Name: isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization
Uploaded: 2017-03-02T13:00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Research Foundation-Flandern (FWO G.0856.13N) og Forskningsrådet av KU Leuven (OT / 13/113). KDC er finansiert av FWO Belgia. AH er finansiert av OT / 13/113. Vi vil gjerne takke Cell Imaging Core innretningen av KU Leuven (http://gbiomed.kuleuven.be/english/corefacilities/microscopy/cic/cic.htm) for bruk av konfokal mikroskop.

AlexaFluor Alle dyreforsøk for denne studien ble godkjent av etisk komité av KU Leuven (Belgia) (Prosjekt P174 / 2013). Mus ble plassert under standardbetingelser, med ad libitum tilgang til mat pellets og vann fra springen, og holdes under kontrollerte forhold (23 ± 1,5 ° C, relativ fuktighet 40-60%, 12/12 lys / mørke syklus). 1. Mice <ol><li> Bruke kommersielt tilgjengelige musestamme (dvs. C57Bl / 6, kvinnelig 8 - 12 uker gamle). Vanligvis 4 - vil 5 mus gi en egnet mengde av celler for ytterligere eksperimenter. </li><li> Injiser intakte mus subkutant med 100 ul av den 17β-østradiol (E2) oppløsning (100 ng / 100 pl) i tre påfølgende d forut for isolering for å standardisere fasen av brunst av dyrene og for å indusere proliferering av endometriet celler. Behovet for kontroll av syklusen fase av musene før protokollen er unngåelig beÅrsaken til 3 d &#39;østradiol behandling. </li></ol> 2. Forberedelser <ol><li> Lag en løsning av 100 ng / 100 mL E2 i jordnøttolje. For injeksjoner av fem mus (som beskrevet under 1.2), er en mengde på 1,5 ml etter behov. <ol><li> Oppløs 1 mg E2 i 1 ml etanol for å ha en stamløsning av 1 mg / ml. </li><li> Fortynne denne stamløsning 1: 1000 i jordnøttolje. </li></ol></li><li> Gjør 500 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBBS) 1x supplert med 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin (nærmere omtalt som HBSS +). </li><li> Gjør 500 ml filtrert mus Livmor stromal Cell (Mesc) medium til kulturen Mesc: Dulbeccos Modified Eagle Medium / Nutrient Blanding F12 (DMEM / F12) med fenolrødt, L-glutamin og 4- (2-hydroksyetyl) piperazin-1-etansulfonsyre syre, N - (2-hydroksyetyl) piperazin-N &#39;- (2-etansulfonsyre) (HEPES) inneholdende 10% FBS, 0,5 ug / ml amfotericin B, og 100 pg / ml gentamicin (further referert til som Mesc medium). </li><li> Gjør 500 ml filtrert 2% Mesc medium til kulturen Mesc under decidualization: DMEM / F12 med fenol rød, L-glutamin og HEPES inneholdende 2% FBS, 0,5 ug / ml amfotericin B, og 100 ug / ml gentamicin. </li><li> Fremstille 500 ml av filtrert mus Livmor Epithelial Cell (MEEC) Medium: DMEM inneholdende 10% FBS, 0,5 ug / ml amfotericin B, 100 ug / ml gentamicin, 25% MCDB-105 medium, og 5 pg / ml insulin (nærmere omtalt som MEEC medium). </li><li> Forbered Poly-L-lysin (PLL) belagt Dekk for Mesc kultur. <ol><li> Oppløs 25 mg av PLL i 250 ml destillert vann. Filtrer løsningen ved hjelp av et 0,22 um filter. </li><li> Legg sterile dekkglass i en 12-brønns plate. Legg 300 mL av oppløst PLL på glassene. </li><li> Fjern oppløsningen etter 30 minutters inkubering. Platene kan lagres ved 4 ° C inntil videre anvendelse (opp til 1 - 2 måneder). </li></ol></li><li> Forbered en 10 mg / ml stamløsning of kollagenase type Ia og lagre prøver av 300 mL ved -20 ° C. Filter før bruk. </li></ol> 3. Forberedelser Obligatoriske 24 timer før Isolation <ol><li> Forbered kollagen belagt dekkglass for MEEC kultur. <ol><li> Fremstille en 0,02 M eddiksyreoppløsning i destillert vann (1 ml pr dekkglass). </li><li> Legg 150 pl kollagen i 12 ml 0,02 M eddiksyre for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 50 ug / ml. </li><li> Legg sterile dekkglass i en 12-brønns plate. </li><li> Tilsett 1 ml kollagen-oppløsning (se 3.1.2). </li><li> Inkuber O / N (minimum 12 timer) ved 37 ° C. Under isolasjon: </li><li> Fjern kollagen løsning av objektglassene ved suging og la det lufttørke i et sterilt miljø (i den laminære strømningsskap). </li><li> Vask objektglassene to ganger med fosfatbufret saltløsning (PBS). </li></ol></li><li> Tilbered en 2,5% pancreatin løsning ved å tilsette 0,25 g pancreatin i en 15 ml kanonisk rør som inneholder 10 mlHBSS +. Rist (200 rpm) til oppløsningen ved 37 ° C i 1 time for å øke løseligheten. Oppbevar ved 4 ° C. </li></ol> 4. Isolering og kultur av Mouse Livmor Epitelceller (MEEC) og mus Livmor stromale celler (Mesc) <ol><li> Legg 25 mg trypsin i et 15 ml rør inneholdende 2,5% pankreatin oppløsning (se 3.2) for å ende opp med en endelig oppløsning inneholdende 0,25% trypsin (nærmere omtalt som Mesc fordøyelse blanding). </li><li> Isolering av uteri <ol><li> Kontroller syklus fase av dyrene med et vaginalutstryket undersøkelse. <ol><li> Beherske dyret og spyle skjeden forsiktig med 50 mL PBS 3 - 5 ganger. </li><li> Samle den endelige flush på et objektglass. </li><li> Undersøk materiale under en lysfelt mikroskop ved hjelp av en 10X eller 20X objektiv. </li><li> Bruk bare mus som er i estrus fase. Denne fasen er kjennetegnet ved tilstedeværelsen av forhornede epitelceller i vaginal utskylling (Figur 1 </strong&gt;). </li></ol></li><li> Avlive dyrene ved hjelp av en egnet metode som halshugging eller CO 2 indusert narkose. </li><li> Spray skrottene med 70% etanol for å generere et sterilt miljø. </li><li> Ved hjelp av sterile kirurgiske verktøy, åpne magen og skyv tarmen til side for å visualisere både livmor horn. </li><li> Ta tak i livmor horn på det mest fjerntliggende ende under egglederen. Skjær livmor horn fra egglederen og fjerne fettvev og bindevev. Skjær ut horn på distal ende over livmorkroppen og legg den i en 35 mm petriskål med 3 ml HBSS +. <ol><li> Gjenta dette trinnet for de andre horn og for de andre dyrene til alle livmor horn er samlet. </li></ol></li><li> Rengjør livmor horn (i HBSS +) videre under et stereoskop og fjerne alle rester av adipose eller bindevev. </li><li> Skjær livmor horn åpne lengderetningen for å avsløre livmor lumen og erstatte the horn i en ny petriskål med frisk HBSS +. </li><li> Overfør alle livmor horn til 15 ml tube inneholder pankreatin og trypsin. </li><li> Inkuber horisontalt i 60 min ved 4 ° C på en orbital-rystemaskin (50 rpm). </li><li> Inkuber horisontalt i 45 minutter ved 23 ° C (RT), uten risting. </li><li> Inkuber horisontalt i 15 min ved 37 ° C (vannbad), uten risting. </li><li> Samtidig gjør den Mesc fordøyelse blandingen ved oppløsning av 300 ul av 1 mg / ml kollagenase lager i 2,7 ml av 0,05% Trypsin-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) løsning. MERK: Fra nå av blir ytterligere isolasjon trinn utføres i et sterilt miljø under en laminær kabinett. </li></ol></li><li> Mus Endometrisk epitelceller (MEEC) Kultur <ol><li> Etter 2 timers inkubering, forsiktig helle vekk den overliggende oppløsning. </li><li> Overfør uteri inn i en petriskål inneholdende kald MEEC medium og inkuberes i 5 min for å inaktivere trypsinaktivitet. </li><li> Overfør uteri til et 15 ml rør inneholdende 3 ml kald HBSS +. </li><li> Vortex i 10 s for å frigi de epiteliale ark. </li><li> Skyll uteri i en ren petriskål med 3 ml HBSS +. </li><li> Gjenta trinn 4.3.2 - 4.3.4 for å oppnå et totalt tre suspensjoner som inneholder epitel-ark. </li><li> Overfør uteri til Mesc fordøyelse blandingen og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C under rysting (200 rpm) (gå til trinn 4.4 for videre isolering av Mesc). </li><li> Gjenopprette de epiteliale arkene ved pipettering av tre cellesuspensjoner forsiktig på en 100 pm nylonnett for å fjerne vev rusk. </li><li> Sentrifuger den oppsamlede cellesuspensjonen ved 500 xg i 5 minutter. </li><li> Suspender pelleten i 12 ml MEEC medium og bland godt. </li><li> Avgjøre oppløsningen i 5 minutter for å separere gjenværende Mesc ved hjelp av tyngdekraften sedimentering. </li><li> Fjern forsiktig de øvre 2 ml ved hjelp av en 5 ml pipette. </li><li> Sentrifuger cellen suspension 500 xg i 5 min. </li><li> Resuspender i MEEC medium ved forsiktig pipettering opp og ned. </li><li> Plate cellene på kollagen-belagt dekk i den ønskede tetthet for videre eksperimenter (figur 2a). </li><li> Inkuber cellene ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator i minst 12 timer. MERK: For farging eller funksjonelle eksperimenter som fluorescerende kalsium bildebehandling, er det anbefalt å plate cellene direkte på glassene, mens seeding i en seks-brønns plate anbefales når RNA eller protein isolasjon er ønsket. Isolering av muse endometrial stromale celler er delt i to runder som renheten av cellene etter bare en spaltning kan være utilstrekkelig. Uterusene fordøyd to ganger for en optimal celle rekreasjon og renhet. I begge rundene tekniske inngrep er identiske. Celler samlet fra begge omganger kan oppbevares for videre eksperimenter, som ønskes av forskeren. </li></ol></li><li> Mus Endometrisk Stromal Cell (Mesc) Kultur: 1 st Round <ol><li> Før starten av første fordøyelsen runde, utarbeide en andre fordøyelsen blanding ved å oppløse 300 mL av 1 mg / ml kollagenase lager i 2,7 ml 0,05% Trypsin-EDTA løsning. Denne blandingen er nødvendig i trinn 4.4.8. </li><li> Fremstille tre små petriskåler med kald (4 ° C) HBSS + og 3 x 15 ml rør med 3 ml medium (Mesc rør X1, X2 og X3). </li><li> Etter 30 min inkubasjon riste uteri holdige trypsin-løsning forsiktig i 10 sek. Mesc cellene vil løsne fra livmorvevet, og vil forbli i trypsinoppløsning. </li><li> Overfør uteri til den første petriskål inneholdende 3 ml kald (4 ° C) HBSS + og skyll godt. </li><li> Tilsett 3 ml av Mesc medium til røret som opprinnelig inneholdt de uterine horn (rør i trinn 4.4.3) til å inhibere trypsin-aktivitet. </li><li> Overfør uteri fra petriskålen med kald (4 ° C) HBSS + til røret X1 inneholdende 3 ml Mesc medium og rist forsiktig i 10 sek. </li&gt; <li> Gjenta trinn 4.4.4 (overføring til en petriskål med kaldt (4 ° C) HBSS +) og 4.4.6 (overføring til rør X2 og X3) to ganger. MERK: Til slutt vil denne protokollen resultere i 4 cellesuspensjoner: en tube som inneholder trypsin løsning og 3 rør med Mesc medium som inneholder Mesc (rør X1, X2 og X3). </li><li> Overfør uteri i den nye Mesc fordøyelse, som beskrevet i trinn 4.4.1 og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C, vertikalt. </li><li> Samle de stromale celler ved å føre de fire cellesuspensjoner gjennom en 40 um nylonnett. Skyll mesh med ytterligere 5 ml av Mesc. </li><li> Sentrifuger cellesuspensjonen ved 500 x g i 7 min. </li><li> Resuspender pelleten i Mesc og platen på PLL-belagte dekkglass for videre eksperimenter med den ønskede densitet. </li><li> Inkuber i et minimum av 4 - 6 timer, eller O / N ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator. </li></ol></li><li> Mus Endometrisk stromal Cell (Mesc) Kultur: 2. runde &lt;ol&gt; <li> Fremstille tre små petriskåler med kald (4 ° C) HBSS + og 3 x 15 ml rør med 3 ml av Mesc medium (Rubber Y1, Y2 og Y3). </li><li> Gjenta trinn 4.4.3 - 4.4.7. </li><li> Overfør den siste cellesuspensjonen sammen med uteri til et 40 um nylonnett. </li><li> Samle de stromale celler ved å føre innholdet av røret Y1, Y2 og Y3 gjennom nylonnetting. Skyll mesh med ytterligere 5 ml av Mesc. </li><li> Sentrifuger cellesuspensjonen ved 500 x g i 7 min. </li><li> Resuspender pelleten i Mesc medium og plate på PLL-belagte dekkglass for videre eksperimenter (figur 2B). </li><li> Inkuber i et minimum av 4 - 6 timer ved 37 ° C med 5% CO2. MERK: For farging eller funksjonelle eksperimenter som fluorescerende kalsium bildebehandling, er det anbefalt å plate cellene på dekkglass, mens seeding i en seks-brønns plate anbefales når RNA eller protein isolasjon er ønsket. </li></ol></li></ol> 5. vimentin/ Cytokeratin Double Farging for validering av Pure MEEC og Mesc kulturer <ol><li> Seed cellene på dekkglass. </li><li> Vask 3 x 5 min med PBS inneholdende kalsium og magnesium, på en orbital-rystemaskin (50 rpm). </li><li> Fest cellene med 4% paraformaldehyde (PFA) (OBS!) For 10 min, ikke på shaker. </li><li> Vask 3 ganger med PBS uten kalsium og magnesium på rister (50 rpm). </li><li> Permeabilisere cellene med 0,2% Triton X-100 i 10 minutter på en ristemaskin (50 rpm). </li><li> Vask 3 ganger med PBS på en ristemaskin. </li><li> Blokk med 5% geiteserum (GS) i PBS i 2 timer på et risteapparat (50 rpm) </li><li> Inkuber cellene med monoklonale kanin-anti-human vimentin (1: 500) og monoklonal mus anti-human pancytokeratin (1: 1000) ved 4 ° C på en ristemaskin (50 rpm). Antistoffer er fortynnet i PBS med 0,5% GS. </li><li> Vask 3 ganger med PBS på en ristemaskin (50 rpm). </li><li> Inkuber cellene med sekundære antistoffer (1: 1000 i 0,5% GS) Alexa Fluor 488-konjugert anti-kanin IgG og Alexa Fluor 488-conjugated anti-mus IgG på en ristemaskin. </li><li> Vask 3 ganger med PBS på en ristemaskin. </li><li> Mount lysbilder med vandig monteringsmedium som inneholder DAPI og tørr O / N. </li><li> Forsegle lysbilder med neglelakk og holder på 4 ° C for videre bruk (figur 2a, b). </li></ol> 6. In Vitro Decidualization i en coculture System MERK: Fire til fem dyr er nødvendig for å etablere et coculture system i en 24-brønns plate. Fortsett med følgende protokoll i et sterilt miljø, fortrinnsvis under en laminær strømningsskap. <ol><li> Fremstille cellekultur innsatsene i løpet av sentrifugering og / eller inkubasjons-trinn av epitelcelle isolasjon (som beskrevet i 4.3) i en 24-brønns plate. <ol><li> Tilsett 200 - 400 ul av Mesc medium til den ønskede mengde av brønner i 24-brønns plate. </li><li> Plasser innsatsene i de forhåndsfylte 24-brønner ved hjelp av steril pinsett. </li></ol></li><li> Resuspender MEEC pellet(Trinn 4.3.14) i MEEC medium og skillet over inserts (arbeidsvolum: 150 - 300 mL per innsats). Kultur av cellene ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator. </li><li> Seed de stromale celler i en annen 24-brønns plate (kompatibel med cellekultur inserts) etter den andre runden av stromal celle isolasjon (trinn 4.5.6). Bruker et arbeidsvolum på 400 ul cellesuspensjon per brønn. </li><li> La stromale celler til å feste til minimum 4. - 6. timer ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator. </li><li> Overfør celledyrkningsinnsatser dekket med epitelceller fra den første 24-brønners plate i den andre 24-brønnsplate dekket av stromale celler. Bruk steriliserte pinsett eller berøre innleggene bare på deres hengende foten. </li><li> Kultur av cellene ved 37 ° C i 5% CO2 inkubator i en periode på 3 - 5 d til epitelcellene danne et monolag, og stromaceller oppnå 80-90% konfluens. I tillegg bruker transepitelial elektrisk motstand (Teer)å overvåke den epiteliale monolaget ved anvendelse av et Volt / ohm epitelial meter som beskrevet av Grant et al. 7. Verdier for 800-1000 / brønn var tilstrekkelig til å vurdere epitel monolag konfluent. </li><li> Om nødvendig, bytt medium hver 2-3 d bruker glass pipetter eller fine pipettespisser. Begynn med utskifting av medium av stromale celler (seeded ved bunnen), før utskifting av medium i innsatsene. Det anbefales å bruke forvarmet cellekulturmedium ved 37 ° C. </li><li> Forbered decidualization medium for å indusere in vitro decidualization før du starter eksperimentet. Bruker et arbeidsvolum på 400 ul per brønn av stromale celler. <ol><li> Forbered følgende stamløsninger og butikk alikvoter ved -20 ° C. <ol><li> Forbered 250 uM medroksyprogesteron-17-acetat (MPA) i etanol. </li><li> Forbered 100 mM stamløsning 8-Bromoadenosine 3 &#39;, 5&#39;cAMP i ultrarent vann. </li></ol></li><li> Gjør decidual medium som inneholder 1fiM MPA og 0,5 mM cAMP i Mesc medium som inneholder 2% FBS. </li></ol></li><li> Fjern forsiktig medium fra brønnene og tilsett decidual medium på de stromale celler. Hvis en kontroll tilstand er nødvendig, bruker Mesc medium som inneholder 2% FBS. </li><li> Fjern mediet fra celledyrkningsinnsatser og tilsett 300 ul av MEEC medium på cellene. </li><li> Cellene inkuberes i 5 d i en inkubator ved 37 ° C i 5% CO2. </li><li> Etter den femte dagen, vurdere omfanget av decidualization i stromale celler ved RT-qPCR (se nedenfor). </li><li> Validere levedyktigheten av epitelceller ved hjelp av Resazurin-baserte levedyktighet reagens. <ol><li> Forbered en 1:10 løsning av levedyktighet reagens i MEEC medium. </li><li> Overfør celledyrkningsinnsatser inn i en ny 24-brønners plate. </li><li> Legg 150 - 300 ul av levedyktigheten reagenset - MEEC løsning på cellene. </li><li> Inkuber ved 37 ° C i 5% CO2 vedminst 4-5 timer eller over natten og vurdere celleviabilitet ved å observere en fargeforskyvning (blå til lilla / rosa). MERK: Decidualization kan også bli vurdert å bruke en mus prolaktin-spesifikke ELISA, som foretrekkes av forskeren. </li></ol></li></ol> 7.Validation av Decidualization ved QRT-PCR MERK: For validering av decidualization ved QRT-PCR, anbefales det å utføre alle testforholdene i to eksemplarer for å få en tilstrekkelig mengde av celler for RNA-analyse. Kvantitativ RT-PCR blir utført som tidligere beskrevet i De Clercq et al. 8. I korte trekk: <ol><li> Isoler total RNA ved hjelp av et kommersielt RNA isolering kit. <ol><li> Vurdere kvantitet og kvalitet av RNA ved hjelp av kommersielle metoder i henhold til produsentens protokoll, henholdsvis. </li></ol></li><li> Syntetisere cDNA, i henhold til produsentens protokoll fra 1 pg av total RNA. </li><li> Bruke et kommersielt kit ifølge produsentens protokoll for å utføre QRT-PCR-reaksjonen. <ol><li> Kjør alle prøvene i tre eksemplarer. </li><li> Benytt deg av det kommersielle TaqMan Master Mix og spesifikke TaqMan prober for de ønskede housekeeping gener og prolaktin (prl8a2) for å utføre reaksjonen. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Cummings, A. M., Yochim, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+uterus+in+preparation+for+gestation:+a+model+for+the+action+of+progesterone.">Differentiation of the uterus in preparation for gestation: a model for the action of progesterone.</a> J Theor Biol. 106 (3), 353-374 (1984).</li><li>Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+regulation+of+menstruation.">Endocrine regulation of menstruation.</a> Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).</li><li>Wang, X., Matsumoto, H., Zhao, X., Das, S. K., Paria, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+signals+direct+the+formation+of+tight+junctional+permeability+barrier+in+the+decidualizing+stroma+during+embryo+implantation.">Embryonic signals direct the formation of tight junctional permeability barrier in the decidualizing stroma during embryo implantation.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 1), 53-62 (2004).</li><li>Zygmunt, M., Herr, F., Munstedt, K., Lang, U., Liang, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+and+vasculogenesis+in+pregnancy.">Angiogenesis and vasculogenesis in pregnancy.</a> Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 110 Suppl 1, S10-S18 (2003).</li><li>Power, M. L., Schulkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The evolution of the human placenta. , (2012).</li><li>Finn, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initiation+of+the+decidual+cell+reaction+in+the+uterus+of+the+aged+mouse.">The initiation of the decidual cell reaction in the uterus of the aged mouse.</a> J Reprod Fertil. 11 (3), 423-428 (1966).</li><li>Grant, K. S., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+mouse+uterine+stromal+cells+on+epithelial+cell+transepithelial+resistance+(TER)+and+TNFalpha+and+TGFbeta+release+in+culture.">Effect of mouse uterine stromal cells on epithelial cell transepithelial resistance (TER) and TNFalpha and TGFbeta release in culture.</a> Biol Reprod. 69 (3), 1091-1098 (2003).</li><li>De Clercq, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+transient+receptor+potential+channels+in+human+endometrial+stromal+cells+during+the+luteal+phase+of+the+menstrual+cycle.">Functional expression of transient receptor potential channels in human endometrial stromal cells during the luteal phase of the menstrual cycle.</a> Hum Reprod. 30 (6), 1421-1436 (2015).</li><li>Pieper, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vimentin+expression+in+cultured+epithelial+cells.">Regulation of vimentin expression in cultured epithelial cells.</a> Eur J Biochem. 210 (2), 509-519 (1992).</li><li>Greaves, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+of+endometriosis+mimics+human+phenotype+and+reveals+insights+into+the+inflammatory+contribution+of+shed+endometrium.">A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium.</a> Am J Pathol. 184 (7), 1930-1939 (2014).</li><li>Pierro, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+interactions+modulate+estrogen+responsiveness+in+normal+human+endometrium.">Stromal-epithelial interactions modulate estrogen responsiveness in normal human endometrium.</a> Biol Reprod. 64 (3), 831-838 (2001).</li><li>Kim, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone-dependent+release+of+transforming+growth+factor-beta1+from+epithelial+cells+enhances+the+endometrial+decidualization+by+turning+on+the+Smad+signalling+in+stromal+cells.">Progesterone-dependent release of transforming growth factor-beta1 from epithelial cells enhances the endometrial decidualization by turning on the Smad signalling in stromal cells.</a> Mol Hum Reprod. 11 (11), 801-808 (2005).</li><li>Chen, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coculturing+human+endometrial+epithelial+cells+and+stromal+fibroblasts+alters+cell-specific+gene+expression+and+cytokine+production.">Coculturing human endometrial epithelial cells and stromal fibroblasts alters cell-specific gene expression and cytokine production.</a> Fertil Steril. 100 (4), 1132-1143 (2013).</li><li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact.">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> J Vis Exp. (113), (2016).</li><li>Arnold, J. T., Kaufman, D. G., Seppala, M., Lessey, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometrial+stromal+cells+regulate+epithelial+cell+growth+in+vitro:+a+new+co-culture+model.">Endometrial stromal cells regulate epithelial cell growth in vitro: a new co-culture model.</a> Hum Reprod. 16 (5), 836-845 (2001).</li><li>Park, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+well-defined+in+vitro+three-dimensional+culture+of+human+endometrium+and+its+applicability+to+endometrial+cancer+invasion.">A well-defined in vitro three-dimensional culture of human endometrium and its applicability to endometrial cancer invasion.</a> Cancer Lett. 195 (2), 185-192 (2003).</li></ol>

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Decidualization er progesteron-avhengige differensiering av endometrial stromal celler til runde som utskiller uterusslimhinneceller. I human, forekommer denne fremgangsmåte spontant i lutealfasen av menstruasjonssyklusen og startes i stromale celler som omgir de vaskulære celler til å danne predecidua. Men i gnagere, er tilstedeværelsen av en blastocyst er viktig å indusere decidualization. Det faktum at decidualization oppstår bare etter kontakt med endometrial epitelceller innebærer at viktige faktorer er utskilt av epitelcellene å indusere decidualization i den underliggende stroma. Selv om denne forskjellen i initieringen av den decidualization prosessen bør bli anerkjent det faktum at menneskelige decidualization blir mer robust ved embryoimplantasjonen tyder på at lignende mekanismer kan være involvert. In vitro cellekulturer blir ofte brukt for å studere effekten av spesifikke molekyler under prosessen med decidualization.Likevel er tilgjengelighet og mengden av menneskelig vev som kan samles ofte begrenset og ledsaget av variasjoner, f.eks syklus fase, antall graviditeter og tilstedeværelse av gynekologiske sykdommer som endometriose eller adenomyosis. Mange av disse problemer kan forebygges ved anvendelse av muse-vev som er lett tilgjengelig og syklusen fase uavhengig. En annen sterk fordel med å bruke mus vev er muligheten til å bruke genmodifiserte gnagere og muligheten for å sette opp et stort antall forsøk. I øyeblikket, har mange forskjellige isoleringsmetoder er beskrevet i litteraturen med høy variabilitet i en alder av dyrene, og den periode i estrus fase ved tidspunktet for bruk. Denne studien viser en ny metode for primær endometrial ko-kulturer av stromale og epiteliale celler i hvilke fordel ble tatt fra et standardisert brunst ved en daglig injeksjon av østrogen forutgående isolering. Videre er østrogen known å indusere spredning i epitelceller og stromale celler som ytterligere øker utbyttet per isolasjon. Isoleringen protokoll beskrevet i dette papiret var basert på Grant et al. 7 har imidlertid flere optimaliseringstrinn ble inkludert for å øke utbyttet, renhet, og levedyktigheten til de forskjellige cellekulturer. Først HBSS ble alltid supplert med antibiotika for å unngå forurensning av den primære kultur. Under isolering av MEEC, ble en temperatur tilpasning gjort (15 minutter ved 37 ° C) for å øke uttaket av epitelceller i løpet av den første fordøyelsen. Deretter en ytterligere trinn ble inkludert for å dempe enzymatisk aktivitet etter trypsin-spaltning ved tilsetning av medium inneholdende FBS for å inhibere dets aktivitet. Videre MEECs ble ført gjennom et filter hvor mesh var større enn det som vanligvis er beskrevet (100 um) som de ofte kommer i grupper og celle ark. Videre forurensning av stromale celler ble redusert ved å utføre en tilleggsitional trinn der MEECs og MESCs ble separert basert på gravitasjon sedimentering. Til slutt, MEECs ble sådd på kollagen-belagte dekkglass for å øke bindingen av celler til dekkglass, slik det ble klart at festing til ubelagte eller PLL-belagte dekkglass var utilstrekkelig. Under isolering av MESCs, ble kollagenase (1 mg / ml) tilsatt for å forbedre fordøyelsen. Videre ble denne digereringstrinnet utført i duplikat for å unngå forurensning av gjenværende MEECs. Alle disse trinnene resulterte i rene og levedyktige kulturer av homogene cellepopulasjoner. Renheten av cellepopulasjonen ble evaluert med farging og QRT-PCR ved vimentin som en markør og stromal cytokeratin som en epitelial markør. Åpenbart ble en motsatt uttrykk mønster av vimentin og cytokeratin observert i MEEC og Mesc. Imidlertid kan det bli lagt merke til at den relative mRNA-ekspresjon av vimentin og cytokeratin er lik i MEEC kulturer. similar resultatene er publisert av andre forskningsgrupper, der epitelceller i kultur erverve vimentin uttrykk ni. Mer viktig er forskjellen på protein uttrykk mellom vimentin og cytokeratin som ble observert i immunohistologiske stainings av de ulike cellepopulasjoner. Dobbelt farging viste at EECS var positive for cytokeratin og ESC var positive for vimentin. Bruken av disse markørene i immunfarging er en etablert metode og standardly brukt for å indikere de celletyper 10. Selv om en rekke undersøkelser er blitt utført på decidualization av Mesc, er det fortsatt mulig at tilstedeværelsen av epitel-celler i denne modellen kan endre resultatene av decidualization. For det første har det vist seg at hvis MEEC vokse til et monolag i nærvær av Mesc-kondisjonert medium eller i et ko-kultur omgivelser, har en forbedret monolaget epitelcelle transepitelial elektrisk motstand (Teer), som følge av faktorer som utskilles av Mesc 7. Videre Pierro et al. 11 gitt bevis for at epitelproliferasjon, påvirket av 17β-østradiol, kan være mediert av faktorer utskilt fra stromale celler, og alternativt kan epitelceller frigi faktorer som modulerer stromal decidualization 12, 13. Samlet sett er det klart at epitel-stromal co-kultur miljø gir en mer fysiologisk situasjon som gjør det mulig for parakrint samhandling og kommunikasjon. Fremgangsmåten for dyrking av to ulike celletyper ved hjelp av et innsats ko-kultursystem ble beskrevet tidligere i 14, 15 og er tilpasset for bruk av murine primære celler. Ved påvisning av prolaktin mRNA nivåer som en lese-out for decidualization har beskrevet teknikken en svært reproduserbar avlesing for decidualization tilgjengelig og tillates derved studiet av epitel-stromal forhold under decidualization. Parakrine signaler mediert fra MEEC kan forandre graden av decidualization i de stromale celler. Videre tillater den modell for spesifikke modulering av epiteliale side uten direkte å påvirke de stromale celler. Derfor denne co-kultur MEEC og Mesc tilbyr et perfekt verktøy for å evaluere effekten av hormoner, cytokiner, etc. på epitelceller med lese-out på stromal decidualization. En annen fordel med denne ko-kultursystem er at det gjør det mulig for forskere å undersøke involveringen av et spesifikt protein i decidualization-prosess i enten epitelisk eller stromal rommet ved hjelp av celler isolert fra transgene dyr. Videre vil denne teknikken være svært nyttig for å undersøke blastocyst adhesjon for å vurdere hvorvidt parakrine faktorer utskilt av epitel-celler i nærvær av en blastocyst er tilstrekkelig til å indusere decidualization av den underliggende stromalceller. Et viktig skritt i trophoblast invasjon korrelert til ekstracellulære matrise nedbrytning, som er mediert av handlingen av proteolytiske enzymer. Den foreslåtte teknikk kan anvendes som en in vitro modell for å undersøke den krysstale mellom blastocyst, epitelcellene og støtter stroma. Men i øyeblikket er lite kjent om opprinnelsen av epitelceller som kan være så vel luminal som kjertel. Derfor er ytterligere karakterisering av den genetiske og molekylære profil av epitelcellene nødvendig. I tillegg er det beskrevet fremgangsmåten begrenset i tilgjengelig kunnskap om polarisasjonen av epitelcellene. For øyeblikket, ble polarisasjonen av epitelceller ikke tatt hensyn til. Imidlertid forskjeller i ekspresjon av membranproteiner er beskrevet i apikale og basalmembraner. Upassende polarisering av epitel lag kan ha en innvirkning på parakrint samspillet mellom epithelial og stromale celler. Imidlertid, fremgangsmåter for å oppnå polariserte epitelceller er blitt beskrevet, og kan være inkludert i den beskrevne teknikk 15, 16. Samlet foreslår beskrevet protokollen en teknikk for å kunne etablere primære cellekulturer av mus livmor epitel og stromale celler. Denne teknikken resulterer i rene cellekulturer som bekreftes av QRT-PCR og farging av vimentin og cytokeratin. Til slutt, ble en epitelisk og stromal ko-kultur innføres som gjør det mulig for undersøkelse av parakrine signaler mediert ved enten MEEC og / eller Mesc i decidualization prosessen.

Den menneskelige endometrium er indre foring av livmor og gjennomgår månedlige sykluser av sammenbrudd og reparasjon som en forberedelse for mulige graviditeter. Den består av et enkelt lag av epitelceller lining livmor lumen og den underliggende stroma som varierer i tykkelse i henhold til svingninger av eggstokkhormoner østrogen og progesteron. I lutealfasen, vil postovulatory progesteron bølge indusere differensiering av endometrial stromale celler i større, runde uterusslimhinneceller, en prosess som kalles decidualization 1, 2. I human skjer dette fenomenet spontant å danne predecidua, men blir mer uttalt ved embryo implantasjon. En funksjonell følge av decidualization er at livmoren forbigående blir mottakelig for embryo implantasjon. Dette intervallet er merket som &quot;vindu implantasjon &#39;. I den første perioden av embryoimplantasjonen, den decidualized endometrial stromale celler som omgir den implantere embryo vil gi en barriere for å hindre passasje av skadelige stoffer til embryoet 3. Under svangerskapet, vil dette decidua gi næring til fosteret før placentation har funnet sted, og vil senere danne mors del av morkaken 4. Etiske og praktiske hensyn begrenser utformingen av humane studier for å undersøke prosessen med decidualization og har ført til bruk av dyremodeller. Å være medlem av hemochorial placentation gruppen, vil endometrium av gnagere også gjennomgå decidualization før placentation 5. I gnagere, men initieringen av decidualization prosessen avhenger av tilstedeværelsen av blastocyster i livmor lumen, som indikerer at en ekstra stimulus er nødvendig for å utløse responser Deciduale 6. Dette innebærer en intrikat kommunikasjon mellom the endometrial epitelceller som ikke har direkte kontakt med den blastocyst, og de underliggende stromale celler. Likevel kan decidualization være kunstig indusert ved hjelp av stimuli som mekanisk skrape eller drypping av olje i et hormonelt primet livmor. Selv om in vivo studier med kunstige decidualization modeller har tillatt oss å forbedre våre innsikt i det komplekse signal prosessen med decidualization, mekanistiske fordypning, for eksempel undersøkelse av uunnværlig kommunikasjon mellom epitel og stromale celler, er begrenset. Derfor kan in vitro decidualization studier brukes til å manipulere viktige stier og studere fundamentale prosesser. For å oppnå dette, kan primær endometriale stroma cellekulturer settes opp fra human eller gnager endometrium. Ansette gnagere samtykker bruk av genmodifiserte dyr for å undersøke hvilken rolle et bestemt protein av interesse under decidualization prosessen. Men umoden, prepuberty mus brukes ofte for å unngå komplikasjoner av brunst, mens i andre tilfeller uteri er samlet fra alle faser av brunst, noe som resulterer i en heterogenitet i kulturene. Videre har prosessen med decidualization blitt studert i forskjellige protokoller, for eksempel, ved (i) som utfyller hormoner (østrogen, progesteron eller cyklisk adenosin monofosfat (cAMP)) til dyrkningsmediet, eller ved (ii) isolering av uterusslimhinneceller fra mus ved dag 4,5 av (pseudo) svangerskapet, noe som krever ekstra behov for plug kontroll og vasectomized menn. Disse begrensningene demonstrere nødvendigheten av en standardisert metode for å studere in vitro decidualization. I denne studien til en fysiologisk modell undersøke in vitro decidualization fra voksen, vil ikke (pseudo) gravide mus bli presentert. I denne metoden, vil daglig injeksjon av 17β-østradiol (E2) indusere proliferasjon av celler endometrial, noe som resulterer i et økt utbytte av homogent og pure celle populasjoner. Videre tillater bruk av et system coculturing studiet av epitel-stromal krysstale og evne til å manipulere prosessen med decidualization på ulike nivåer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ThinCert Tissue culture insert for 24 well plates; 1 &#181;m pore size; transparant</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662610</td>
			<td>Inserts are also provided for other multiwell plates and/or other pore sizes. Other suppliers: Merck Millipore. 
			https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0110_0110_0090_0030/13408/&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Cell culture treated 24 well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td> http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Bromoadenosine 3&#8242;,5&#8242;-cyclic monophosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B7880</td>
			<td>Prepare a stock solution of 100 mM in Milli Q water. Store aliquots at -20 &#176;C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medroxyprogesterone 17-acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1629</td>
			<td>Prepare a stock solution of 250 &#181;M in ethanol. Store aliquots at -20 &#176;C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arachis oil</td>
			<td>Supermarket</td>
			<td></td>
			<td>Standard cooking arachis oil that can be found in every supermarket is used </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrestoBlue cell viability reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A13261</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 1x, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-046</td>
			<td>Store in fridge as long as possible. Use cold HBSS+ during the protocol. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17-&#946; Estradiol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E8875</td>
			<td>Prepare a stock solution of 1mg/ml in EtOH before diluting in arachis oil (1:1000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell medium filter Stericup, 0.22 &#181;m, polyethersulfone, 500 mL, radio-sterilized</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td> http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063&#160;&#160;&#160;&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12, phenol red, L-glutamine, HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-056</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290-018</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50mg/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-037</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5921</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB-105</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6395</td>
			<td>Dilute in Milli Q water, adjust pH to 7 with NaOH and filter before use. Store in the dark. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1882</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, glass, 18 mm &#216;</td>
			<td>Glaswarenfabrik Karl Hecht</td>
			<td>1001/18</td>
			<td> http://www.hecht-assistent.de/187/?L=1&#38;tx_rmproducts_pi1[g]=937&#38;tx_rmproducts_pi1[p]=3504&#38;tx_rmproducts_pi1[v]=20088&#38;cHash=abd12065683fe74b00eaa5e562824d06&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IA from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2674</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7409</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Warm to room temperature before use. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 40 &#181;m mesh, disposable</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td> https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 100 &#181;m mesh, disposable</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td> https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22&#160;&#181;m, polyethersulfone, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td> https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial) 100%</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.00063</td>
			<td> https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>354236</td>
			<td>From rat tail. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=&#38;productid=354236%28Lifesciences%29#&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancreatin from porcine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3292</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td> https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. analytical reagent</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821296</td>
			<td> https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal rabbit anti-human vimentin (D21H3)&#160;</td>
			<td>Cell Signalling Tech</td>
			<td>#5741</td>
			<td>use 1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal mouse anti-human pan cytokeratin&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2562</td>
			<td>use 1/1000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td> http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en&#38;region=BE&#38;gclid=Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIwBEiQAI8rq879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k8P8HAQ&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td> http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488&#38;resultPage=1&#38;resultsPerPage=15&#38;autocomplete=&#38;searchMode=keyword&#38;productTypeSelect=antibody&#38;targetTypeSelect=antibody_secondary&#38;species=ltechall&#38;keyword=488#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;;conjugates:^\%22Alexa%20Fluor&#38;reg;%20488\%22$;; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td> http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594&#38;resultPage=1&#38;resultsPerPage=15&#38;autocomplete=&#38;priorSearchTerms=&#38;searchMode=keyword&#38;productTypeSelect=antibody&#38;targetTypeSelect=antibody_secondary&#38;species=ltechall&#38;keyword=594#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Mus%20musculus\%22$;;&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td> http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, with calcium and magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040174</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133&#160; </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization

Decidualization er et progesteron-avhengig differensiering av endometrial stromale celler og er en forutsetning for vellykket implantasjon embryo. Selv om mange forsøk har vært gjort for å vise de underliggende mekanismene for decidualization, forblir s signalering mellom epitelcellene som er i berøring med embryoet og de underliggende stromale celler dårlig forstått. Derfor studerer decidualization på en måte som tar både epiteliale og stromale celler i betraktning kan forbedre vår kunnskap om de molekylære detaljene decidualization. For dette formål in vivo-modeller av kunstig decidualization er fysiologisk de mest relevante; imidlertid, er manipulering av intercellulær kommunikasjon er begrenset. For tiden, in vitro kulturer av endometrial stromale celler blir brukt til å undersøke modulering av decidualization av flere signaliseringsmolekyler. Konvensjonelt, humane eller mus endometriale stromale celler eranvendes. Imidlertid er tilgjengeligheten av humane prøver veldig ofte begrenset. Videre er bruken av murine vev sammen med variasjon i fremgangsmåten i dyrkning. Denne studien presenterer en validert og standardisert metode for å skaffe rent Livmor epitelceller (EEC) og stromal Cell (ESC) kulturer som bruker voksne intakte mus behandlet med østrogen i tre påfølgende dager. Protokollen er optimalisert for å forbedre utbyttet, levedyktighet og renhet av cellene og ble ytterligere utvidet for å studere decidualization i en coculture av EEC og ESC. Denne modellen kan være egnet til å utnytte betydningen av begge celletyper i decidualization og å vurdere bidraget av betydelige signalmolekyler skilles ut av EEC eller ESC under interkommunikasjon.

Generell oversikt protokoll Figur 1A illustrerer en generell oversikt over protokollen. En daglig injeksjon av E2 (100 ng) i tre påfølgende dager ble brukt til å synkronisere dyrene og standardisere fasen av brunst. Østrogensyklusen kan vurderes ved vaginal LAVAGES og er delt inn i proestrus, estrus, diestrus, og metestrus fase. Syklusen fasen kan bli utpekt i henhold til forholdet av desquamated celler i utskylling, som er utsatt for hormonelle endringer. Økende nivåer av østrogen vil gjøre dyrene utvikle seg til estrus fase. Denne fasen kan lett påvises ved nærvær av utelukkende forhornede epitelceller og fraværet av leukocytter (figur 1B). På dag 4, blir uteri av dyr som er i estrus fase samles og MEEC og Mesc er isolert (figur 1C). Decidualization cen fremkalles ved tilsetning av 0,5 mM cAMP og 1 uM MPA til 2% FBS medium i løpet av en inkubasjonsperiode på 5 d. Kvalitetskontroll av MEEC og Mesc kulturer Renheten av de primære cellekulturer kan vurderes ved forskjellen i vimentin og cytokeratin uttrykk. Vimentin er en mellomliggende glødetråd som er uttrykt i mesenchymale celler, derav i den endometriale stromale celler. Cytokeratin er et mellomliggende filament funnet i cytoskjelettet av epitelvev. Figur 2A viser mRNA uttrykk nivå vimentin og cytokeratin i MEEC og Mesc vurdert ved hjelp QRT-PCR. Vimentin nivåene er høye i Mesc og lav i MEEC (2,2x høyere, p &lt;0,001), mens cytokeratin nivåene er høye i MEEC og lav i Mesc (36x høyere, p &lt;0,001). En vimentin / cytokeratin dobbel farging ble utført og indikerte at stromale celler uttrykker vimentin mens epithelial celler uttrykker cytokeratin (figur 2B, C). Fravær av primært antistoff ble anvendt som en negativ kontroll for farging (figur 2D, E). Disse immunohistologiske stainings viser at begge endometriale cellekulturer (MEEC og Mesc) har en renhet på opp til 90%. Decidualization i MEEC / Mesc Cocultures Etter isolering ble mus endometrial og stromale celler sådd ut i en ko-kultursystem for å etterligne den endometrial miljø. Celler ble dyrket inntil epitelcellene dannes et monolag i cellekulturinnsatsen (teer-verdier på 800 - 1000 / brønn), og stromale celler nådde en sub-konfluent tilstand. Decidualization ble indusert i de stromale celler med anvendelse av 0,5 mM cAMP og 1 pM MPA. Etter fem dagers inkubasjon, ble prolaktin-mRNA-nivåer vurdert i de stromale celler ved QRT-PCR som en indikasjon for decidualization (figur 3A). Prolaktinnivåer ble sterkt uttrykt i celler utsatt for hormoner og ikke detekterbare i celler inkubert med kontrollmediet (p &lt;0,01). Siden epitelceller er vanskelig å visualisere inne i cellekultur innsatser, ble en levedyktighet assay utføres umiddelbart etter fem dager lange inkubasjonsperioden (figur 3B). En blanding av normal vekstmedium og en levedyktighet reagens ble tilsatt til brønnene og inkubert i en periode på minimal 8-12 timer. Fargen skiftet fra blått til rosa lys indikerte tilstedeværelse av levedyktige epitelceller. Legg merke til at fargen skiftet vil bare forekomme når levedyktige celler er tilstede. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig1.jpg" /> Figur 1: Generell oversikt av protokollen. (A) Reaksjonsskjema av isolasjonsprotokoll som starter med tresammenhengende dager med østrogen injeksjoner. På dag tre, bør de nødvendige forberedelser være forberedt. På dag fire, er estrus fase evalueres (indikert med stjerne) ved å utføre en vaginal kylling. Mesc og MEEC er isolert ved hjelp av ulike fordøyelsen trinn. På dag 6, eller når cellene er konfluente, decidualization kan induseres i ko-kultursystem ved tilsetning av cAMP og MPA til mediet og en inkubasjonstid på fem dager (dag 6 - 11). (B) representativt bilde av estrus fase kjennetegnes ved tilstedeværelse av forhornede epitelceller i vaginal utskylling (forstørrelse 10X). (C) representativt bilde av Mesc og MEEC (forstørrelse 20X, skala bar: 100 mikrometer). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig2.jpg" /> <strong&gt; Figur 2: Farging og kvantitativ RT-PCR for vimentin og Cytokeratin i MEEC og Mesc. (A) Messenger-RNA-nivåer av vimentin og cytokeratin uttrykk for å indikere renheten av kulturene. RNA-nivåer ble relativt kvantifisert til geometrisk gjennomsnitt av husholdningsgener ACTB og TBP. Data ble vist som gjennomsnitt ± SEM. Vimentin / cytokeratin dobbel flekker på Mesc kulturer (B) og MEEC kulturer (C). Sett i venstre viser en 63X forstørrelse visning. Negativ kontroll med primært antistoff utelatt for Mesc (D) og MEEC (E) (Skala: 50 um). ***: P &lt;0,001 med Toveis ANOVA med Bonferroni korreksjon for multippel testing. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> Figur 3: Validering av Decidualization via RT-PCR. (A) mRNA-nivåene av prolaktin ekspresjon i stromale celler for å evaluere decidualization. RNA-nivåer ble relativt kvantifisert til geometrisk gjennomsnitt av husholdningsgener PGK1 og TBP. Den ganger endring i celler dyrket i kontrollmedium eller decidual er vist som gjennomsnitt ± SEM. (B) Illustrerende bilder av stromale celler før (øverst) og etter (nederst) decidualization stimulans. Innsatsen til høyre viser en forstørrelse av en decidualized stromal celle. Decidualization er karakterisert ved tilstedeværelsen av flerkjernede celler, angitt med sorte piler. (C) Representative bilder av vurderingen av epiteliale cellelevedyktighet i innsatsen etter analysen. Bilder ble tatt umiddelbart etter administrering av levedyktigheten reagens (Prestoblue) (0 h) og following morgen (ON). **: P &lt;0,01 med Mann-Whitney U-test. ON: natten. Skala: 100 mikrometer. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization at JoVE.com

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Denne studien viser en standardisert og validert metode for isolering og kultur av primær endometrial mus stromale og epiteliale celler, som kan brukes i et coculture system for å studere in vitro decidualization.

Isolering av Mouse Livmor Epithelial og stromale celler for<em&gt; In Vitro</em&gt; Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Isolasjon og berikelse av menneskelige Adipose-avledet stromalceller for Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolasjon og utvidelse av Mesenchymale Stem / stromal celler avledet fra human placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Rapid Isolering av BMPR-IB + adipose-avledet stromale celler for bruk i en Calvarial Defect Healing Model

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Isolering og karakterisering av Mesenchymale stromale celler fra human navlestreng og Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Veksten av musen Preantral follikler Under simulert mikrogravitasjon

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolasjon, kultur og differensiering av benmarg Stromal celler og Osteoclast Progenitors fra mus

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

Isolering og karakterisering av Cardiac Mesenchymal Stromal celler fra Endomyocardial Bioptic prøver av Arrhythmogenic kardiomyopati pasienter

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolering av Endometrial Stromal menneskeceller for In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generering av flercellede Human Primary livmor Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...