Name: synthesis of 1,2-azaborines and the preparation of their protein complexes with t4 lysozyme mutants
Uploaded: 2017-03-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants at JoVE.com

This research was supported by the National Institutes of Health NIGMS (R01-GM094541) and Boston College.

ملاحظة: تم تنفيذ جميع التلاعب الأكسجين وحساسة للرطوبة في ظل جو خامل (N 2) باستخدام تقنيات خالية من الهواء القياسية أو علبة القفازات. THF (رباعي هيدرو الفوران)، إت 2 O (إثيل الأثير)، CH 2 الكلورين 2 (ثنائي كلورو ميثان)، التولوين، والبنتان وتنقيته عن طري?...

<ol>
	<li>Ducruix, A., Gi&#233;ge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach. , (1992).</li><li>Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-N+as+a+C-C+substitute+in+aromatic+systems.">B-N as a C-C substitute in aromatic systems.</a> Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).</li><li>Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Azaborine+Chemistry.">Recent Advances in Azaborine Chemistry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51 (25), 6074-6092 (2012).</li><li>Wang, X. -. Y., Wang, J. -. Y., Pei, J. B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosuperbenzenes:+Synthesis+and+Properties.">Heterosuperbenzenes: Synthesis and Properties.</a> Chem. Eur. J. 21 (9), 3528-3539 (2015).</li><li>Zhou, H. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+isomerism:+a+boron-nitrogen+surrogate+for+a+carbon-carbon+double+bond+increases+the+chemical+diversity+of+estrogen+receptor+ligands.">Elemental isomerism: a boron-nitrogen surrogate for a carbon-carbon double bond increases the chemical diversity of estrogen receptor ligands.</a> Chem. Biol. 14 (6), 659-669 (2007).</li><li>Ito, H., Yumura, K., Saigo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+characterization,+and+binding+property+of+isoelectronic+analogues+of+nucleobases,+B(6)-substituted+5-aza-6-borauracils+and+-thymines.">Synthesis, characterization, and binding property of isoelectronic analogues of nucleobases, B(6)-substituted 5-aza-6-borauracils and -thymines.</a> Org. Lett. 12 (15), 3386-3389 (2010).</li><li>Vlasceanu, A., Jessing, M., Kilburn, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BN/CC+isosterism+in+borazaronaphthalenes+towards+phosphodiesterase+10A+(PDE10A)+inhibitors.">BN/CC isosterism in borazaronaphthalenes towards phosphodiesterase 10A (PDE10A) inhibitors.</a> Bioorg. Med. Chem. 23 (15), 4453-4461 (2015).</li><li>Rombouts, F. J., Tovar, F., Austin, N., Tresadern, G., Trabanco, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzazaborinines+as+Novel+Bioisosteric+Replacements+of+Naphthalene:+Propranolol+as+an+Example.">Benzazaborinines as Novel Bioisosteric Replacements of Naphthalene: Propranolol as an Example.</a> J. Med. Chem. 58 (23), 9287-9295 (2015).</li><li>Culling, G. C., Dewar, M. J. S., Marr, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Heteroaromatic+Compounds.+XXIII.+Two+Analogs+of+Triphenylene+and+a+Possible+Route+to+Borazarene.">New Heteroaromatic Compounds. XXIII. Two Analogs of Triphenylene and a Possible Route to Borazarene.</a> J. Am. Chem. Soc. 86 (6), 1125-1127 (1964).</li><li>White, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Phenyl-2,1-borazarene+and+Derivatives+of+1,2-Azaboracycloalkanes.">2-Phenyl-2,1-borazarene and Derivatives of 1,2-Azaboracycloalkanes.</a> J. Am. Chem. Soc. 85 (22), 3634-3636 (1963).</li><li>Ashe III, A. J., Fang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Synthesis+of+Aromatic+Five-+and+Six-Membered+B&#8722;N+Heterocycles+via+Ring+Closing+Metathesis.">A Synthesis of Aromatic Five- and Six-Membered B&#8722;N Heterocycles via Ring Closing Metathesis.</a> Org. Lett. 2 (14), 2089-2091 (2000).</li><li>Marwitz, A. J. V., Matus, M. H., Zakharov, L. N., Dixon, D. A., Liu, S. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Hybrid+Organic/Inorganic+Benzene.">A Hybrid Organic/Inorganic Benzene.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (5), 973-977 (2009).</li><li>Abbey, E. R., Lamm, A. N., Baggett, A. W., Zakharov, L. N., Liu, S. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protecting+Group-Free+Synthesis+of+1,2-Azaborines:+A+Simple+Approach+to+the+Construction+of+BN-Benzenoids.">Protecting Group-Free Synthesis of 1,2-Azaborines: A Simple Approach to the Construction of BN-Benzenoids.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12908-12913 (2013).</li><li>Rudebusch, G. E., Zakharov, L. N., Liu, S. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodium-catalyzed+boron+arylation+of+1,2-azaborines.">Rhodium-catalyzed boron arylation of 1,2-azaborines.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 52 (35), 9316-9319 (2013).</li><li>Brown, A. N., Li, B., Liu, S. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negishi+Cross-Coupling+Is+Compatible+with+a+Reactive+B-Cl+Bond:+Development+of+a+Versatile+Late-Stage+Functionalization+of+1,2-Azaborines+and+Its+Application+to+the+Synthesis+of+New+BN+Isosteres+of+Naphthalene+and+Indenyl.">Negishi Cross-Coupling Is Compatible with a Reactive B-Cl Bond: Development of a Versatile Late-Stage Functionalization of 1,2-Azaborines and Its Application to the Synthesis of New BN Isosteres of Naphthalene and Indenyl.</a> J. Am. Chem. Soc. 137 (28), 8932-8935 (2015).</li><li>Knack, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BN/CC+Isosteric+Compounds+as+Enzyme+Inhibitors:+N-+and+B-Ethyl-1,2-azaborine+Inhibit+Ethylbenzene+Hydroxylation+as+Non-Convertible+Substrate+Analogs.">BN/CC Isosteric Compounds as Enzyme Inhibitors: N- and B-Ethyl-1,2-azaborine Inhibit Ethylbenzene Hydroxylation as Non-Convertible Substrate Analogs.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 52 (9), 2599-2601 (2013).</li><li>Eriksson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+a+Protein+Structure+to+Cavity-Creating+Mutations+and+Its+Relation+to+the+Hydrophobic+Effect.">Response of a Protein Structure to Cavity-Creating Mutations and Its Relation to the Hydrophobic Effect.</a> Science. 255 (5041), 178-183 (1992).</li><li>Eriksson, A. E., Baase, W. A., Wozniak, J. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cavity-containing+mutant+of+T4+lysozyme+is+stabilized+by+buried+benzene.">A cavity-containing mutant of T4 lysozyme is stabilized by buried benzene.</a> Nature. 355 (6358), 371-373 (1992).</li><li>Morton, A., Baase, W. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetic+Origins+of+Specificity+of+Ligand+Binding+in+an+Interior+Nonpolar+Cavity+of+T4+Lysozyme.">Energetic Origins of Specificity of Ligand Binding in an Interior Nonpolar Cavity of T4 Lysozyme.</a> Biochemistry. 34 (27), 8564-8575 (1995).</li><li>Wei, B. Q., Baase, W. A., Weaver, L. H., Matthews, B. W., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Model+Binding+Site+for+Testing+Scoring+Functions+in+Molecular+Docking.">A Model Binding Site for Testing Scoring Functions in Molecular Docking.</a> J. Mol. Biol. 322 (2), 339-355 (2002).</li><li>Lee, H., Fischer, M., Shoichet, B. K., Liu, S. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+Bonding+of+1,2-Azaborines+in+the+Binding+Cavity+of+T4+Lysozyme+Mutants:+Structures+and+Thermodynamics.">Hydrogen Bonding of 1,2-Azaborines in the Binding Cavity of T4 Lysozyme Mutants: Structures and Thermodynamics.</a> J. Am. Chem. Soc. 138 (37), 12021-12024 (2016).</li><li>Brown, H. C., Racherla, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoboranes.+43.+A+Convenient,+Highly+Efficient+Synthesis+of+Triorganylboranes+via+a+Modified+Organometallic+Route.">Organoboranes. 43. A Convenient, Highly Efficient Synthesis of Triorganylboranes via a Modified Organometallic Route.</a> J. Org. Chem. 51 (4), 427-432 (1986).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Liu, L., Baase, W. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Halogenated+Benzenes+Bound+within+a+Non-polar+Cavity+in+T4+Lysozyme+Provide+Examples+of+I.S+and+I.Se+Halogen-bonding.">Halogenated Benzenes Bound within a Non-polar Cavity in T4 Lysozyme Provide Examples of I.S and I.Se Halogen-bonding.</a> J. Mol. Biol. 385 (2), 595-605 (2009).</li></ol>

في الجزء الأول من هذا البروتوكول، وصفنا توليفة معدلة من 1،2-azaborines على أساس أساليب ذكرت سابقا 12 و 13. وقد استخدم Triallylborane 22 كبديل للطرق باستخدام allyltriphenyl القصدير أو البوتاسيوم allyltrifluoroborate لإعداد N -allyl- N -TBS- ب -allyl ن?...

وضعت البورون النيتروجين التي تحتوي على حلقات غير متجانسة (أي 1،2-azaborines) في الآونة الأخيرة اهتماما كبيرا كما isosteres من أرينية. هذا isosterism يمكن أن يؤدي إلى تنويع الأشكال الهيكلية القائمة لتوسيع مساحة الكيميائية 2، 3، 4. Azaborines لها فائدة محتملة لتطبيقها في البحوث الطبية الحيوية 5، 6، 7، 8، خصوصا في مجال الكيمياء الطبية التي الكيميائيين إجراء توليف مكتبات هيكليا والجزيئات ذات الصلة وظيفيا. إلى حد كبير، ومع ذلك، في حين أن هناك العديد من طرق اصطناعية متطورة إلى الجزيئات التي تحتوي على دآرين المتاحة، تم الإبلاغ سوى عدد محدود من الطرق لتركيب azaborines 9، 10، </sتصل&gt; 11، 12، 13. ويرجع ذلك أساسا إلى عدد محدود من الخيارات لمصدر البورون والجوي وطبيعة رطوبة الحساسة من جزيء في مرحلة مبكرة من تسلسل الاصطناعية. في الجزء الأول من هذه المقالة، فإننا سوف تصف توليفة نطاق متعدد غرام من N -TBS- ب -Cl-1،2-azaborine (3) باستخدام تقنيات خالية من الهواء القياسية. يخدم هذا المركب كمادة وسيطة تنوعا التي يمكن زيادة functionalized لهيكليا أكثر تعقيدا الجزيئات 14 و 15. بدءا من 3، وسيتم وصف التوليف وتنقية N -H- ب -ethyl-1،2-azaborine (5) لاستخدامها في دراسات ملزمة البروتين. نظرا لتقلب 5، عزلتها فعالة تتطلب مراقبة دقيقة من درجة حرارة التفاعل، والوقت، وشعبة نظماستنتاج الظروف. في الجزء الثاني، وبروتوكولات للتعبير البروتين وعزل المسوخ T4 الليزوزيم (L99A وL99A / M102Q) 17، 18، 19، وستقدم 20، تليها بلورة البروتين وإعداد المجمعات الكريستال البروتين يجند. وقد تم اختيار المسوخ T4 الليزوزيم L99A وL99A / M102Q كما نظم نموذج البيولوجية لدراسة قدرة الرابطة الهيدروجينية من NH تحتوي على جزيئات azaborine 17. استخدام معيار بروتوكول البيولوجيا الجزيئية، ويتم التعبير عن هذا البروتين في سلالة كولاي RR1 والتي يسببها مع الآيزوبروبيل-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). ويتم تنقية البروتين خارج باستخدام التبادل الأيوني العمود اللوني. يتم تنفيذ البروتين تبلور مع الحل عالية التركيز النقي البروتين (&gt; 95٪ نقاء من قبل الكهربائي للهلام) باستخدام شنقاإسقاط طريقة نشر بخار. ونظرا لحساسية بروابط هذه الدراسة إلى الأكسجين، يتم إعداد المجمعات البروتين يجند في ظل ظروف خالية من الهواء.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran (THF), inhibitor-free, for HPLC, &#8805;99.9%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether (Et2O), for HPLC, &#8805;99.9%, inhibitor-free</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>309966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene chloride&#160; (CH2Cl2), (Stabilized/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D37-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>T290-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentane, HPLC</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P399-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A21-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydride (CaH2), reagent grade, 95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>208027</td>
			<td>Pyrophoric</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palladium on activated carbon (Pd/C), 10 wt% Pd</td>
			<td>Strem</td>
			<td>46-1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 M Boron trichloride solution in hexane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>211249</td>
			<td>Highly toxic/ Pyrophoric</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>471283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grubbs 1st generation catalyst&#160;</td>
			<td>materia</td>
			<td>C823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Butanol, anhydrous, 99.8%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>281549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyllithium solution, 0.5 M in benzene/cyclohexane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>561452</td>
			<td>Highly toxic/ Pyrophoric</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl solution, 2.0 M in Et2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>455180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane, anhydrous, &#8805;99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>277258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli, (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC&#174; 31343&#8482;)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>31343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 lysozyme WT* (L99A)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>18476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 lysozyme mutant (S38D L99A M102Q N144D)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>18477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic&#160; anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S642212&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M4880</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo scientific pierce DNaseI</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PI-90083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Healthcare&#160;Sepharose Fast Flow Cation Exchange Media</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>45-002-931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>TCI</td>
			<td>S0489</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN806443&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sartorius&#160;Vivaspin 20 Centrifugal Concentrators</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-558-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Hydroxyethyl disulfide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>380474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-paratone&#160;</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-667E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;CryoLoop</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td></td>
			<td>cryogenic tubing shaped into a loop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoTong</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>cryogenic tong</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electron density images are generated from the software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of 1,2-azaborines and the preparation of their protein complexes with t4 lysozyme mutants

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor diffusion. Oxygen- and moisture-sensitive compounds are prepared and isolated under an inert atmosphere (N2) using either a vacuum gas manifold or a glove box. As an example of azaborine synthesis, we demonstrate the synthesis and purification of the volatile N-H-B-ethyl-1,2-azaborine by a five-step sequence involving distillation and column chromatography for the isolation of products. T4 lysozyme mutants L99A and L99A/M102Q are expressed with Escherichia coli RR1 strain. Standard protocols for chemical cell lysis followed by purification using carboxymethyl ion exchange column affords protein of sufficiently high purity for crystallization. Protein crystallization is performed in various concentrations of precipitant at different pH ranges using the hanging drop vapor diffusion method. Complex preparation with the small molecules is carried out by vapor diffusion method under an inert atmosphere. X-ray diffraction analysis of the crystal complex provides unambiguous structural evidence of binding interactions between the protein binding site and 1,2-azaborines.

ويظهر الطريق الاصطناعية التخطيطي ل1،2-azaborines في الشكل 1. ينطبق هذا البروتوكول لتخليق خمسة مختلفة البورون النيتروجين التي تحتوي على جزيئات. يمثل الرقم 2 11 ب NMR الأطياف قياسها أثناء الخطوة 1.3 لمراقبة تشكيل المنتج المطلوب (3).</s...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants at JoVE.com

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

A protocol for the synthesis of 1,2-azaborines and the preparation of their protein complexes with T4 lysozyme mutants is presented.

توليف 1،2-Azaborines وإعداد مجمعات البروتين مع T4 الليزوزيم المسوخ

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

إعداد وتسليم Microcrystals البروتين في المرحلة مكعب شحمي عن المسلسل الفيمتو ثانية البلورات

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

وسيلة فعالة لتخليق Peptoids مع مونمرات مختلط ليسين من نوع / ارجينين من نوع وتقييم نشاطهم مكافحة يشماني

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

بروتين طريقة التحضير لتحديد إنتاجية عالية من البروتينات التفاعل مع العامل المساعد النووية عن طريق LC-MS / MS تحليل

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

جنبا إلى جنب تقارب تنقية البروتين المجمعات من خلايا حقيقية النواة

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

الكشف والتصور من المجمعات البروتين الناجم عن الأضرار الحمض النووي في الثقافات خلية تعليق باستخدام التقريب ربط القرب

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

الأفقي جل الكهربائي للكشف عن تعزيز المجمعات البروتين رنا

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

سبليت-بيويد-تحليل البروتين مجمعات البروتين محددة السياق في بيئتها الخلوية الأصلية

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 في 1: انجذاب تطهير لتحليل مواز للبروتين-بروتين والبروتين-المستقلب المجمعات من خطوة واحدة

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...