Name: laboratory scale production and purification of a therapeutic antibody
Uploaded: 2017-01-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody at JoVE.com

The research was supported by the University of Sydney. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954; was a gift from Andrew Beavil (Addgene plasmid # 61883). We thank Tihomir S. Dodev for useful discussions regarding pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954;.

NOTA: Un vector de expresión de mamífero adecuada debe ser utilizado para este protocolo. Aquí, se utiliza una única construcción que contiene dos casetes de expresión (es decir, expresión de la cadena pesada y ligera es impulsado por promotores separados). cadenas pesada y ligera se clonaron Trastuzumab previamente en el vector. Este vector fue un regalo de Andrew Beavil, obtenida a través de una organización sin fines de lucro plásmido repositorio 13. 1. La recuperació...

<ol>
	<li>Nelson, A. L., Reichert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+trends+for+therapeutic+antibody+fragments.">Development trends for therapeutic antibody fragments.</a> Nat Biotechnol. 27 (4), 331-337 (2009).</li><li>Drake, P. M., Rabuka, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+playbook+for+antibody-drug+conjugates:+lessons+from+the+laboratory+and+clinic+suggest+a+strategy+for+improving+efficacy+and+safety.">An emerging playbook for antibody-drug conjugates: lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety.</a> Curr Opin Chem Biol. 28, 174-180 (2015).</li><li>Kontermann, R. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tool+kit+for+rapid+cloning+and+expression+of+recombinant+antibodies.">A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies.</a> Sci Rep. 4, 5885 (2014).</li><li>Walsh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+protein+biopharmaceuticals.">Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals.</a> Drug Discov Today. 15 (17-18), 773-780 (2010).</li><li>Backliwal, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+vector+design+and+multi-pathway+modulation+of+HEK+293E+cells+yield+recombinant+antibody+titers+exceeding+1+g/l+by+transient+transfection+under+serum-free+conditions.">Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions.</a> Nucleic Acids Res. 36 (15), 96 (2008).</li><li>Bebbington, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+expression+of+a+recombinant+antibody+from+myeloma+cells+using+a+glutamine+synthetase+gene+as+an+amplifiable+selectable+marker.">High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker.</a> Biotechnology (N Y). 10 (2), 169-175 (1992).</li><li>Kaufman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coamplification+and+coexpression+of+human+tissue-type+plasminogen+activator+and+murine+dihydrofolate+reductase+sequences+in+Chinese+hamster+ovary+cells.">Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells.</a> Mol Cell Biol. 5 (7), 1750-1759 (1985).</li><li>Dalton, A. C., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-expression+of+secreted+proteins+from+mammalian+cell+lines.">Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines.</a> Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).</li><li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+gene+expression+in+HEK293+cells:+peptone+addition+posttransfection+improves+recombinant+protein+synthesis.">Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol Bioeng. 90 (3), 332-344 (2005).</li><li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+transient+transfection+of+serum-free+suspension-growing+HEK293+EBNA1+cells:+peptone+additives+improve+cell+growth+and+transfection+efficiency.">Large-scale transient transfection of serum-free suspension-growing HEK293 EBNA1 cells: peptone additives improve cell growth and transfection efficiency.</a> Biotechnol Bioeng. 84 (3), 332-342 (2003).</li><li>Yang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+valproic+acid+to+CHO+cell+fed-batch+cultures+improves+monoclonal+antibody+titers.">Addition of valproic acid to CHO cell fed-batch cultures improves monoclonal antibody titers.</a> Molecular Biotechnology. 56 (5), 421-428 (2014).</li><li>Backliwal, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valproic+acid:+a+viable+alternative+to+sodium+butyrate+for+enhancing+protein+expression+in+mammalian+cell+cultures.">Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures.</a> Biotechnol Bioeng. 101 (1), 182-189 (2008).</li><li>Jiang, Z., Sharfstein, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+butyrate+stimulates+monoclonal+antibody+over-expression+in+CHO+cells+by+improving+gene+accessibility.">Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility.</a> Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).</li><li>Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+adherent+and+suspended+cells+by+calcium+phosphate.">Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate.</a> Methods. 33 (2), 136-143 (2004).</li></ol>

Este protocolo se detalla la transfección, la expresión estable y la purificación de un anticuerpo terapéutico en las células HEK-293. La expresión estable de genes de anticuerpos es el primer paso en la generación de una línea celular productora de anticuerpos para el desarrollo y fabricación de un anticuerpo terapéutico. Mientras ovario de hámster chino (CHO) siguen siendo la plataforma de expresión de elección para proteínas terapéuticas, la línea celular HEK-293 está ganando importancia con la compr...

El éxito de anticuerpos terapéuticos continúa impulsando la inversión sustancial en el desarrollo de anticuerpos como comienza una ola de terapias de próxima generación. Se espera que el mercado de anticuerpo que se ha reformado por fragmentos de anticuerpos 1, conjugados de anticuerpo-fármaco 2, anticuerpos biespecíficos 3 y anticuerpos diseñados con propiedades favorables 4. Otra clase ganando interés farmacéutico son bioequivalentes. anticuerpos biosimilares son &quot;muy similares&quot; replicar productos de un anticuerpo terapéutico que ya ha recibido la aprobación regulatoria. A biosimilar propuesto debe ser comparable con el anticuerpo iniciador con respecto a su estructura, la función, la toxicidad animal, la seguridad clínica y eficacia, farmacocinética (PK) humanos, la farmacodinámica (PD) y la inmunogenicidad 5, 6. La aprobación rAtes de anticuerpos biosimilares han sido lentos debido a las limitaciones estrictas sobre la calidad final del producto. Los procesos de fabricación exactas tales como líneas celulares y condiciones de cultivo específico a través de las etapas de procesamiento finales pueden permanecer propietario. Lo que es más, la fabricación de anticuerpos implica inherentemente un grado de variabilidad que se puede agregar al desafío de producir un producto muy similar. Una caracterización fisicoquímica y biofísica exhaustiva y la comparación es bastante difícil, sin embargo, una serie de estudios que demuestran las características de los anticuerpos biosimilares están surgiendo en la literatura 7, 8, 9. Generación de un anticuerpo terapéutico comienza con la transfección de células huésped de mamífero con un vector que lleva los genes para el anticuerpo respectivo. diseño del vector, de línea y de cultivo celular condiciones son consideraciones clave para la creación de la exsistema de compresión. Las secuencias de ADN de anticuerpos pueden ser obtenidos de Banco de Drogas (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) o publicaciones de investigación, incluidas las patentes. Por ejemplo, la secuencia de trastuzumab está disponible a través del Banco de Drogas (DB ID: DB00072). La secuencia de aminoácidos de las regiones variables puede someterse a diseño y optimización de genes para la síntesis en las especies huésped deseadas. Es importante para un anticuerpo biosimilar que ninguna modificación se hace a la secuencia de aminoácidos. Una vez sintetizados, los genes de anticuerpos se pueden subclonar en el vector apropiado de elección. anticuerpos IgG humanos consisten en dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas. Expresión estrictamente regulados de ambas cadenas es esencial para la producción óptima de la proteína heteróloga IgG en células de mamíferos 10. Intra, así como enlaces disulfuro entre cadenas tienen que ser formado y una serie de modificaciones posteriores a la traducción tiene que estar enintrodujo durante la biosíntesis de proteínas. Una serie de vectores están disponibles que se han diseñado específicamente para expresar genes de anticuerpos (consulte la Tabla de Materiales). Estos vectores en anticuerpos específicos por lo general expresan las regiones constantes de las cadenas tanto pesada y ligera de modo que sólo las regiones variables de cada cadena requieren clonación. La transfección de células con dos constructos independientes (co-transfección) es el método más común para la entrega de genes pesados ​​y ligeros de la cadena que codifica. Es decir, cada gen es conducido por su propio promotor y transcribe como cadenas de anticuerpo separados antes de ser montado en el retículo endoplásmico. Por otra parte, los vectores de multi-cistrónicos tienen elementos internos sitio de entrada al ribosoma (IRES) incorporados que permiten la expresión de múltiples genes como un único transcrito de ARNm con la traducción permitida de las regiones internas del mRNA 11. En este caso, los genes de cadena pesada y ligera que codifica se acoplan en un arrangement para lograr la co-expresión de ambas cadenas de anticuerpo 10, 12. Mientras que las células transfectadas transitoriamente rendimiento de proteína suficiente para realizar un número limitado de experimentos, las líneas celulares transfectadas de manera estable que han sido sometidos a selección para la integración del genoma pueden ofrecer rendimientos más altos. Las cantidades de proteína más altos permiten para el desarrollo del ensayo relativo a la caracterización in vitro y pueden proporcionar una indicación de la calidad del anticuerpo en consideración para aplicaciones posteriores tales como la línea celular clonal y la selección de candidatos de plomo. El objetivo de este artículo es describir la expresión estable y purificación de un anticuerpo terapéutico producido en un sistema de expresión de mamífero. De hecho, este método se puede aplicar a la expresión de un anticuerpo biosimilar. El método puede ser utilizado para la caracterización inicial de los anticuerpos antes de proceder a la crítica, aunque ste tiempops de identificar un clon deseable para la fabricación a mayor escala. Por otra parte, este método se puede utilizar para expresar otras proteínas y no sólo los anticuerpos. El siguiente protocolo describe la expresión detallada de trastuzumab anticuerpo terapéutico. Esta consiste en la preparación de ADN del vector seguido de transfección estable en la línea celular HEK-293 y la purificación de la proteína de anticuerpo por un método de cromatografía automatizado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1730">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:348px;">pFUSE vector series</td>
			<td style="width:189px;">N/A</td>
			<td style="width:191px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:1003px;">Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mAbXpress vector series</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ACYTE Biotech Pty Ltd.</td>
			<td>Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pVITRO1 vector</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.&#160; Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GS vector series</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-cistronic vector series 1</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-cistronic vector series 2</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954;</td>
			<td>61883</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954; was a gift from Andrew Beavil.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fast-Media Hygro Agar</td>
			<td>fas-hg-s</td>
			<td>Jomar Life Research</td>
			<td>Used to prepare low salt LB agar containing 75 &#181;g/ml hygromycin.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fast-Media Hygro TB</td>
			<td>fas-hg-l</td>
			<td>Jomar Life Research</td>
			<td>Used to prepare low salt TB broth containing 75 &#181;g/ml hygromycin.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol, BioXtra, &#8805;99%</td>
			<td>G6279</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>G221020</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td>Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FreeStyle 293-F Cells</td>
			<td>R790-07</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FreeStyle 293 Expression Medium</td>
			<td>12338-018</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Kolliphor P188</td>
			<td>K4894</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 &#956;m filter. Store at 4oC.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM, high glucose&#160;</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum</td>
			<td>10082-147</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:348px;">Polyethylenimine, Linear, MW 25,000&#160;</td>
			<td>23966</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 &#956;m filter. Store at -80oC until use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">OptiPro SFM</td>
			<td>12309-050</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Transfection formulated serum-free media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hygromycin B Solution</td>
			<td>ant-hg-1</td>
			<td>Jomar Life Research</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dimethylsulphoxide (DMSO)</td>
			<td>AJA2225</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Tryptone (casein peptone)</td>
			<td>LP0042B</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 &#956;m filter. Store at 4oC.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml</td>
			<td>09-2051-100</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column</td>
			<td>GE17-0403-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AKTApurifier 100</td>
			<td>28406266</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycine-HCl</td>
			<td>G2879</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citric Acid, monohydrate</td>
			<td>BIOC2123</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate&#160;</td>
			<td>BIOCB0035</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 M Tris-HCl solution pH 9.0</td>
			<td>BIOSD8146</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO)</td>
			<td>UFC803008/UFC903008</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>Used to buffer exchange and concentrate purified protein.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit</td>
			<td>23227</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BLItz System</td>
			<td>45-5000</td>
			<td>fort&#233;BIO</td>
			<td>Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein A biosensors</td>
			<td>18-5010</td>
			<td>fort&#233;BIO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution</td>
			<td>786-502</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>AM0486</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TEMED</td>
			<td>AM0761</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>786-498</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Precision Plus Dual-Color Protein Standard</td>
			<td>1610374</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laboratory scale production and purification of a therapeutic antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

Producción estable de trastuzumab por las células HEK-293 transfectadas se confirmó usando interferometría bio-capa (BLI) tal como se presenta en la Figura 1. Una curva estándar de IgG se generó mediante la medición de la tasa de unión entre un estándar de anticuerpo IgG y proteína A biosensor (Figura 1A). La muestra de sobrenadante crudo se midió de manera similar, a continuación, su concentración interpolada a partir de la curva estándar ...

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Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Este protocolo describe la producción de un anticuerpo terapéutico en un sistema de expresión de mamífero. Los métodos descritos incluyen la preparación del ADN del vector, transfección estable y la adaptación libre de suero de una línea celular de riñón embrionario humano 293, puesta en marcha de cultivos a gran escala y la purificación mediante cromatografía de afinidad.

Laboratorio de producción a gran escala y purificación de un anticuerpo terapéutico

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Dirigida Packaging de proteínas dentro de la membrana externa de vesículas de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Diseño, Producción y Purificación

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Investigación

Bioquímica

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Producción, Cristalización y determinación de la estructura de<em&gt; C. difícil</em&gt; PPEP-1 a través de microsiembra y Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expresión, purificación y actividad antimicrobiana de S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Una guía para la producción, cristalización y determinación de la estructura de IKK1/α humano

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Método para Refolding eficiente y la purificación del quimioreceptor ligando vinculante dominio

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Purificación y reconstitución de TRPV1 para análisis espectroscópico

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Expresión transitoria en Nicotiana Benthamiana las hojas para la producción de triterpeno a escala preparativa

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Producción a gran escala de ARN recombinante en un andamio Circular utilizando un sistema derivado de Viroide en Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Expresión y purificación de la distribución de oxígeno libre de nucleasa Protocatechuato 3,4-Dioxigenasa

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Un enfoque personalizable para la producción enzimática y la purificación de productos naturales diterpenoides

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...