded: 2017-01-20T13:00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen at JoVE.com

Agradecemos Christine Kerschbamer, Thomas Letschka, Sabine Oettl, Margot Raffeiner, e Florian Senoner do Centro de Pesquisa Laimburg e Mirelle Borges Dias Schnetzer de Dualsystems Biotech AG para apoio técnico e Julia Strobl pela revisão do manuscrito. Este trabalho foi realizado como parte do projeto APPL2.0 e foi parcialmente financiado pela Província Autónoma de Bozen / Bolzano, Itália e Apple Consórcio Sul tirolesa.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Na tela de Y2H, a proteína efectora potencial é co-expressa com diferentes proteínas que interagem hipotéticas (passo 7). Cada clone de levedura crescendo contém a isca, mas um (potencialmente) interagente diferente. As proteínas que interagem são codificados numa biblioteca de ADNc que foi clonada em plasmídeos de presa. A isca ea presa plasmídeos cada código de co-cistronically para uma parte de um factor de transcrição de levedura. No caso de uma interacção física entre o isco (efector) e um interactor codificada pelo plasmídeo presa, as duas partes do factor de transcrição (o domínio de ligação de ADN e o domínio de activação) são unidos, e a expressão do gene repórter é induzida. A levedura é capaz de crescer em placas de selecção SD histidine- e empobrecido-adenina. O tipo de biblioteca de ADNc de presa é dependente do efector rastreados e devem ser escolhidos em conformidade. O vector isco e presa, assim como a estirpe de levedura, devem ser compatíveis. Nesta tela, o domínio ea domai activação Gal4 de ligação a DNA LexAN foram utilizados como as unidades do factor de transcrição de levedura compatíveis. A biblioteca de cDNA podem ser construídos individualmente, feito à medida, ou obtidos comercialmente. A preparação da biblioteca presa cDNA não faz parte do presente protocolo. Neste protocolo, uma biblioteca de cDNA normalizada auto-construídas a partir do ARN das folhas domestica x Malus foi usada e clonado em pGAD-HA 41. O efector (isca) -expressing estirpe de levedura foi transformada com a biblioteca de presa, e os clones foram seleccionados em placas de selecção SD histidine- e empobrecido-adenina. Para extrair ADN de plasmídeo a partir das colónias de levedura, um plasmídeo de DNA Mini Kit à base de coluna para as bactérias é recomendada em combinação com um passo de ruptura mecânica utilizando esférulas de vidro para melhorar a lise de levedura (passo 8). Neste purificação do plasmídeo, a isca e o vector presa serão purificados simultaneamente em concentrações relativamente baixas. No entanto, a quantidade de DNA de plasmídeo é suficiente para identificar o parceiro de interacção através de sequenciação witHout propagação plasmídeo antes (passo 8.4). Como alternativa, o ADN purificado no passo 8.4 pode ser transformado em competentes de E. coli e com a resistência aos antibióticos seleccionados mediada por vector de presa (por exemplo, ampicilina no caso de o pGAD-HA). A E. coli seleccionada colónias transportar apenas o plasmídeo biblioteca pGAD-HA, e a purificação do plasmídeo de alto rendimento podem ser realizadas com estes clones. A transformação bem-sucedida de construções pLexA-N e pGAD-HA complementa o triptofano e leucina auxotrofia de NMY51. Uma interacção entre o efector e uma proteína (codificada no pGAD-HA) conduz à activação do sistema repórter em estirpes NMY51. No caso de auto-activação, NMY51 transformada com o efector expressando pLexA-N em combinação com o vector de biblioteca vazio pGAD-HA cresce em placas selectivas falta Trp-Leu-His-ade, devido à activação indesejada do sistema repórter NMY51 40. A auto-ativação pode ser wEAK e pode ocorrer na ausência de Trp-Leu-His, ou a activação pode ser forte e caracteriza-se por crescimento em placas de Leu-Trp-His-ade 41. Auto-ativação pode causar um fundo maciço de clones falso-positivos na tela Y2H real. Para evitar isso, deve ser realizado um teste de auto-activação com a isca, em que o vector que expressa efectora é co-transformada com o vector vazio biblioteca. Nesta configuração experimental, a expressão do gene repórter não deve ser induzido. Se o auto-activação (isto é, crescimento em placas selectivas) é visível no teste, o meio pode ser suplementado com diferentes concentrações de 3-amino-1,2,4-triazole 45 (3-AT). 3-AT é um inibidor da desidratase imidazoleglycerol-fosfato (HIS3), uma enzima importante na biossíntese de histidina 46. A suplementação com 3-AT pode reduzir os efeitos fracos de auto-activação durante 47 Y2H telas,48. Diferentes concentrações de 3-AT deve ser testado. Neste protocolo, 1 - foram utilizados 40 mM 3-AT. A concentração mais baixa que leva à repressão da auto-ativação deve ser posteriormente utilizado na tela de Y2H. As placas selectivas do ensaio de auto-activação só pode ser avaliada, se as placas de SD-Trp-Leu do co-transformação contêm um número suficiente de clones. Como uma indicação ≥ 500 colónias por 90 mm (diâmetro) placa de Petri são suficientes. Para determinar a eficiência de transfecção exacta, recomenda-se para preparar diluições em série de levedura co-transformadas e espalhá-los em placas de SD-Trp-Leu. Para reduzir a auto-activação, o efector pode ser clonado pLexA-C, um vector de expressão de isca que funde a etiqueta de LexA para o C-terminal da proteína. A orientação do Lex-A tag pode atenuar auto-ativação 24. No entanto, isso não é possível em todos os casos para reduzir ou abolir a auto-activação. A formação decolónias vermelhas ou avermelhadas indica uma interação fraca ou falso-positivo. O gene repórter de ADE2 NMY51 só é activada quando se trata de uma interacção proteína-proteína, o que por sua vez bloqueia a acumulação de um corante vermelho nesta estirpe de levedura 40. Na ausência de interacção, NMY51 são avermelhada, enquanto que as colónias possuindo interactores fortes são brancos. A observação da cor das colónias nas placas de selecção proporciona, assim, uma outra sugestão importante para avaliar se as respectivas colónias são interactores ou verdadeiro-falso-positivos. É, eventualmente necessário adaptar ou modificar certas configurações de ensaio no que respeita à natureza do isco e as características de interacção. Até agora, um certo número de melhoramentos e técnicas de derivados do Y2H comum foram estabelecidas para permitir a análise de interacções entre proteínas bastante difíceis em diferentes sistemas hospedeiros. A revisão por Stynen et al. 49 endereços de umnd descreve diferentes aspectos da Y2H, suas melhorias e adaptações, e, portanto, fornece informações úteis sobre como escolher o ensaio de interação adequada. telas y2h e técnicas derivados tornaram-se amplamente utilizado em diferentes campos de pesquisa, onde é necessária a identificação de interações proteína binários. Mesmo se os controles críticos sejam executadas, tais como testes de auto-ativação da isca e um-para-um re-transformações das proteínas que interagem identificados, a Y2H é propenso a produzir falsos resultados 26, 50, 51. A levedura como um modelo não é adequado para todos os estudos de interacção. Levedura não constitui necessariamente um ambiente celular que suporte a modificação pós-tradução adequada e dobrável para todas as proteínas 24. Além disso, na configuração Y2H, as proteínas são sobre-expressos, e a sua expressão não é controleliderados por seu promotor natural. O Y2H obriga os parceiros de interacção proteicos para o núcleo, o qual não é necessariamente o seu destino subcelular natural. As circunstâncias celulares nativas da interação, portanto, não pode ser refletida pela levedura e pode levar a resultados falso-negativos ou falso-positivos. A maior parte são baseados em Y2H complementação levedura auxotrofia como princípio selectivo. Esta selecção nutricional caracteriza-se por sensibilidade elevada, mas à custa da diminuição da selectividade em comparação com outros (por exemplo, repórter cromogénico) ensaios 49. Se o auto-activação unreducible (ver acima) ou outras limitações ocorrer durante um certo efectora, o Y2H não é um ensaio apropriado 25. Na Tabela 1 e na Figura 1, os resultados esperados do teste de auto-activação são dadas. A ausência de interacções real (isto é, os falsos negativos) pode ser causado pela toxicidade da proteína, a proteína de translação incorrectaprocessamento, o impedimento estereoquímico da interacção, parceiros de interacção sub-representados na biblioteca de presa, a localização da membrana da isca, em falta ou componentes necessários para a interacção 24. Recomenda-se de novo amplificar o gene de comprimento total da proteína que interage identificados a partir de ADNc, subclonar-lo em pGAD-HA, e realizar um ensaio de interacção de um-para-um, transformando o gerado pGAD-HA arquétipo na isca que expressam estirpe NMY51. Isto é necessário uma vez que a observada interactor presente na biblioteca de presa pode ser apenas um fragmento de uma proteína maior. No entanto, a informação para o respectivo gene completo somente é acessível se considerável de dados de sequência genômica e transcriptomic está disponível. O protocolo de transformação para o ensaio de auto-activação descrito aqui pode ser aplicado para um tal ensaio de um-para-um, e a interacção entre a isca e interactor deve ser reprodutível. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Interações identificados em uma tela Y2H deve sempre ser confirmado por uma outra técnica independente. Esta técnica independente deve estar mais perto do cenário natural da interação proteína-proteína real. No caso do ATP_00189 phytoplasmal efetoras, a interação com os fatores de transcrição TCP de Malus x domestica foi verificada in planta com complementação fluorescente bimolecular (BiFC) em Nicotiana benthamiana protoplastos 28 (não faz parte deste protocolo). O ATP_00189 proteínas efetoras foi derivado da planta patógeno P. mali. Em BiFC planta foi assim escolhido para verificar as interações ATP_00189 com os fatores de transcrição x Malus domestica anteriormente identificada na Y2H 28. BiFC é um ensaio de interacção proteína-proteína que não requer a translocação subcelular das proteínas que interagem para o núcleo, a fim de activar o sistema repórter &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 52. Além disso, as in planta de expressão e de máquinas modificação imita o ambiente da interação natural entre o efetoras bacteriana planta em sua planta hospedeira. No entanto, uma tela global, utilizando BiFC não é viável. Existem várias etapas no protocolo que deve ser cuidadosamente abordada. Ao amplificar o gene de interesse (Passo 4), é importante excluir a possibilidade de os iniciadores se ligam a DNA da planta. Assim, o ADN a partir de plantas não-infectadas deve ser incluído como um controlo negativo. A sequência do gene de interesse não tem de conter os locais de restrição EcoRI e Sall que são usados ​​para a clonagem direccional do inserto. Se a sequência não conter estes locais, diferentes enzimas de restrição para a clonagem deve ser escolhido. transformação de levedura é um método central durante este protocolo. A eficiência de transfecção depende da competência das células de levedura, a sua viabilidade, o estado de crescimento, e a qualidade do Reag transfecçãoent 53, 54. Para o protocolo proposto, é altamente recomendado o uso de leveduras a partir de placas frescos não mais de duas semanas (mantida a 4 ° C) ao realizar as transformações. Muitas vezes, o crescimento de leveduras transformadas é retardada quando as culturas líquidas selectivos são inoculados com as colónias de placas de agar de idade. É também útil utilizar uma cultura de arranque de líquido como um inoculo para as experiências reais e não usar a levedura directamente a partir da placa. Baixa eficiência quando transfecção da presa em levedura expressando isca pode levar à sub-representação de certas proteínas da presa (potenciais interatores) e pode, assim, deforme toda a tela. Neste protocolo, a eficiência de transfecção de levedura de ~ 150.000 ufc / g de ADN transfectado no Y2H funcionou bem. Conhecer as falhas e os inconvenientes da técnica Y2H e interpretar os resultados de forma crítica e adequada é indispensável para desenhar o correct conclusões. ensaios Y2H e os seus derivados têm sido utilizadas há muitos anos e têm sido objecto de muitas melhorias e adaptações no que respeita às diferentes características de isco, a localização subcelular da interacção, os parceiros de ligação esperados, e outros factores que possam ser necessários para a interacção (ver Y3H 55, 56, 57). Recentemente, telas Y2H baseadas em matrizes que têm sido desenvolvidos para permitir a análise automatizada, de alto rendimento de numerosas iscos contra milhões de presas 58. O futuro provavelmente reside nas abordagens de automatização e de alto rendimento para este ensaio para permitir a elucidação das vias de sinalização complexas e interactoma em diferentes áreas de investigação.

<html> Levedura telas de dois híbridos (y2h) foram desenvolvidos cerca de 27 anos atrás 1 e já foram amplamente utilizado em vários campos para determinar interações específicas proteína-proteína 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 . A interacção física de um efector bacteriana com uma proteína alvo do hospedeiro muitas vezes é a condição prévia para a manipulação funcional desta proteína alvo. Analisando essas interações mudou-se para o foco de diversos setores da infecção biologia 12, 13, 14, 15,&quot;&gt; 16, 17, 18. O princípio da tela de Y2H é que a interacção entre duas proteínas leva à reconstituição de um factor de transcrição funcional, que dirige a expressão de genes repórter. O efector conhecido (o&quot; isco &quot;) é fundida na tradução com para o domínio de ligação de DNA (DBD) do factor de transcrição, e os potenciais parceiros de interacção (o &quot;presas&quot;) está fundida com o domínio de activação (AD) do respectivo factor de transcrição. uma vez que o parceiro de interacção é desconhecida, uma biblioteca de potenciais interactores é clonado no assim chamado &quot;presa-biblioteca&quot;. Normalmente, esta biblioteca é feita por clonagem de ADNc num plasmídeo adequado expressão presa vector que codifica o anúncio que é compatível com a isca-vector codificado DBD. no caso de uma interacção, o factores de transcrição reconstituída induzir a expressão de genes repórter, que geralmente permitem a selecção de crescimento de levedura. oidentificação dos interactores é obtida por sequenciação do plasmídeo presa com iniciadores específicos para o plasmídeo. As bactérias desenvolveram várias estratégias para manipular e explorar o metabolismo do seu hospedeiro ou para fugir mecanismos de defesa e secretam moléculas efetoras através de diferentes sistemas de secreção bacterianas 19, 20, 21. Determinando os parceiros de ligação destes efectores bacterianas é, assim, o primeiro passo para identificar a via manipulada no hospedeiro. Isto leva a uma melhor compreensão dos mecanismos de patogenicidade específicos. Y2H telas são realizadas para identificar interacções bacterianas efectoras durante phytoplasmoses, e, muitas vezes, Y2H é uma experiência inicial crucial para a posterior caracterização dos mecanismos moleculares de patogenicidade em investigação phytoplasma 22, 23. No entanto, o metA inscrição hod na maioria das publicações é bastante escassa, e essas técnicas muitas vezes são terceirizadas para empresas de biotecnologia. Para chamar a atenção para a viabilidade deste método, este protocolo fornece informações passo-a-passo para identificar parceiros de interação de uma molécula efectora bacteriana em seu hospedeiro natural. Apesar da ampla utilização e a abordagem de avanço rápido de telas y2h, não se deve esquecer que certas interações podem não ocorrer no sistema de levedura. Isto é devido ao facto de a célula de levedura é usado como uma espécie de &quot;in vivo vaso de reacção&quot; com certas limitações biológicas. Vários autores têm abordado as vantagens e desvantagens de Y2H e seus derivados 11, 24, 25, 26, 27. Considerações gerais são, por exemplo, que a célula de levedura pode não proporcionar a adequadaa expressão do gene, (pós-) translacional, ou condições translocational para as respectivas proteínas em estudo. Isso pode levar a resultados falso-negativos na tela. Interacções positivas podem por sua vez ser artefactos e pode não ocorrer na situação natural (ou seja, em caso de efectores no hospedeiro apropriado). É, portanto, indispensável para confirmar as interacções do sistema de expressão de levedura heteróloga com um teste de interacção independente num sistema biológico mais intimamente relacionados. Neste estudo, foram identificados os parceiros de ligação do ATP_00189 efetoras do patógeno de planta não-cultiváveis Candidatus Phytoplasma mali (P. mali). Os resultados fornecem importantes insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento dos sintomas da proliferação de maçã 28, uma doença que causa grandes perdas econômicas em regiões de cultivo de maçã afetados na Europa 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1514">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:565px;">Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:211px;">Applichem</td>
			<td style="width:324px;">A6284</td>
			<td style="width:415px;">for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trishydroxymethylaminomethane (Tris)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodiumchloride (NaCl)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2942</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2937</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">N-Lauroylsarcosin sodium salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A7402</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ammonium acetate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>9688</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1108</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3928</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>51976</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNAse</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2760</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chloroform:Isoamyl 24:1</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1935</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proofreading Polymerase (e.g. iProof)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>203433</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EcoRI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SalI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0641</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1493</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td>for self-activation assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Arginine Monohydrochloride&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3680</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Isoleucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3642</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-lysine Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3448</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Methionine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3897</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Phenylalanine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3464</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Threonine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3946</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tyrosine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3401</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Uracile</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0667</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Valine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3406</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Adenine Hemisulfate Salt&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1596</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.22 &#181;m Pore Filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16541</td>
			<td>for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Histidine Monohydrochloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3719</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Leucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3496</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tryptophane&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3410</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Nitrogen Base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51483</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1349</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-1</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peptone</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2208</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyethylene Glycol 4000 (PEG)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1249</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3478</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Salmon Sperm DNA&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2159</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-719</td>
			<td>for Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PLN350</td>
			<td>for plasmid purification from yeast and bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acid Washed Glass Beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>for plasmid purification from yeast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0839</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Extract</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1552</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z368245 (Sigma)</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bait vector (e.g. pLexA-N)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Prey vector (e.g. pGAD-HA)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control prey vector (e.g. pLexA-p53)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control bait vector (e.g. pACT-largeT)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C640003</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3&#916;200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>676 051</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td>for quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free)</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2500010</td>
			<td>for PCR and DNA works</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpell</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0301</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile filter (0.22 &#181;m; Polyethersulfone))</td>
			<td>VWR-International</td>
			<td>514-0073 (European Catalogue number)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 90 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633180</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 150 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>639161</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer (e.g. BioPhotometer)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>550507804</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WB7</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Western Blot Equipment</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>diverse</td>
			<td>for protein detection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dNTPs</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2201210</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 ml; 1000 ml; 2000 ml) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z232793, Z232858, Z232866</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaking Incubator (e.g. GFL 3031)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3031</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>KB 53 (E3.1)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825)</td>
			<td>Omniwash</td>
			<td>IF 825</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2 ml, 1.5 ml and 2.0 ml Reaction Vials (Polypropylene)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10-1000 &#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>diverse</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SPR-L-S01</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3617000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T4-Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fridge (4&#176;C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>81.767.580.4</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Freezer (-20&#176;C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>G5216</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Graduated Cylinder (e.g. Brand)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z327352; Z327417; Z327441&#160;&#160;</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S55701</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2)</td>
			<td>Integra-Biosciences</td>
			<td>155000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cuvettes for Electroporation (1 mm)</td>
			<td>Molecular Bio Products</td>
			<td>5510-11</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electroporator (e.g. Eporator)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 ml)</td>
			<td>VWR-International&#160;</td>
			<td>525-0403 (European Catalogue number)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 ml)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dithiothreitol (DTT, e.g. DTT, 1M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM))</td>
			<td>Ambion&#160;</td>
			<td>AM8110G (distributed by Thermo Scientific)</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2021 Sigma&#160;</td>
			<td>for yeast culture (ready-made mix)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen

Desvendando os mecanismos moleculares de manifestações da doença é importante compreender patologias e desenvolvimento de sintomas em ciência das plantas. As bactérias têm evoluído diferentes estratégias para manipular seu metabolismo de acolhimento para seu próprio benefício. Esta manipulação bacteriana é muitas vezes associada com o desenvolvimento de sintomas graves ou a morte das plantas afetadas. Determinar as moléculas responsáveis ​​bacterianas específicas para a manipulação de acolhimento tornou-se um importante campo de pesquisa microbiológica. Após a identificação destas moléculas bacterianas, chamados &quot;efectores,&quot; é importante para elucidar a sua função. Uma abordagem simples para determinar a função de um efector é identificar o seu parceiro de ligação proteináceo no seu hospedeiro natural através de uma tela de levedura de dois híbridos (Y2H). Normalmente, o anfitrião abriga numerosos parceiros de ligação potenciais que não podem ser previstos suficientemente por qualquer algoritmo em silico. É, portanto, a melhor escolha para perform a tela com o efetor hipotética contra toda uma biblioteca de proteínas do hospedeiro expressas. É especialmente difícil se o agente causador não é cultivável como fitoplasma. Este protocolo fornece instruções passo-a-passo para a purificação de DNA a partir de uma planta infectada-fitoplasma acolhimento lenhosa, a amplificação do effector potencial, bem como a identificação posterior de parceiro de interacção molecular da planta com uma tela Y2H. Apesar de telas y2h são comumente usados, há uma tendência de terceirizar essa técnica para empresas de biotecnologia que oferecem o serviço Y2H a um custo. Este protocolo fornece instruções sobre como executar uma Y2H em qualquer laboratório de biologia molecular decentemente equipados usando técnicas de laboratório padrão.

Antes da tela Y2H real pode ser realizada a isca deve ser testada para a auto-activação. Isto é conseguido através da transformação do vector de expressão de isca em conjunto com o vector vazio biblioteca presa e verificar o crescimento em placas selectivas. Para analisar se o ATP_00189 proteína phytoplasmal é auto-activação, o teste de auto-ativação foi realizada como descrito no capítulo 5. O plasmídeo isca está complementando o trp ea presa plasmídeo a auxotrofia leu de S. cerevisiae NMY51 40. Um co-transformação bem sucedida é assim caracterizada por crescimento em placas selectivas e falta Trp Leu. Interação da isca e uma proteína presa leva a uma complementação do seu e ade auxotrofia de NMY51. Se a auto-activação da isca na ausência de uma interacção parece, a levedura cresce em placas selectivas e a sua falta ADE. auto-fortes e fracosactivação pode ocorrer. auto-activação forte da isca é caracterizada por um crescimento da levedura co-transformadas em placas de selecção Trp-Leu-His-ade empobrecido. auto-activação fraco leva ao crescimento em Trp-Leu-His mas não em placas de selecção Trp-Leu-His-ade empobrecido. controlos positivos adequados são indispensáveis ​​para a interpretação dos resultados do ensaio de auto-ativação. Um resumo dos resultados esperados do ensaio de auto-activação e a sua interpretação é fornecida na Tabela 1 e visualizado na Figura 1. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> Figura 1: Exemplo de Isca testes de auto-ativação de uma isca antes de executar uma tela Y2H. S. cerevisiae NMY51 foi co-transformada com interagindo isca (Plex-p53) e presa (PACT-larget) como um controlo positivo (painel esquerdo: ac), uma fraca auto-ativação, mais uma presa vazia libravector ry (painel do meio: df) e uma isca não é auto-ativação, mais um vector de biblioteca presa vazio (painel direito: gi). A levedura co-transformadas foram cultivadas em placas de SD falta trp e leu (painel superior: a, d, g), Trp, Leu e seu (painel do meio: b, E, H) e Trp, Leu, His e ade (inferior painel: C, F, I). Selecção no meio sem trp e leu é um controlo positivo para a co-transformação bem sucedida, tal como o vector isco complementa a auxotrofia trp e o vector presa a auxotrofia de NMY51 Leu (crescimento em SD-Trp-Leu). Em caso de uma interação entre a isca e presa ou uma auto-ativação da isca, a expressão repórter de NMY51 está ligado e complementa o dele e auxotrofia ade (crescimento em SD-trp-leu-a-ade). Uma fraco de auto-activação é caracterizado por um crescimento em SD-Trp-Leu-suas placas (painel do meio, DF). auto-ativação fraca de uma isca deve ser diminuída prévia para analisar a iscaem uma tela Y2H, por exemplo, adicionando 3-AT para a mídia seletiva. esgotamento de aminoácidos são indicados com &quot;-&quot;, no respectivo nome do papel. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> Nenhum </td><td> colónias </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td></tr><tr><td> Nenhum </td><td> pGAD-HA </td><td> nenhum crescimento </td><td> colónias </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> Nenhum </td><td> colónias </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> pGAD-HA </td><td> colónias </td><td> colónias </td><td&gt; colónias </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td></tr><tr><td> pLexA-p53 </td><td> pacto de larget </td><td> colónias </td><td> colónias </td><td> colónias </td><td> colónias </td><td> colónias </td></tr><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> pGAD-HA </td><td> colónias </td><td> colónias </td><td> colónias </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Resultados esperados em um ensaio de auto-ativação isca. A transformação de S. cerevisiae NMY51 produz no crescimento diferencial em meios selectivos com base nas características de isca co-transformado e presa. O crescimento em placas selectivas foi avaliada mediante a transformação de diferentes combinações de vectores (AF) após 72 h de incubação a 30 ° C. auto-activação fraco é caracterizado pelo crescimento de levedura em SD-Trp-Leu-His e auto-activação forte por crescimento em SD-Trp-Leu-His-ade plat selecçãoes na ausência de um parceiro de interação. O pLexA-N phytoplasmal codificado efectora ATP_00189 não exibem auto-activação, que se caracteriza pela incapacidade do vector isco transformado NMY51 para crescer na ausência da sua e ade. Dependendo do isco, uma tela Y2H pode obter numerosos clones de levedura que crescem em placas selectivas. Todos os clones devem ser analisados ​​e verificados para possíveis redundâncias. Mesmo se uma biblioteca de cDNA normalizada foi usado, é muito provável que um interactor é representado em muitos clones diferentes. Dependendo da técnica de clonagem de biblioteca, é também possível que apenas os fragmentos do gene completo, são inseridos em vectores de algumas presas. Assim, é aconselhável para amplificar de novo (a partir de ADNc) e subclonar o gene de comprimento completo do interactor e para testar a interacção de uma análise Y2H um-para-um (Figura 2). <img alt = &quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55150 / 55150fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2: Exemplo de uma interação entre Bait and Prey Em um experimento Y2H. Uma tela de levedura de dois híbridos (Y2H) foi realizado e os plasmídeos dos clones positivos foram purificados interactors. O vector presa foi sequenciado e foram identificados os Malus x domestica parceiros de interacção hospedeiro MdTCP24 e MdTCP25. Como um controlo negativo MdTCP34 (para os quais não foi identificado interactor no rastreio da biblioteca Y2H) foi subclonado em paralelo. Os genes de comprimento total foram amplificados a partir de ADNc de maçã, subclonado no vector de presa (co-cistronically expressando o domínio AD activação) e de novo co-transformada com o vector isco expressando o ATP_00189 efectora bacteriana acoplado ao domínio de ligação ao ADN (BD). Este valor é retirado a partir de 28. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma maior</a>versão desta figura.

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Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

proteínas efetoras bacterianas são importantes para o estabelecimento de infecções bem-sucedidas. Este protocolo descreve a identificação experimental de parceiros de ligação proteicas de uma proteína efetora bacteriana em seu hospedeiro natural da planta. A identificação dessas interações efetoras através de levedura telas de dois híbridos tornou-se uma ferramenta importante para desvendar as estratégias de patogenicidade moleculares.

Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis ​​meio de uma levedura Screen Two-hybrid

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

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