Name: isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization
Uploaded: 2017-03-02T13:00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation de la recherche-Flandre (FWO G.0856.13N) et le Conseil de recherches de la KU Leuven (OT / 13/113). KDC est financé par le FWO Belgique. AH est financé par OT / 13/113. Nous tenons à remercier la Cellule Imaging Core installation de la KU Leuven (http://gbiomed.kuleuven.be/english/corefacilities/microscopy/cic/cic.htm) pour l&#39;utilisation du microscope confocal.

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	<li>Cummings, A. M., Yochim, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+uterus+in+preparation+for+gestation:+a+model+for+the+action+of+progesterone.">Differentiation of the uterus in preparation for gestation: a model for the action of progesterone.</a> J Theor Biol. 106 (3), 353-374 (1984).</li><li>Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+regulation+of+menstruation.">Endocrine regulation of menstruation.</a> Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).</li><li>Wang, X., Matsumoto, H., Zhao, X., Das, S. K., Paria, B. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vimentin+expression+in+cultured+epithelial+cells.">Regulation of vimentin expression in cultured epithelial cells.</a> Eur J Biochem. 210 (2), 509-519 (1992).</li><li>Greaves, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+of+endometriosis+mimics+human+phenotype+and+reveals+insights+into+the+inflammatory+contribution+of+shed+endometrium.">A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium.</a> Am J Pathol. 184 (7), 1930-1939 (2014).</li><li>Pierro, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+interactions+modulate+estrogen+responsiveness+in+normal+human+endometrium.">Stromal-epithelial interactions modulate estrogen responsiveness in normal human endometrium.</a> Biol Reprod. 64 (3), 831-838 (2001).</li><li>Kim, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone-dependent+release+of+transforming+growth+factor-beta1+from+epithelial+cells+enhances+the+endometrial+decidualization+by+turning+on+the+Smad+signalling+in+stromal+cells.">Progesterone-dependent release of transforming growth factor-beta1 from epithelial cells enhances the endometrial decidualization by turning on the Smad signalling in stromal cells.</a> Mol Hum Reprod. 11 (11), 801-808 (2005).</li><li>Chen, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coculturing+human+endometrial+epithelial+cells+and+stromal+fibroblasts+alters+cell-specific+gene+expression+and+cytokine+production.">Coculturing human endometrial epithelial cells and stromal fibroblasts alters cell-specific gene expression and cytokine production.</a> Fertil Steril. 100 (4), 1132-1143 (2013).</li><li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact.">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> J Vis Exp. (113), (2016).</li><li>Arnold, J. T., Kaufman, D. G., Seppala, M., Lessey, B. 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Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Decidualization est la différenciation de la progestérone-dépendante des cellules stromales endométriales dans des cellules déciduales rondes sécrétant. Chez l&#39;homme, ce processus se produit spontanément au cours de la phase lutéale du cycle menstruel et est déclenchée dans les cellules du stroma entourant les cellules vasculaires pour former le predecidua. Cependant, chez les rongeurs, la présence d&#39;un blastocyste est indispensable pour induire décidualisation. Le fait que la décidualisation n&#39;a lieu qu&#39;après contact avec les cellules épithéliales endométriales implique que les facteurs importants sont sécrétées par les cellules épithéliales pour induire decidualization dans le stroma sous-jacent. Bien que cette différence dans l&#39;initiation du processus de decidualization devrait être reconnu, le fait que decidualization humain devient plus robuste sur l&#39;implantation d&#39;embryons suggère que des mécanismes similaires pourraient être impliqués. In vitro des cultures cellulaires sont souvent utilisés pour étudier l&#39;effet des molécules spécifiques pendant le processus de decidualization.Néanmoins, la disponibilité et la quantité de tissus humains qui peuvent être collectées sont souvent limitées et accompagnées de variations, par exemple, la phase du cycle, le nombre de grossesses et la présence de maladies gynécologiques comme l&#39; endométriose ou l&#39; adénomyose. Beaucoup de ces problèmes peuvent être évités par l&#39;utilisation du tissu murin qui est facilement accessible et la phase du cycle indépendant. Un autre important avantage de l&#39;utilisation du tissu murin est la possibilité d&#39;utiliser des rongeurs génétiquement modifiés et la possibilité d&#39;installer un grand nombre d&#39;expériences. À l&#39;heure actuelle, de nombreux protocoles d&#39;isolement différents ont été décrits dans la littérature avec une grande variabilité de l&#39;âge des animaux et la période dans la phase oestrus au moment de l&#39;utilisation. Cette étude présente une nouvelle méthode pour l&#39;endomètre co-cultures primaires de cellules stromales et épithéliales dans lequel on a profité d&#39;un cycle oestral normalisé par une injection quotidienne d&#39;œstrogènes avant l&#39;isolement. En outre, l&#39;oestrogène est known pour induire la prolifération de cellules épithéliales et stromales ce qui augmente encore le rendement par isolement. Le protocole d&#39;isolement décrit dans le présent document se fonde sur Grant et al. 7 Toutefois, d&#39; autres étapes d&#39;optimisation ont été inclus pour augmenter le rendement, la pureté et la viabilité des différentes cultures cellulaires. Tout d&#39;abord, toujours HBSS a été complété avec des antibiotiques pour éviter la contamination de la culture primaire. Pendant l&#39;isolement de MEEC, une adaptation de la température a été effectuée (15 min à 37 ° C) pour augmenter la récolte des cellules epitheliales au cours de la première digestion. Ensuite, une étape supplémentaire a été ajoutée pour modérer l&#39;activité enzymatique après digestion par la trypsine par addition de milieu contenant du FBS à inhiber son activité. En outre, MEECs ont été passés à travers un filtre dont le maillage était plus grande que ce qui est communément décrit (100 um) comme ils viennent souvent en grappes et feuilles de cellules. En outre, la contamination par des cellules de stroma a été réduit en effectuant un ajoutétape itional dans laquelle MEECs et mESCs ont été séparés en fonction de la gravité de la sédimentation. Enfin, MEECs ont été ensemencées sur des lamelles revêtues de collagène pour augmenter la fixation des cellules à des lamelles de verre, comme il est devenu clair que l&#39;attachement aux lamelles de verre non revêtues ou PLL revêtues était insuffisante. Au cours de l&#39;isolement des mESCs, la collagénase (1 mg / mL) a été complétée pour améliorer la digestion. En outre, cette étape de digestion a été réalisée en double afin d&#39;éviter la contamination des MEECs restants. Toutes ces étapes supplémentaires ont donné lieu à des cultures pures et viables des populations de cellules homogènes. La pureté de la population cellulaire a été évaluée par coloration immunologique et qRT-PCR en utilisant la vimentine en tant que marqueur de la cytokératine et stromales comme un marqueur épithélial. De toute évidence, un motif d&#39;expression opposé de vimentine et cytokératine a été observée dans MEEC et MESC. Cependant, on peut remarquer que l&#39;expression d&#39;ARNm relative de la vimentine et de cytokératine est similaire dans les cultures MEEC. similles résultats ar sont publiés par d&#39; autres groupes de recherche, dans lequel les cellules épithéliales en culture acquièrent vimentine expression 9. Plus importante est la différence dans l&#39;expression des protéines entre la vimentine et de cytokératine comme cela a été observé dans les colorations immunohistochimiques des différentes populations de cellules. Double immunomarquage a montré que les CPE étaient positifs pour la cytokératine et ESC étaient positifs pour la vimentine. L&#39;utilisation de ces marqueurs dans immunocoloration est une méthode établie et en standard utilisé pour indiquer les types de cellules 10. Bien que beaucoup de recherches ont été effectuées sur le decidualization de MESC, il reste possible que la présence de cellules épithéliales dans ce modèle peut modifier les résultats de decidualization. En premier lieu, il a été montré que si MEEC atteigne une monocouche, en présence de milieu conditionné MESC ou dans un milieu de co-culture, la monocouche a une résistance électrique trans-épithéliale améliorée des cellules épithéliales (TEER), résultant de facteurs sécrétés par MESC 7. En outre, Pierro et al. 11 ont apporté la preuve que la prolifération epitheliale, influencée par 17β-oestradiol, peut être médiée par des facteurs sécrétés par les cellules stromales, et en variante, les cellules epitheliales peuvent libérer des facteurs qui modulent stroma decidualization 12, 13. Dans l&#39;ensemble, il est clair que l&#39;environnement co-culture épithéliale-stromale fournit une situation plus physiologique qui permet une interaction et de communication paracrine. Le procédé de mise en culture de deux différents types de cellules en utilisant un système de co-culture d&#39; insertion a été décrit précédemment 14, 15 et a été adapté pour l&#39;utilisation de cellules primaires de souris. Par la détection des niveaux d&#39;ARNm de la prolactine en tant que sortie de lecture pour decidualization, la technique décrite a une lecture très reproductible pour decidualization disponibles et permettents ainsi l&#39;étude de la relation épithéliale-stromale pendant decidualization. signaux paracrines médiation de MEEC pourraient modifier l&#39;étendue de decidualization dans les cellules stromales. En outre, le modèle permet une modulation spécifique de la face épithéliale sans affecter directement les cellules stromales. Par conséquent, cette co-culture de MEEC et MESC offre un outil idéal pour évaluer l&#39;effet des hormones, des cytokines, etc. , sur les cellules épithéliales avec une température lue sur stromal decidualization. Un autre avantage de ce système de co-culture est qu&#39;elle permet aux chercheurs d&#39;étudier l&#39;implication d&#39;une protéine spécifique dans le processus decidualization soit dans l&#39;épithélium ou le compartiment stromal en utilisant des cellules isolées à partir d&#39;animaux transgéniques. En outre, cette technique sera très utile pour étudier blastocyste adhérence pour évaluer si les facteurs paracrines sécrétées par les cellules épithéliales en présence d&#39;un blastocyste sont suffisantes pour induire decidualization du stroma sous-jacentcellules. Une étape importante dans l&#39;invasion trophoblastique corrélée à la dégradation de matrice extracellulaire, qui est médiée par l&#39;action des enzymes protéolytiques. La technique proposée peut être appliquée comme un modèle in vitro pour étudier la diaphonie entre le blastocyste, les cellules épithéliales et du stroma de support. Cependant, à l&#39;heure actuelle peu est connu sur l&#39;origine des cellules épithéliales qui peuvent être aussi bien luminal que glandulaire. Par conséquent, une caractérisation plus poussée du profil génétique et moléculaire des cellules épithéliales est nécessaire. En outre, le procédé décrit est limité dans les connaissances disponibles sur la polarisation des cellules épithéliales. À l&#39;heure actuelle, la polarisation des cellules épithéliales n&#39;a pas été prise en compte. Cependant, des différences dans l&#39;expression des protéines de la membrane sont décrites dans les membranes apicales et basales. polarisation inappropriée de la couche épithéliale pourrait avoir un impact sur l&#39;interaction paracrine entre epitheliAl et les cellules stromales. Cependant, les procédés pour obtenir des cellules epitheliales polarisées ont été décrits et peuvent être inclus dans la technique décrite 15, 16. Au total, le protocole décrit propose une technique permettant d&#39;établir avec succès des cultures de cellules primaires de souris épithélial de l&#39;endomètre et des cellules stromales. Cette technique aboutit à des cultures de cellules pures comme confirmé par qRT-PCR et immunocoloration de la vimentine et de cytokératine. En fin de compte, un épithéliale et stromale co-culture a été introduite qui permet la recherche de signaux paracrines médiation soit par MEEC et / ou MESC dans le processus de decidualization.

L&#39;endomètre humain est la paroi interne de l&#39;utérus et subit des cycles mensuels de ventilation et de réparation comme une préparation pour les grossesses possibles. Il se compose d&#39;une seule couche de cellules épithéliales tapissant la cavité utérine et le stroma sous-jacent qui varie en épaisseur en fonction des fluctuations d&#39;hormones oestrogène et de progestérone ovariens. Au cours de la phase lutéale, la progestérone poussée postovulatoire va induire la différenciation des cellules stromales endométriales dans des cellules déciduales plus grandes, rondes, un processus appelé decidualization 1, 2. Chez l&#39;homme, ce phénomène se produit spontanément pour former le predecidua, mais devient plus prononcée lors de l&#39;implantation d&#39;embryons. Une conséquence fonctionnelle de decidualization est que l&#39;utérus devient transitoirement réceptif à l&#39;implantation d&#39;embryons. Cet intervalle est étiqueté comme la «fenêtre d&#39;implantation». Au cours de la première période d&#39;implantation de l&#39;embryon, l&#39;e decidualizedLes cellules stromales ndometrial entourant l&#39; implantation de l&#39;embryon fournissent une barrière pour empêcher le passage de substances nocives pour l&#39;embryon 3. Pendant la grossesse, ce decidua fournira des éléments nutritifs pour le développement du fœtus avant placentation a eu lieu, et sera ensuite former la partie maternelle du placenta 4. Considérations éthiques et pratiques limitent la conception des études humaines pour étudier le processus de decidualization et ont incité l&#39;utilisation de modèles animaux. Être un membre du groupe de placentation hemochorial, l&#39;endomètre des rongeurs sera également soumis à decidualization avant placentation 5. Chez les rongeurs, cependant, l&#39;initiation du processus de decidualization dépend de la présence de blastocytes dans la lumière utérine, ce qui indique qu&#39;un stimulus supplémentaire est nécessaire pour déclencher les réponses déciduales 6. Cela implique une communication complexe entre ee cellules de l&#39;endomètre épithéliales qui sont en contact direct avec le blastocyste, et les cellules stromales sous-jacentes. Néanmoins, decidualization peut être induite artificiellement en utilisant des stimuli comme le grattage mécanique ou l&#39;instillation d&#39;huile dans un utérus hormono apprêtée. Bien que des études in vivo en utilisant des modèles de decidualization artificiels nous ont permis d&#39;améliorer nos connaissances dans le processus complexe de signalisation des decidualization, des études mécanistiques en profondeur, par exemple, l&#39; enquête de la communication indispensable entre les cellules épithéliales et stromales, sont limitées. Par conséquent, les études in vitro decidualization peuvent être utilisés pour manipuler des voies importantes et l&#39; étude des processus fondamentaux. A cet effet, les cultures de cellules stromales endométriales primaires peuvent être mis en place à partir de l&#39;endomètre humain ou de rongeur. Employant rongeurs consent l&#39;utilisation d&#39;animaux génétiquement modifiés pour étudier le rôle d&#39;une protéine d&#39;intérêt spécifique pendant le processus de decidualization. Cependant, immature, prepuberty souris sont souvent utilisés afin d&#39;éviter des complications du cycle oestral, tandis que dans d&#39;autres cas, les utérus sont prélevés sur toutes les phases du cycle oestral, ce qui se traduit par une hétérogénéité dans les cultures. En outre, le procédé de decidualization a été étudié dans différents protocoles, par exemple, par (i) les hormones additionnel (oestrogène, la progestérone ou l&#39;adénosine monophosphate cyclique (AMPc)) dans le milieu de culture, ou par (ii) l&#39; isolement des cellules déciduales de souris à jour 4,5 (pseudo) grossesse, qui exigent besoin supplémentaire de prise de contrôle et d&#39;hommes ayant subi une vasectomie. Ces limitations démontrent la nécessité d&#39;une méthode normalisée pour étudier en decidualization vitro. Dans cette étude, un modèle physiologique pour examiner decidualization in vitro à partir de l&#39; adulte, (pseudo) souris non enceintes seront présentées. Dans ce procédé, l&#39;injection journalière de 17β-estradiol (E2) va induire la prolifération des cellules de l&#39;endomètre, conduisant à une augmentation du rendement homogène et ppopulations de cellules ure. En outre, l&#39;utilisation d&#39;un système de co-culture permet l&#39;étude de la paradiaphonie et de l&#39;épithélium et du stroma de la capacité de manipuler le processus de decidualization à différents niveaux.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
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		<tr>
			<td>ThinCert Tissue culture insert for 24 well plates; 1 &#181;m pore size; transparant</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662610</td>
			<td>Inserts are also provided for other multiwell plates and/or other pore sizes. Other suppliers: Merck Millipore. 
			https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0110_0110_0090_0030/13408/&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Cell culture treated 24 well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td> http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Bromoadenosine 3&#8242;,5&#8242;-cyclic monophosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B7880</td>
			<td>Prepare a stock solution of 100 mM in Milli Q water. Store aliquots at -20 &#176;C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medroxyprogesterone 17-acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1629</td>
			<td>Prepare a stock solution of 250 &#181;M in ethanol. Store aliquots at -20 &#176;C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arachis oil</td>
			<td>Supermarket</td>
			<td></td>
			<td>Standard cooking arachis oil that can be found in every supermarket is used </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrestoBlue cell viability reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A13261</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 1x, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-046</td>
			<td>Store in fridge as long as possible. Use cold HBSS+ during the protocol. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17-&#946; Estradiol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E8875</td>
			<td>Prepare a stock solution of 1mg/ml in EtOH before diluting in arachis oil (1:1000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell medium filter Stericup, 0.22 &#181;m, polyethersulfone, 500 mL, radio-sterilized</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td> http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063&#160;&#160;&#160;&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12, phenol red, L-glutamine, HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-056</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290-018</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50mg/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-037</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5921</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB-105</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6395</td>
			<td>Dilute in Milli Q water, adjust pH to 7 with NaOH and filter before use. Store in the dark. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1882</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, glass, 18 mm &#216;</td>
			<td>Glaswarenfabrik Karl Hecht</td>
			<td>1001/18</td>
			<td> http://www.hecht-assistent.de/187/?L=1&#38;tx_rmproducts_pi1[g]=937&#38;tx_rmproducts_pi1[p]=3504&#38;tx_rmproducts_pi1[v]=20088&#38;cHash=abd12065683fe74b00eaa5e562824d06&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IA from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2674</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7409</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Warm to room temperature before use. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 40 &#181;m mesh, disposable</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td> https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 100 &#181;m mesh, disposable</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td> https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22&#160;&#181;m, polyethersulfone, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td> https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial) 100%</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.00063</td>
			<td> https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>354236</td>
			<td>From rat tail. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=&#38;productid=354236%28Lifesciences%29#&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancreatin from porcine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3292</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td> https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. analytical reagent</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821296</td>
			<td> https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal rabbit anti-human vimentin (D21H3)&#160;</td>
			<td>Cell Signalling Tech</td>
			<td>#5741</td>
			<td>use 1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal mouse anti-human pan cytokeratin&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2562</td>
			<td>use 1/1000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td> http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en&#38;region=BE&#38;gclid=Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIwBEiQAI8rq879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k8P8HAQ&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td> http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488&#38;resultPage=1&#38;resultsPerPage=15&#38;autocomplete=&#38;searchMode=keyword&#38;productTypeSelect=antibody&#38;targetTypeSelect=antibody_secondary&#38;species=ltechall&#38;keyword=488#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;;conjugates:^\%22Alexa%20Fluor&#38;reg;%20488\%22$;; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td> http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594&#38;resultPage=1&#38;resultsPerPage=15&#38;autocomplete=&#38;priorSearchTerms=&#38;searchMode=keyword&#38;productTypeSelect=antibody&#38;targetTypeSelect=antibody_secondary&#38;species=ltechall&#38;keyword=594#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Mus%20musculus\%22$;;&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td> http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, with calcium and magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040174</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133&#160; </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization

Decidualization est un procédé de différenciation de la progestérone-dépendante des cellules stromales endométriales et est une condition sine qua non pour la réussite de l&#39;implantation de l&#39;embryon. Bien que de nombreux efforts ont été déployés pour faire apparaître les mécanismes sous-jacents de la décidualisation, la signalisation exacte entre les cellules épithéliales qui sont en contact avec l&#39;embryon et les cellules stromales sous-jacent reste mal comprise. Par conséquent, l&#39;étude decidualization d&#39;une manière qui prend à la fois la épithéliales et des cellules stromales en compte pourrait améliorer nos connaissances sur les détails moléculaires de decidualization. A cet effet, dans les modèles in vivo de decidualization artificiel sont physiologiquement la plus pertinente; Cependant, la manipulation de la communication intercellulaire est limitée. À l&#39; heure actuelle, dans les cultures in vitro de cellules stromales endométriales sont utilisées pour étudier la modulation de la décidualisation par plusieurs molécules de signalisation. Classiquement, les cellules stromales endométriales humaines ou de souris sontutilisé. Cependant, la disponibilité d&#39;échantillons humains est très souvent limitée. En outre, l&#39;utilisation des tissus de souris est accompagné de variété dans le procédé de mise en culture. Cette étude présente une méthode validée et standardisée pour obtenir pur cellules endométriales épithélial (CEE) et des cellules stromales (ESC) cultures utilisant des souris intactes adultes traités avec de l&#39;oestrogène pendant trois jours consécutifs. Le protocole est optimisé pour améliorer le rendement, la viabilité et la pureté des cellules et a été étendu afin d&#39;étudier decidualization dans une coculture de CEE et ESC. Ce modèle peut être adapté pour exploiter l&#39;importance des deux types de cellules dans decidualization et d&#39;évaluer la contribution des molécules de signalisation importantes sécrétées par la CEE ou ESC lors de la communication intercellulaire.

Présentation générale du protocole La figure 1A illustre une vue d&#39; ensemble du protocole. Une injection quotidienne de E2 (100 ng) pendant trois jours consécutifs a été utilisé pour synchroniser les animaux et de normaliser la phase du cycle oestral. Le cycle oestral peut être évaluée par lavages vaginaux et est divisé en proestrus, l&#39;oestrus, dioestrus, et la phase de métoestrus. La phase de cycle peut être désigné en fonction de la proportion de cellules desquamées dans le lavage, qui sont soumis à des changements hormonaux. L&#39;augmentation des niveaux d&#39;oestrogène fera les animaux évoluent à la phase oestrus. Cette phase peut facilement être détectée par la présence de cellules epitheliales cornifiées exclusivement et l&#39;absence de leucocytes (figure 1B). Le jour 4, du col de l&#39; animaux qui sont en phase oestrus sont recueillies et MEEC et MESC sont isolés (figure 1C). decidualization cun être induite par addition de 0,5 mM d&#39;AMPc et 1 uM d&#39;AMP au milieu de FBS à 2% au cours d&#39;une période d&#39;incubation de 5 jours. Contrôle de la qualité des MEEC et MESC Cultures La pureté des cultures de cellules primaires peut être évaluée par la différence de la vimentine et de cytokératine expression. Vimentine est un filament intermédiaire qui est exprimée dans les cellules mésenchymateuses, donc dans les cellules stromales de l&#39;endomètre. Cytokeratin est un filament intermédiaire trouvé dans le cytosquelette du tissu épithélial. La figure 2A montre le niveau d&#39;expression de l&#39; ARNm de la vimentine et la cytokératine dans MEEC et MESC évaluée en utilisant qRT-PCR. les niveaux de Vimentin sont riches en MESC et faible en MEEC (2,2x supérieur, p &lt;0,001), tandis que les niveaux cytokératine sont riches en MEEC et faible en MESC (36x supérieur, p &lt;0,001). A vimentine / cytokératine double coloration a été réalisée et a indiqué que les cellules stromales expriment vimentine alors EPITHELIAL cellules expriment la cytokératine (figure 2B, C). L&#39;absence d&#39;anticorps primaire a été utilisé comme témoin négatif pour la coloration immunologique (figure 2D, E). Ces colorations immunohistochimiques montrent que les cultures de cellules endométriales (MEEC et MESC) ont une pureté allant jusqu&#39;à 90%. Decidualization dans MEEC / MESC cocultures Après isolement, les cellules de l&#39;endomètre et du stroma de la souris ont été inoculées dans un système de co-culture pour simuler l&#39;environnement de l&#39;endomètre. Les cellules ont été cultivées jusqu&#39;à ce que les cellules epitheliales ont formé une monocouche dans l&#39;insert de culture cellulaire (valeurs TEER de 800 - 1000 / puits) et les cellules stromales ont atteint un état de sous-confluentes. Decidualization a été induite dans les cellules du stroma avec application de 0,5 mM d&#39;AMPc et 1 uM d&#39;AMP. Après cinq jours d&#39;incubation, les taux d&#39;ARNm de prolactine ont été évalués dans les cellules du stroma par qRT-PCR comme une indication pour DECIDualization (figure 3A). Les taux de prolactine sont fortement exprimés dans des cellules soumises à des hormones et non détectables dans les cellules incubées avec le milieu témoin (p &lt;0,01). Etant donné que les cellules épithéliales sont difficiles à visualiser à l&#39; intérieur des inserts de culture cellulaire, un test de viabilité a été effectuée immédiatement après la période d&#39;incubation de cinq jours (figure 3B). Un mélange de milieu de croissance normal et un réactif de viabilité ont été ajoutés aux puits et mis à incuber pendant une durée minimale de 8 à 12 heures. Le changement de couleur du bleu au rose vif indique la présence de cellules épithéliales viables. Notez que le changement de couleur ne se produira que lorsque les cellules viables sont présents. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig1.jpg" /> Figure 1: Vue d&#39; ensemble générale du Protocole. (A) Schéma du protocole d&#39;isolement à partir de troisjours d&#39;injections consécutives d&#39;oestrogène. Le jour 3, les préparatifs nécessaires doivent être préparés. Le jour 4, on évalue la phase oestrus (indiquée par l&#39;étoile), en effectuant un lavage vaginal. MESC et MEEC sont isolés sous différentes étapes de la digestion. Au jour 6, ou lorsque les cellules sont confluentes, decidualization peut être induite dans le système de co-culture par addition d&#39;AMPc et de l&#39;AMP sur le support et une période d&#39;incubation de cinq jours (jours 6-11). (B) de l&#39; image représentant de la phase oestrus caractérisée par la présence de cellules épithéliales cornées dans le lavage vaginal (grossissement 10X). (C) de l&#39; image représentant de MESC et MEEC (grossissement 20X, barre d&#39;échelle: 100 um). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig2.jpg" /> <strong&gt; Figure 2: immunocoloration et RT-PCR quantitative pour la vimentine et Cytokeratin en MEEC et MESC. (A) Les niveaux d&#39; ARN messager de la vimentine et de cytokératine expression pour indiquer la pureté des cultures. Les taux d&#39;ARN sont quantifiés relativement à la moyenne géométrique des gènes domestiques ACTB et TBP. Les données sont montrées comme la moyenne ± SEM. Vimentine / cytokératine double coloration sur des cultures de MESC (B) et les cultures MEEC (C). Insérer dans la gauche montre une vue de grossissement 63X. Contrôle négatif avec l&#39; anticorps primaire omis pour MESC (D) et MEEC (E) (barre d&#39;échelle: 50 um). ***: P &lt;0,001 avec deux voies ANOVA avec correction de Bonferroni pour les tests multiples. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Figure 3: Validation du decidualization par RT-PCR. Les niveaux (A) ARNm d&#39;expression prolactine dans les cellules stromales pour évaluer la décidualisation. Les taux d&#39;ARN sont quantifiés relativement à la moyenne géométrique des gènes domestiques PGK1 et TBP. Le facteur de variation dans les cellules cultivées dans le contrôle ou le milieu déciduale est représenté sous forme de moyenne ± SEM. (B) images illustratifs de cellules stromales avant ( en haut) et après ( en bas) decidualization stimulus. L&#39;insert sur la droite représente un grossissement d&#39;une cellule stromale decidualized. Decidualization est caractérisée par la présence de cellules multinucléées, indiqué par des flèches noires. (C) Des images représentatives de l&#39;évaluation de la viabilité des cellules épithéliales dans l&#39;insert après le dosage. Les images ont été prises immédiatement après l&#39;administration du réactif de viabilité (Prestoblue) (0 h) et fuite matin (ON). **: P &lt;0,01 avec le test de Mann-Whitney U. ON: du jour au lendemain. Barre d&#39;échelle: 100 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Cette étude présente une méthode standardisée et validée pour l&#39;isolement et la culture de la souris primaire stroma de l&#39; endomètre et des cellules épithéliales, qui peut être utilisé dans un système de coculture pour étudier en decidualization vitro.

Isolement de souris endométriale épithéliales et stromales Cellules pour<em&gt; In vitro</em&gt; decidualization

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