Name: unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen
Uploaded: 2017-01-20T13:00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen at JoVE.com

Мы благодарим Кристин Kerschbamer, Томас Letschka, Sabine Oettl, Маргот Raffeiner и Флориан Senoner из научно-исследовательского центра Laimburg и Мирель Borges Dias Schnetzer от Dualsystems Biotech AG за техническую поддержку и Юлии Штробле за вычитку рукописи. Эта работа была выполнена в рамках проекта APPL2.0 и частично финансируется за счет автономной провинции Больцано / Больцано, Италия и консорциум Южного Тироля Apple.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

<html> Дрожжи дигибридная экраны (Y2H) были разработаны около 27 лет назад 1 и с тех пор широко используется в различных областях , чтобы определить специфический белок-белковых взаимодействий , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , Физическое взаимодействие бактериальной эффектора с целевой хост белка часто является предварительным условием для функциональной манипуляции этого белка-мишени. Анализ этих взаимодействий переместилась в центре внимания многих различных секторов инфекции биологии 12, 13, 14, 15,&quot;&gt; 16, 17, 18. Принцип экрана Y2H является то , что взаимодействие двух белков приводит к восстановления функционального фактора транскрипции , который запускает экспрессию репортерных генов. Известное эффектор (далее&quot; приманка &quot;) трансляционно слитый к связывающим доменом ДНК (DBD) фактора транскрипции, и потенциальных партнеров взаимодействия ( «жертва») слиты с доменом активации (AD) соответствующего фактора транскрипции. Поскольку взаимодействие партнер неизвестна, библиотека потенциала interactors клонируют в так называемой &quot;добычи-библиотеки.&quot; как правило, эта библиотека сделана путем клонирования кДНК в соответствующий вектор экспрессии плазмиды вектора жертвы, кодирующей AD, который совместим с наживкой-вектором, кодируемого DBD. В случае взаимодействия, восстановленные факторы транскрипции, индуцируют экспрессию репортерных генов, которые в целом позволяют отобрать рост дрожжей.идентификация interactors достигается путем секвенирования добычу плазмиды с плазмидой специфических праймеров. Бактерии разработали различные стратегии , чтобы манипулировать и использовать метаболизм их хозяина или уклоняться от защитных механизмов и секретируют эффекторные молекулы с помощью различных бактериальных систем секреции 19, 20, 21. Определение связывающих партнеров этих бактериальных эффекторов, таким образом, первым шагом в определении манипулируют пути в хозяине. Это приводит к более глубокому пониманию конкретных механизмов патогенности. Y2H экраны выполняются для выявления бактериальных эффекторных взаимодействий во время phytoplasmoses, и часто, Y2H является одним из важнейших Первоначальный эксперимент для дальнейшей характеристики механизмов молекулярных патогенности в исследовании фитоплазменных 22, 23. Тем не менее, встретилкорыто описание в большинстве публикаций довольно мало, и эти методы часто переданы биотехнологическими компаниями. Для того, чтобы привлечь внимание к возможности этого метода, этот протокол обеспечивает шаг за шагом информации для идентификации партнеров взаимодействия бактериальной эффекторной молекулы в своем естественном хозяине. Несмотря на широкое применение и быстрый вперед подход экранов Y2H, не следует забывать, что некоторые взаимодействия не может привести к возникновению в системе дрожжей. Это связано с тем , что дрожжевые клетки используют в качестве своего рода &quot;в естественных условиях реакционный сосуд&quot; с определенными биологическими ограничениями. Некоторые авторы рассмотрели преимущества и недостатки Y2H и его производных 11, 24, 25, 26, 27. Общие соображения, например, что дрожжевая клетка не может обеспечить соответствующийэкспрессии гена, (пост-) поступательная или translocational условия для соответствующих белков изучается. Это может привести к ложно-отрицательных результатов на экране. Положительные взаимодействия могут быть в свою очередь артефактами и не может привести к возникновению в естественной ситуации (то есть в случае эффекторов в соответствующий хост). Таким образом, необходимо для подтверждения взаимодействия с гетерологичной системе экспрессии дрожжей с независимым тестом взаимодействия в более тесно связанной с биологической системой. В этом исследовании, были определены партнеры для связывания эффекторных ATP_00189 из не-возделываемых растений патогена Candidatus фитоплазменных мали (P. мали). Полученные результаты дают важную информацию о молекулярных механизмах , лежащих в основе развития симптомов яблочного пролиферации 28, болезнь , которая вызывает большие экономические потери в пострадавших яблоневых растущих регионов в Европе 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1514">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:565px;">Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:211px;">Applichem</td>
			<td style="width:324px;">A6284</td>
			<td style="width:415px;">for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trishydroxymethylaminomethane (Tris)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodiumchloride (NaCl)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2942</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2937</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">N-Lauroylsarcosin sodium salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A7402</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ammonium acetate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>9688</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1108</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3928</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>51976</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNAse</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2760</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chloroform:Isoamyl 24:1</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1935</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proofreading Polymerase (e.g. iProof)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>203433</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EcoRI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SalI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0641</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1493</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td>for self-activation assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Arginine Monohydrochloride&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3680</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Isoleucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3642</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-lysine Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3448</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Methionine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3897</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Phenylalanine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3464</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Threonine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3946</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tyrosine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3401</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Uracile</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0667</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Valine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3406</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Adenine Hemisulfate Salt&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1596</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.22 &#181;m Pore Filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16541</td>
			<td>for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Histidine Monohydrochloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3719</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Leucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3496</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tryptophane&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3410</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Nitrogen Base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51483</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1349</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-1</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peptone</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2208</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyethylene Glycol 4000 (PEG)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1249</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3478</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Salmon Sperm DNA&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2159</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-719</td>
			<td>for Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PLN350</td>
			<td>for plasmid purification from yeast and bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acid Washed Glass Beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>for plasmid purification from yeast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0839</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Extract</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1552</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z368245 (Sigma)</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bait vector (e.g. pLexA-N)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Prey vector (e.g. pGAD-HA)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control prey vector (e.g. pLexA-p53)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control bait vector (e.g. pACT-largeT)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C640003</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3&#916;200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>676 051</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td>for quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free)</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2500010</td>
			<td>for PCR and DNA works</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpell</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0301</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile filter (0.22 &#181;m; Polyethersulfone))</td>
			<td>VWR-International</td>
			<td>514-0073 (European Catalogue number)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 90 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633180</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 150 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>639161</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer (e.g. BioPhotometer)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>550507804</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WB7</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Western Blot Equipment</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>diverse</td>
			<td>for protein detection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dNTPs</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2201210</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 ml; 1000 ml; 2000 ml) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z232793, Z232858, Z232866</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaking Incubator (e.g. GFL 3031)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3031</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>KB 53 (E3.1)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825)</td>
			<td>Omniwash</td>
			<td>IF 825</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2 ml, 1.5 ml and 2.0 ml Reaction Vials (Polypropylene)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10-1000 &#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>diverse</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SPR-L-S01</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3617000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T4-Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fridge (4&#176;C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>81.767.580.4</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Freezer (-20&#176;C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>G5216</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Graduated Cylinder (e.g. Brand)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z327352; Z327417; Z327441&#160;&#160;</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S55701</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2)</td>
			<td>Integra-Biosciences</td>
			<td>155000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cuvettes for Electroporation (1 mm)</td>
			<td>Molecular Bio Products</td>
			<td>5510-11</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electroporator (e.g. Eporator)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 ml)</td>
			<td>VWR-International&#160;</td>
			<td>525-0403 (European Catalogue number)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 ml)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dithiothreitol (DTT, e.g. DTT, 1M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM))</td>
			<td>Ambion&#160;</td>
			<td>AM8110G (distributed by Thermo Scientific)</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2021 Sigma&#160;</td>
			<td>for yeast culture (ready-made mix)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen

Unravelling молекулярных механизмов проявлений болезни важно понимать патологии и развитие симптомов в растениеводстве науки. Бактерии развивались различные стратегии, чтобы манипулировать их метаболизм хозяина для своей собственной выгоды. Эта бактериальная манипуляция часто в сочетании с тяжелым развитием симптомов или смерти пострадавших растений. Определение специфических бактериальных молекул, ответственных за манипуляции хозяина стала важным полем в микробиологических исследований. После идентификации этих бактериальных молекул, называемых &quot;эффекторы,&quot; важно, чтобы выяснить их функцию. Прямолинейный подход к определению функции эффектора, чтобы идентифицировать его белковую связывающего партнера в своем естественном хосту через сито дрожжи дигибридная (Y2H). Обычно хост таит множество потенциальных партнеров по связыванию , которые не могут быть предсказаны достаточно любым в силикомарганца алгоритма. Таким образом, самый лучший выбор для PERFOгт экран с гипотетическим эффектора против целой библиотеки экспрессируемых белков хозяина. Это является особенно сложной задачей, если возбудителем является некультивируемые как фитоплазмы. Этот протокол обеспечивает шаг за шагом инструкции для очистки ДНК из растений фитоплазменных-инфицированных древесно-хозяина, усиления потенциального эффектора и последующего определения партнера молекулярного взаимодействия растения с экраном Y2H. Несмотря на то, что экраны Y2H обычно используются, существует тенденция передать эту технику для биотехнологических компаний, которые предлагают услуги Y2H по цене. Этот протокол содержит инструкции о том, как выполнить Y2H в любой прилично оборудованной лаборатории молекулярной биологии с использованием стандартных методов лаборатории.

Перед тем как фактический экран Y2H может быть выполнена приманка должна быть испытана для самостоятельной активации. Это достигается путем преобразования вектора экспрессии приманку вместе с пустым вектором библиотечной добычей и проверка роста на селективных планшетах. Для анализа phytoplasmal белок ATP_00189 является ли самоактивирующимися, тест самоактивацию проводили , как описано в разделе 5. Плазмиду приманка дополняет ГТО и добычей плазмиде лея ауксотрофию S. CEREVISIAE NMY51 40. Успешное сотрудничество преобразование, таким образом, характеризуется ростом на селективные пластин, не имеющих TRP и Leu. Взаимодействие приманки и добычей белка приводит к комплементации его и АДЭ ауксотрофию NMY51. При появлении самостоятельной активации с помощью приманки в отсутствие взаимодействия, дрожжи растут на селективных пластин, не имеющих его и АДЭ. Сильные и слабые само-активация может происходить. Сильное самоактивацию приманки характеризуется ростом котрансформированы дрожжей на Trp-Leu-His-Ade обедненный пластин селекции. Слабая самоактивацию приводит к росту на Trp-Leu-его, но не на Trp-Leu-его-ADE истощены пластин отбора. Надлежащие положительного контроля необходимы для интерпретации результатов анализа самостоятельной активации. Краткое описание ожидаемых результатов анализа самоактивацию и их интерпретация представлены в таблице 1 и визуализированы на рисунке 1. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> Рисунок 1: Пример Bait самоактивацию Испытания приманку Перед выполнением Y2H экрана. S.cerevisiae , NMY51 был котрансформируют с взаимодействующими приманку (PLEX-p53) и добычей (ПАКТ-largeT) в качестве положительного контроля (левая панель: переменный ток), слабо активирующего себе плюс пустая жертва Весахчень вектор (средняя панель: ДФ) и не самоактивирующимися приманки плюс пустой вектор библиотека жертва (правая панель: ГИ). Котрансформируют дрожжи культивировали на SD пластин , не имеющих TRP и Leu (верхняя панель: а, д, г), Trp, Leu и его (средняя панель: б, д, з) и Trp, Leu, его и АДЭ (низший панель: C, F, I). Выбор на среде, не содержащей ГТО и лея является положительный контроль для успешного сотрудничества трансформации, так как вектор приманка дополняет ГТО ауксотрофию и добычу вектор лея ауксотрофию NMY51 (рост на SD-Trp-Leu). В случае взаимодействия между приманкой и добычу или самоактивацию приманки, выражение репортер NMY51 включается и дополняет его и АДЭ ауксотрофию (рост на SD-Trp-Leu-His-ADE). Слабая самоактивацию характеризуется ростом на SD-Trp-Leu-его пластин (средняя панель, ДФ). Слабая самоактивацию приманки должна быть уменьшена до анализа приманкув экране Y2H, например , путем добавления 3-АТ к селективной среде. истощение аминокислот обозначены &quot;-&quot; в соответствующем имени носителя. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> никто </td><td> колонии </td><td> нет никакого роста </td><td> нет никакого роста </td><td> нет никакого роста </td><td> нет никакого роста </td></tr><tr><td> никто </td><td> pGAD-HA </td><td> нет никакого роста </td><td> колонии </td><td> нет никакого роста </td><td> нет никакого роста </td><td> нет никакого роста </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> никто </td><td> колонии </td><td> нет никакого роста </td><td> нет никакого роста </td><td> нет никакого роста </td><td> нет никакого роста </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> pGAD-HA </td><td> колонии </td><td> колонии </td><td&gt; колонии </td><td> нет никакого роста </td><td> нет никакого роста </td></tr><tr><td> pLexA-p53 </td><td> рАСТ-largeT </td><td> колонии </td><td> колонии </td><td> колонии </td><td> колонии </td><td> колонии </td></tr><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> pGAD-HA </td><td> колонии </td><td> колонии </td><td> колонии </td><td> нет никакого роста </td><td> нет никакого роста </td></tr></tbody></table> Таблица 1: Ожидаемые результаты в приманку самоактивацию анализа. Превращение С. CEREVISIAE NMY51 дает в дифференциальный рост на селективных средах , основанных на характеристиках котрансформируют приманку и добычу. Рост на селективных планшетах оценивали при трансформации различных комбинаций вектор (AF) после 72 ч инкубации при 30 ° С. Слабая самоактивацию характеризуется ростом дрожжей на SD-Trp-Leu-His и сильной самостоятельной активации роста на SD-Trp-Leu-его-ADE выбора Platэс в отсутствии партнера взаимодействия. PLexA-N кодируются phytoplasmal эффектор ATP_00189 не проявляет самоактивацию, которое характеризуется неспособностью вектора приманки преобразованного NMY51 расти в отсутствие его и АДЭ. В зависимости от приманки, экран Y2H может получить множество клонов дрожжей, растущих на селективных планшетах. Все клоны должны быть проанализированы и проверены на предмет возможных сокращений. Даже если использовалась нормализованная библиотека кДНК, весьма вероятно, что Interactor представлена ​​во многих различных клонов. В зависимости от библиотечной техники клонирования, также возможно, что только фрагменты полноразмерного гена вставляются в некоторых векторов добычи. Таким образом , целесообразно De Novo усиливать (из кДНК) и субклонирования полный ген длины интерактора и проверить взаимодействие в анализе Y2H один-к-одному (рис 2). <img aл = &quot;Рисунок 2&quot; SRC = &quot;/ файлы / ftp_upload / 55150 / 55150fig2.jpg&quot; /&gt; Рисунок 2: Пример взаимодействия между приманку и Prey в Y2H эксперименте. Экран с двумя гибридами дрожжей (Y2H) проводили и плазмиды из положительных клонов Interactor были очищены. Вектор добычу секвенировали и были определены Malus х Доместикой партнеров взаимодействия хост MdTCP24 и MdTCP25. В качестве отрицательного контроля MdTCP34 (для которых нет Interactor не был идентифицирован в библиотеке экране Y2H), субклонировали параллельно. Гены полной длины амплифицировали из кДНК яблока, субклонировали в вектор добычи (со-cistronically , выражающей активации домена AD) и заново котрансформируют с приманкой вектором , экспрессирующим бактериальной эффекторной ATP_00189 в сочетании с доменом связывания ДНК (BD). Эта цифра взята из 28. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">чтобы увидеть увеличенную</a>версия этой фигуры.

Watch this Scientific Journal Video about Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen at JoVE.com

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Бактериальные эффекторные белки имеют важное значение для создания успешных инфекций. Этот протокол описывает экспериментальную идентификацию белковыми связывающих партнеров бактериального эффекторной белка в его естественном растения-хозяина. Выявление этих эффекторных взаимодействий через дрожжей двух гибридных экранов стала важным инструментом в разгадке стратегии молекулярных патогенности.

Unravelling функцию Бактериальный эффектора от Non-возделываемых растений Возбудитель Использование дрожжей дигибридная экрана

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Использование люциферазы в Изображение Бактериальные инфекции у мышей

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Вторжение клеток человека от бактериальных патогенов

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Представляем напряжения сдвига в изучении бактериальной адгезии

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Использование EpiAirway модель Характеризуя Долгосрочные хост-возбудителя Взаимодействия

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Индукционная трансплантат против хозяина и<em&gt; В Vivo</em&gt; Т-клеток Мониторинг Использование MHC соответствием мышиной модели

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

Количественная грибковой колонизации, спорогенеза, и производство микотоксинов Использование ядра Биопробы

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: изучение патогенности и Хост Взносы в инфекционным колитом

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Автоматизированная Разделение<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Переменно колонизирована бактериальным патогеном

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Обнаружение Cortex Фрагменты Во время бактериальный прорастание спор

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Оценка сетчатке микроглии фагоцитарной функции<em&gt; В Vivo</em&gt; С использованием анализа проточной цитометрии на основе

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...