Name: unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen
Uploaded: 2017-01-20T13:00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen at JoVE.com

Vi tackar Christine Kerschbamer, Thomas Letschka, Sabine Oettl, Margot Raffeiner och Florian Senoner från Laimburg forskningscentret och Mirelle Borges Dias Schnetzer från Dualsystems Biotech AG för teknisk support och Julia Strobl för korrekturläsning manuskriptet. Detta arbete utfördes som en del av APPL2.0 projektet och delvis finansieras av den autonoma provinsen Bozen / Bolzano, Italien och sydtyrolska Apple Consortium.

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

I Y2H skärmen, är den potentiella effektor proteinet samuttrycks med olika hypotetiska interagerande proteiner (steg 7). Varje växande jäst klonen innehåller betet men en (potentiellt) olika Interactor. De interagerande proteinerna är kodade i ett cDNA-bibliotek som klonas in i bytes plasmider. Betet och bytet plasmiderna varje co-cistronically kod för en del av en jästtranskriptionsfaktor. I händelse av en fysisk interaktion mellan betet (effektor) och en byte plasmidkodad påverkare är de två transkriptionsfaktor delar (den DNA-bindande domänen och aktiveringsdomän) förenas, och reportergenen expression induceras. Jästen är i stånd att växa på histidine- och adenin-utarmat SD selektionsplattor. Den typ av byte-cDNA-bibliotek är beroende av det avskärmade effektor och måste väljas i enlighet därmed. Bytet och bete vektor, liksom jäststam, måste vara förenliga. I denna skärm, en LexA DNA-bindande domänen och Gal4 aktiverings domain användes som de kompatibla jästtranskriptionsfaktom enheter. CDNA-biblioteket kan individuellt konstrueras, specialtillverkat, eller erhållas kommersiellt. Framställningen av cDNA byte biblioteket är inte en del av detta protokoll. I detta protokoll, var egentillverkade, normaliserad cDNA-bibliotek från RNA av Malus x domestica blad används och klonades in i pGAD-HA 41. Effektorn (bete) -uttryckande jäststammen transformerades med bytet bibliotek och kloner selekterades på histidine- och adenin-utarmat SD selektionsplattor. Att extrahera plasmid-DNA från de jästkolonier, är en kolumnbaserad DNA-plasmid mini-kit för bakterier rekommenderas i kombination med en mekanisk sönderdelning steg med användning av glaspärlor för att förbättra jäst-lys (steg 8). I denna plasmid rening, kommer betet och bytet vektorn renas samtidigt i relativt låga koncentrationer. Emellertid är mängden av plasmid-DNA tillräckligt för att identifiera växelverkan partner genom sekvense witHout tidigare plasmid förökning (steg 8,4). Som ett alternativ kan DNA renas i steg 8,4 omvandlas till kompetent E. coli och selekterades med byte vektormedierad antibiotikaresistens (t.ex., ampicillin den i händelse av pGAD-HA). Den valda E. coli kolonier bär endast pGAD-HA bibliotek plasmid och högavkastande plasmidrening kan utföras med dessa kloner. Den framgångsrika omvandlingen av pLexA-N och pGAD-HA konstruktioner kompletterar tryptofan och leucin auxotrofi av NMY51. En interaktion mellan effektor och ett protein (kodad på pGAD-HA) leder till aktivering av reportersystemet i NMY51 stammar. I fallet med självaktivering, NMY51 transformerad med effektorn som uttrycker pLexA-N i kombination med den tomma biblioteket vektor pGAD-HA växer på selektiva plattor som saknar trp-leu-his-ade, på grund av den oönskade aktiveringen av NMY51 reportersystem 40. Den självaktivering kan vara weak och kan förekomma i frånvaro av trp-leu-his, eller aktiveringen kan vara stark och som kännetecknas av tillväxt på trp-Leu-his-ade plattorna 41. Självaktivering kan orsaka en massiv bakgrund av falskt positiva kloner i själva Y2H skärmen. För att undvika detta måste en självaktivering test med betet utföras, där effektorn uttrycker vektor samtransformeras med den tomma biblioteket vektor. I detta experimentella inställning måste reporter genuttryck inte framkallas. Om självaktivering (dvs tillväxt på selektiva plattor) är synlig i testet, kan mediet kompletteras med olika koncentrationer av 3-amino-1,2,4-triazol 45 (3-AT). 3-AT är en hämmare av imidazoleglycerol-fosfat dehydratas (HIS3), ett enzym som är viktigt vid histidin biosyntesen 46. Tillskott med 3-AT kan minska de svaga effekter av självaktivering under Y2H skärmar 47,48. Olika koncentrationer av 3-AT bör testas. I detta protokoll, en - var 40 mM 3-AT användes. Den lägsta koncentration som leder till förtryck av självaktivering bör därefter användas i Y2H skärmen. De selektiva plattor av självaktiveringsanalys det kan endast utvärderas om de SD-trp-Leu plattor av samtransformation innehåller ett tillräckligt antal kloner. Som en indikation ≥ 500 kolonier per 90-mm (diameter) petriskål är tillräckliga. Att fastställa den exakta transfektionseffektivitet, är det rekommenderat att framställa serieutspädningar av samtransformerade jäst och att sprida dem på SD-trp-Leu-plattor. För att minska självaktivering, kan effektorn klonas in pLexA-C, ett bete expressionsvektor som säkringar LexA tagg till C-terminalen av proteinet. Orienteringen av Lex-A tagg kan dämpa självaktivering 24. Det är emellertid inte möjligt att i varje enskilt fall för att minska eller avskaffa självaktivering. Bildandet avröda eller rödaktiga kolonier indikerar en svag eller falskt positivt samspel. Den ade2 reportergenen av NMY51 aktiveras bara när det kommer till en protein-proteininteraktion, vilket i sin tur blockerar ackumuleringen av ett rött färgämne i denna jäststam 40. I avsaknad av en interaktion, NMY51 är rödaktiga, medan kolonier som bär starka Interactmedlemmar är vita. Observation av kolonifärg på selektionsplattor ger således en ytterligare viktig ledtråd för att bedöma om de respektive kolonierna är sant-eller falskt positiva Interactmedlemmar. Det är slutligen nödvändigt att anpassa eller ändra vissa analys inställningar med hänsyn till den typ av bete och interaktionsegenskaper. Vid det här laget har ett antal förbättringar och derivattekniker för den gemensamma Y2H införts för att göra det möjligt att analysera ganska svåra proteininteraktioner i olika värdsystem. En översyn av Stynen et al. 49 adresser ennd beskriver olika aspekter av Y2H, dess förbättringar och anpassningar, och därmed ger värdefull information om hur man väljer rätt interaktion analys. Y2H skärmar och härledda tekniker har blivit allmänt används i olika forskningsområden, varhelst krävs identifiering av binära proteininteraktioner. Även om kritiska kontroller genomförs, såsom självaktiveringstester av betet och en-till-en re-transformationer av de identifierade interagerande proteiner är Y2H benägen att ge falska resultat 26, 50, 51. Jästen som en modell är inte lämplig för alla interaktionsstudier. Jäst inte nödvändigtvis utgör en cellulär miljö som stöder den lämpliga post-translationell modifiering och vikning för varje protein 24. Vidare i inställningen Y2H, proteinerna överuttryckta och deras uttryck är inte kontrollledd av deras naturliga promotor. Den Y2H tvingar proteininteraktionspartners till kärnan, vilket inte nödvändigtvis deras naturliga subcellulär destination. De interna cellulära omständigheterna kring interaktionen kan således inte reflekteras av jäst och kan leda till falskt negativa eller falskt positiva resultat. De flesta Y2H är baserade på jäst auxotrofi komplemente som en selektiv princip. Detta närings val kännetecknas av hög känslighet, men på bekostnad av minskad selektivitet jämfört med andra (t ex kromogen reporter) analyser 49. Om unreducible självaktivering (se ovan) eller andra begränsningar uppträder under en viss effektor är Y2H inte någon lämplig analys 25. I tabell 1 och figur 1, är de förväntade resultaten av självaktivering testet ges. Frånvaron av verkliga interaktioner (dvs falska negativa) kan orsakas av proteintoxicitet, felaktig translationell proteinbearbetning, steriskt hinder av interaktionen, underrepresenterade interaktions partners i bytet bibliotek, membran lokalisering av betet, eller saknade komponenter som krävs för interaktionen 24. Det rekommenderas att de novo förstärka fullängdsgenen av den identifierade interagerande protein från cDNA, subklona det in pGAD-HA, och utför en interaktionsanalys en-till-en genom att omvandla den genererade pGAD-HA-konstruktionen i betet-uttryckande NMY51 stam. Detta är nödvändigt eftersom den observerade påverkare närvarande i bytet biblioteket kanske endast vara ett fragment av en större protein. Men det är bara tillgänglig om betydande genomisk och transcriptomic sekvensdata finns informationen för respektive gen fullängds. Omvandlingen protokoll för självaktiveringsanalys som beskrivs här kan användas för en sådan en-till-en analys och samspelet mellan betet och Interactor måste vara reproducerbara. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; interaktioner i en Y2H skärm måste alltid bekräftas av en annan oberoende teknik. Detta oberoende teknik måste vara närmare naturen av själva interaktionen protein-protein. I fallet med phytoplasmal effektor ATP_00189 var interaktionen med TCP transkriptionsfaktorer Malus x domestica verifieras i planta med bimolekylärt fluorescerande komplettering (BiFC) i Nicotiana benthamiana protoplaster 28 (inte en del av detta protokoll). Den effektorprotein ATP_00189 härleddes från växtpatogen P. mali. I planta BiFC således valt att kontrollera ATP_00189 interaktioner med Malus x domestica transkriptionsfaktorer tidigare identifierats i Y2H 28. BiFC är en protein-proteininteraktion assay som inte kräver den subcellulära translokeringen av de interagerande proteiner till cellkärnan i syfte att aktivera reportern systemet &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 52. Vidare i planta uttryck och modifiering maskiner härmar miljön av den naturliga samverkan mellan anläggningen bakterie effektor i växtvärden. Dock är inte möjlig global skärmen med BiFC. Det finns flera steg i protokollet som noggrant måste åtgärdas. När förstärkning av genen av intresse (steg 4), är det viktigt att utesluta att primers binder till växt-DNA. Således måste DNA från icke-infekterade växter inkluderas som en negativ kontroll. Sekvensen för genen av intresse får inte innehålla EcoRI- och Sall-restriktionsställen som används för den riktad kloning av skäret. Om sekvensen inte innehåller dessa platser, måste olika restriktionsenzymer för kloning väljas. Jäst omvandling är en central metod under detta protokoll. Transfektionseffektiviteten beror på kompetensen hos jästcellerna, deras livskraft, tillväxt tillstånd, och kvaliteten på transfektion Reagent 53, 54. För det föreslagna protokollet, är det starkt rekommenderat att använda jäst från färska plattorna inte äldre än två veckor (hålls vid 4 ° C) när de utför de transformationer. Ofta är tillväxten av transformerade jäst försenad när selektiva flytande kulturer ympas med kolonier från gamla agarplattor. Det är också till hjälp att använda en flytande startkultur som ett inokulum för de faktiska experimenten och att inte använda jästen direkt från plattan. Låg effektivitet när transfektion bytet i betet uttrycker jäst kan leda till underrepresentationen av vissa bytesproteiner (potentiella Interact) och kan därmed skev hela skärmen. I detta protokoll, en jäst transfektion effektivitet ~ 150.000 cfu / ig transfekterat DNA i Y2H fungerat bra. Att känna bristerna och nackdelarna med den Y2H teknik och tolka resultaten på ett kritiskt och ändamålsenligt sätt är nödvändig för att dra correct slutsatser. Y2H analyser och derivat har använts under många år och har genomgått många förbättringar och anpassningar med avseende på de olika betes egenskaper, subcellulära lokalisering av samspelet, de förväntade bindningspartner, och andra faktorer som kan krävas för interaktionen (se Y3H 55, 56, 57). Nyligen har array-baserad Y2H skärmar utvecklats som möjliggör automatiserad, hög genomströmning analys av ett stort antal beten mot miljontals bytesdjur 58. Framtiden troligen ligger i automatisering och hög genomströmning sätt att denna analys för att möjliggöra att klarlägga komplexa signaleringsvägar och interactomes i olika forskningsområden.

<html> Jäst två-hybrid skärmar (Y2H) utvecklades ungefär 27 år sedan ett och har sedan använts i stor utsträckning inom olika områden för att fastställa specifika protein-proteininteraktioner 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 . Den fysiska interaktionen av en bakterie effektor med en mängd målprotein är ofta en förutsättning för den funktionella manipulering av detta målprotein. Analysera dessa interaktioner har flyttats till fokus för många olika sektorer av infektionsbiologi 12, 13, 14, 15,&quot;&gt; 16, 17, 18. Principen för Y2H skärmen är att interaktionen av två proteiner leder till rekonstituering av en funktionell transkriptionsfaktor som driver uttrycket av reportergener. Den kända effektor (&quot; bete &quot;) har translation fuserad till den DNA-bindande domänen (DBD) av transkriptionsfaktorn, och den potentiella interaktionen partners (den &quot;byte&quot;) är sammansmälta med aktiveringsdomänen (AD) hos respektive transkriptionsfaktorn. Eftersom den samverkande partner är okänd, ett bibliotek av potentiella interactmedlemmar klonas i den så kallade &quot;byte-bibliotek.&quot; normalt är detta bibliotek görs genom kloning cDNA i en lämplig byte vektor expressionsplasmid som kodar för AD som är kompatibel med betet vektor kodad DBD. vid en interaktion, ombildade transkriptionsfaktorer inducera uttryck av reportergener, som i allmänhet gör det möjligt för tillväxt valet av jäst. denidentifiering av Interactmedlemmar uppnås genom sekvensering av bytet plasmiden med plasmid-specifika primrar. Bakterier har utvecklat olika strategier för att manipulera och utnyttja sina värdens metabolism eller att undgå försvarsmekanismer och utsöndrar effektormolekyler via olika bakteriesekretionssystem 19, 20, 21. Bestämning av de bindningspartners av dessa bakterie effektorer är sålunda det första steget i att identifiera den manipulerade reaktionsvägen i värden. Detta leder till en bättre förståelse av de specifika patogenicitet mekanismer. Y2H skärmar utförs för att identifiera bakterie effektor interaktioner under phytoplasmoses, och ofta är Y2H en avgörande inledande experiment för ytterligare karakterisering av molekylära patogenicitet mekanismer phytoplasma forskning 22, 23. Emellertid den träffadehod beskrivning i de flesta publikationer är ganska sällsynt, och dessa tekniker är ofta outsourcad till bioteknikföretag. För att uppmärksamma möjligheten att denna metod ger detta protokoll steg-för-steg-information för att identifiera interaktionspartner en bakteriell effektormolekyl i sin naturliga värd. Trots den utbredda användningen och snabbspolning framåt tillvägagångssätt Y2H skärmar, får man inte glömma att vissa interaktioner inte kan förekomma i jästsystemet. Detta beror på det faktum att jästcellen används som ett slags &quot;in vivo reaktionskärl&quot; med vissa biologiska begränsningar. Flera författare har tagit upp för- och nackdelar med Y2H och dess derivat 11, 24, 25, 26, 27. Allmänna överväganden är till exempel, att jästcellen inte kan åstadkomma den lämpligagenuttryck, (post-) translationell eller translocational betingelserna för respektive proteiner som studeras. Detta kan leda till falskt negativa resultat på skärmen. Positiva interaktioner kan i sin tur vara föremål och kanske inte förekommer i den naturliga situationen (dvs. i fallet med effektenheter i lämplig värd). Det är således nödvändigt att bekräfta de interaktioner från den heterologa jästexpressionssystem med en oberoende interaktionstestet på ett mer nära besläktade biologiskt system. I denna studie var de bindande partners till effektor ATP_00189 från den icke-odlingsbara växtpatogen Candidatus Phytoplasma mali (P. mali) identifieras. Resultaten ger viktiga insikter i de molekylära mekanismer som ligger bakom symptom utvecklingen av Apple proliferation 28, en sjukdom som orsakar höga ekonomiska förluster i drabbade äppelodlings regioner i Europa 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1514">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:565px;">Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:211px;">Applichem</td>
			<td style="width:324px;">A6284</td>
			<td style="width:415px;">for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trishydroxymethylaminomethane (Tris)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodiumchloride (NaCl)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2942</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2937</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">N-Lauroylsarcosin sodium salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A7402</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ammonium acetate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>9688</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1108</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3928</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>51976</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNAse</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2760</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chloroform:Isoamyl 24:1</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1935</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proofreading Polymerase (e.g. iProof)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>203433</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EcoRI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SalI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0641</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1493</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td>for self-activation assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Arginine Monohydrochloride&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3680</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Isoleucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3642</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-lysine Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3448</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Methionine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3897</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Phenylalanine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3464</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Threonine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3946</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tyrosine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3401</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Uracile</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0667</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Valine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3406</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Adenine Hemisulfate Salt&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1596</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.22 &#181;m Pore Filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16541</td>
			<td>for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Histidine Monohydrochloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3719</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Leucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3496</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tryptophane&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3410</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Nitrogen Base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51483</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1349</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-1</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peptone</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2208</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyethylene Glycol 4000 (PEG)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1249</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3478</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Salmon Sperm DNA&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2159</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-719</td>
			<td>for Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PLN350</td>
			<td>for plasmid purification from yeast and bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acid Washed Glass Beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>for plasmid purification from yeast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0839</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Extract</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1552</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z368245 (Sigma)</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bait vector (e.g. pLexA-N)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Prey vector (e.g. pGAD-HA)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control prey vector (e.g. pLexA-p53)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control bait vector (e.g. pACT-largeT)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C640003</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3&#916;200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>676 051</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td>for quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free)</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2500010</td>
			<td>for PCR and DNA works</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpell</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0301</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile filter (0.22 &#181;m; Polyethersulfone))</td>
			<td>VWR-International</td>
			<td>514-0073 (European Catalogue number)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 90 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633180</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 150 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>639161</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer (e.g. BioPhotometer)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>550507804</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WB7</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Western Blot Equipment</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>diverse</td>
			<td>for protein detection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dNTPs</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2201210</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 ml; 1000 ml; 2000 ml) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z232793, Z232858, Z232866</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaking Incubator (e.g. GFL 3031)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3031</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>KB 53 (E3.1)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825)</td>
			<td>Omniwash</td>
			<td>IF 825</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2 ml, 1.5 ml and 2.0 ml Reaction Vials (Polypropylene)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10-1000 &#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>diverse</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SPR-L-S01</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3617000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T4-Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fridge (4&#176;C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>81.767.580.4</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Freezer (-20&#176;C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>G5216</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Graduated Cylinder (e.g. Brand)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z327352; Z327417; Z327441&#160;&#160;</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S55701</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2)</td>
			<td>Integra-Biosciences</td>
			<td>155000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cuvettes for Electroporation (1 mm)</td>
			<td>Molecular Bio Products</td>
			<td>5510-11</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electroporator (e.g. Eporator)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 ml)</td>
			<td>VWR-International&#160;</td>
			<td>525-0403 (European Catalogue number)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 ml)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dithiothreitol (DTT, e.g. DTT, 1M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM))</td>
			<td>Ambion&#160;</td>
			<td>AM8110G (distributed by Thermo Scientific)</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2021 Sigma&#160;</td>
			<td>for yeast culture (ready-made mix)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen

Unravelling de molekylära mekanismerna för sjukdomsmanifestationer är viktigt att förstå sjukdomar och symptom utveckling inom växtvetenskap. Bakterier har utvecklats olika strategier för att manipulera sin värd metabolism för egen vinning. Denna bakterie manipulation är ofta kopplade till svår symptomutveckling eller död av de påverkade växter. Fastställa de specifika bakteriella molekyler som är ansvariga för värd manipulation har blivit ett viktigt område i mikrobiologisk forskning. Efter identifiering av dessa bakterie molekyler, som kallas &quot;effektorer&quot;, är det viktigt att belysa deras funktion. En enkel metod för att bestämma funktionen av en effektor är att identifiera dess proteinhaltigt bindningspartner i sin naturliga värd via en jäst två-hybrid (Y2H) skärm. Normalt värd hyser många potentiella bindningspartner som inte kan förutsägas tillräckligt av någon in silico algoritm. Det är därför det bästa valet för att perform en skärm med den hypotetiska effektor mot ett helt bibliotek av uttryckta värdproteiner. Det är särskilt utmanande om det orsakande medlet är uncultivable som phytoplasma. Detta protokoll ger steg-för-steg-instruktioner för DNA-rening från en phytoplasma-infekterade woody värdväxt, förstärkningen av den potentiella effektor och efterföljande identifiering av anläggningens molekylär interaktion partner med en Y2H skärm. Även om Y2H skärmar används ofta, finns det en tendens att lägga ut denna teknik till bioteknikföretag som erbjuder Y2H service till en kostnad. Detta protokoll ger instruktioner om hur du utför en Y2H i något anständigt utrustade molekylärbiologiskt laboratorium med användning av standardlaboratorietekniker.

Innan kan utföras själva Y2H skärmen betet måste testas för självaktivering. Detta uppnås genom att transformera betet expressionsvektor tillsammans med den tomma byten biblioteket vektor och kontroll av tillväxt på selektiva plattor. För att analysera huruvida phytoplasmal protein ATP_00189 är självaktiverande, var självaktivering test som beskrivs i avsnitt 5. betet plasmiden kompletterar trp och bytet plasmiden leu auxotrofi av S. cerevisiae NMY51 40. En framgångsrik co-transformation således kännetecknas av tillväxt på selektiva plattor som saknar trp och Leu. Interaktion av betet och ett byte protein leder till en komplettering av hans och ade auxotrofi av NMY51. Om självaktivering av betet i frånvaro av en interaktion visas, växer jästen på selektiva plattor som saknar hans och ade. Stark och svag självaktivering kan inträffa. Stark självaktivering av betet kännetecknas av tillväxten av co-transformerade jäst på trp-Leu-hans-ade utarmat selektionsplattor. Svag självaktivering leder till tillväxt på trp-leu-his men inte på trp-leu-his-Ade utarmat selektionsplattor. Korrekt positiva kontroller är nödvändiga för att tolka resultaten av självaktivering analysen. En sammanfattning av de förväntade resultaten av självaktivering analysen och deras tolkning ges i tabell 1 och åskådliggörs i figur 1. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> Figur 1: Exempel på bete självaktivering Tester av ett bete Innan du utför en Y2H skärm. S. cerevisiae NMY51 ades samtransformerades med samverkande bete (PLEX-p53) och bytesdjur (pACT-larget) som en positiv kontroll (vänster fält: ac), en svagt självaktiverande plus en tom byte library vektor (mitten panel: df) och en icke självaktiverande bete plus en tom byte bibliotek vektor (högra panelen: gi). Co-transformerade jästen odlades på SD-plattor som saknar trp och Leu (övre panelen: a, d, g), trp, leu och hans (mitten panel b, e, h) och trp, leu, hans och ade (lägre panel: c, f, i). Selektion på medium som saknar trp och leu är en positiv kontroll för framgångsrik samtransformering, som betet vektor kompletterar trp auxotrofi och bytet vektorn leu auxotrofi av NMY51 (tillväxt på SD-trp-leu). Vid en interaktion mellan bete och bytesdjur eller en självaktivering av betet, är reportern uttryck för NMY51 påslagen och kompletterar hans och ade auxotrofi (tillväxt på SD-trp-Leu-hans-ade). En svag självaktivering kännetecknas av tillväxt på SD-trp-Leu-hans plattor (mitten panel, df). Svag självaktivering av ett bete måste minskas innan för att analysera beteti en Y2H skärm, exempelvis genom att tillsätta 3-AT till selektiva media. Aminosyra uttömning anges med &quot;-&quot; i respektive media namn. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> ingen </td><td> kolonier </td><td> ingen tillväxt </td><td> ingen tillväxt </td><td> ingen tillväxt </td><td> ingen tillväxt </td></tr><tr><td> ingen </td><td> pGAD-HA </td><td> ingen tillväxt </td><td> kolonier </td><td> ingen tillväxt </td><td> ingen tillväxt </td><td> ingen tillväxt </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> ingen </td><td> kolonier </td><td> ingen tillväxt </td><td> ingen tillväxt </td><td> ingen tillväxt </td><td> ingen tillväxt </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> pGAD-HA </td><td> kolonier </td><td> kolonier </td><td&gt; kolonier </td><td> ingen tillväxt </td><td> ingen tillväxt </td></tr><tr><td> pLexA-p53 </td><td> pACT-larget </td><td> kolonier </td><td> kolonier </td><td> kolonier </td><td> kolonier </td><td> kolonier </td></tr><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> pGAD-HA </td><td> kolonier </td><td> kolonier </td><td> kolonier </td><td> ingen tillväxt </td><td> ingen tillväxt </td></tr></tbody></table> Tabell 1: Förväntade resultat i ett bete Självaktiveringsanalys. Omvandlingen av S. cerevisiae NMY51 ger differential tillväxt på selektiva media baserad på egenskaperna hos samtransforme bete och bytesdjur. Tillväxt på selektiva plattor utvärderades efter transformation av olika vektorkombinationer (AF) efter 72 h inkubation vid 30 ° C. Svag självaktivering karakteriseras av jäst tillväxt på SD-trp-Leu-hans och stark självaktivering genom tillväxt på SD-trp-Leu-hans-ade val plates i frånvaro av en interaktion partner. Den pLexA-N kodade phytoplasmal effektor ATP_00189 uppvisar inte självaktivering, som kännetecknas av oförmågan hos betet vektor transformerad NMY51 att växa i frånvaro av hans och ade. Beroende på betet, kan en Y2H skärm får många jästkloner växer på selektiva plattor. Alla kloner måste analyseras och kontrolleras för eventuella uppsägningar. Även om en normaliserad cDNA-bibliotek har använts, är det mycket sannolikt att ett påverkare är representerad i många olika kloner. Beroende på vilken bibliotekskloningsteknik, är det även möjligt att endast fragment av den fullständiga genen infogas i vissa bytes vektorer. Det är således lämpligt att de novo amplifiera (från cDNA) och subklona fullängdsgenen enligt påverkare och för att testa interaktionen i ett ett-till-ett Y2H analys (Figur 2). <img alt = &quot;Bild 2&quot; src = &quot;/ filer / ftp_upload / 55.150 / 55150fig2.jpg&quot; /&gt; Figur 2: Exempel på en interaktion mellan bete och Prey i en Y2H Experiment. En jäst två-hybrid (Y2H) skärm utfördes och plasmider från positiva Interactor kloner renas. Bytet vektorn sekvenserades och Malus x domestica värdinteraktionspartners MdTCP24 och MdTCP25 identifierades. Som en negativ kontroll MdTCP34 (för vilken ingen Interactor identifierades i Y2H biblioteksskärmen) subklonades parallellt. Fullängdsgener amplifierades från äpple-cDNA, subklonad in i bytet vektor (sam-cistronically uttrycker aktiveringsdomänen AD) och de novo samtransformerade med betet vektor som uttrycker den bakteriella effektor ATP_00189 kopplad till den DNA-bindande domänen (BD). Denna siffra är hämtad från 28. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större</a>version av denna siffra.

Watch this Scientific Journal Video about Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen at JoVE.com

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Bakteriella effektor proteiner är viktiga för att etablera framgångsrika infektioner. Detta protokoll beskriver den experimentella identifiering av proteinbindningspartner av en bakterie effektor protein i dess naturliga växtvärd. Identifiera dessa effektorceller interaktioner via jäst två-hybridskärmar har blivit ett viktigt verktyg i unraveling molekylära patogenicitet strategier.

Unravelling funktionen av en bakteriell Effector från en icke-odlingsbar växtpatogen hjälp av en jäst två-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Använda luciferas till bild bakteriella infektioner hos möss

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Invasion av mänskliga celler genom en bakteriell patogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introduktion Shear stress i studien av bakteriell vidhäftning

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Användning av EpiAirway modell för att karakterisera Långfristiga Värd-patogen interaktioner

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induktion av transplantat-mot-värd-sjukdom och<em&gt; In Vivo</em&gt; T cell övervakning med en MHC-matchade musmodell

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

Kvantifiering av Svamp kolonisering, sporogenes och produktion av mykotoxiner användningen av kernel Bioanalyser

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Den<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mus Modell: Studera patogen och värd Bidrag till infektiös kolit

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automatiserad Separation av<em&gt; C. elegans</em&gt; Steglös koloniseras av en bakteriell patogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Upptäcka Cortex Fragment Under Bacterial sporgroning

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Bedöma Retinal mikrogliaceller fagocytos<em&gt; In Vivo</em&gt; Med hjälp av en flödescytometri-baserad analys

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...