Name: isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization
Uploaded: 2017-03-02T13:00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами Исследовательского Фонда Фландрии (FWO G.0856.13N) и Научно-исследовательского совета KU Leuven (OT / 13/113). KDC финансируется FWO Бельгии. AH финансируется OT / 13/113. Мы хотели бы поблагодарить ячейки изображения основной комплекс из KU Leuven (http://gbiomed.kuleuven.be/english/corefacilities/microscopy/cic/cic.htm) для использования конфокальной микроскопии.

<ol>
	<li>Cummings, A. M., Yochim, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+uterus+in+preparation+for+gestation:+a+model+for+the+action+of+progesterone.">Differentiation of the uterus in preparation for gestation: a model for the action of progesterone.</a> J Theor Biol. 106 (3), 353-374 (1984).</li><li>Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+regulation+of+menstruation.">Endocrine regulation of menstruation.</a> Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).</li><li>Wang, X., Matsumoto, H., Zhao, X., Das, S. K., Paria, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+signals+direct+the+formation+of+tight+junctional+permeability+barrier+in+the+decidualizing+stroma+during+embryo+implantation.">Embryonic signals direct the formation of tight junctional permeability barrier in the decidualizing stroma during embryo implantation.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 1), 53-62 (2004).</li><li>Zygmunt, M., Herr, F., Munstedt, K., Lang, U., Liang, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+and+vasculogenesis+in+pregnancy.">Angiogenesis and vasculogenesis in pregnancy.</a> Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 110 Suppl 1, S10-S18 (2003).</li><li>Power, M. L., Schulkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The evolution of the human placenta. , (2012).</li><li>Finn, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initiation+of+the+decidual+cell+reaction+in+the+uterus+of+the+aged+mouse.">The initiation of the decidual cell reaction in the uterus of the aged mouse.</a> J Reprod Fertil. 11 (3), 423-428 (1966).</li><li>Grant, K. S., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+mouse+uterine+stromal+cells+on+epithelial+cell+transepithelial+resistance+(TER)+and+TNFalpha+and+TGFbeta+release+in+culture.">Effect of mouse uterine stromal cells on epithelial cell transepithelial resistance (TER) and TNFalpha and TGFbeta release in culture.</a> Biol Reprod. 69 (3), 1091-1098 (2003).</li><li>De Clercq, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+transient+receptor+potential+channels+in+human+endometrial+stromal+cells+during+the+luteal+phase+of+the+menstrual+cycle.">Functional expression of transient receptor potential channels in human endometrial stromal cells during the luteal phase of the menstrual cycle.</a> Hum Reprod. 30 (6), 1421-1436 (2015).</li><li>Pieper, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vimentin+expression+in+cultured+epithelial+cells.">Regulation of vimentin expression in cultured epithelial cells.</a> Eur J Biochem. 210 (2), 509-519 (1992).</li><li>Greaves, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+of+endometriosis+mimics+human+phenotype+and+reveals+insights+into+the+inflammatory+contribution+of+shed+endometrium.">A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium.</a> Am J Pathol. 184 (7), 1930-1939 (2014).</li><li>Pierro, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+interactions+modulate+estrogen+responsiveness+in+normal+human+endometrium.">Stromal-epithelial interactions modulate estrogen responsiveness in normal human endometrium.</a> Biol Reprod. 64 (3), 831-838 (2001).</li><li>Kim, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone-dependent+release+of+transforming+growth+factor-beta1+from+epithelial+cells+enhances+the+endometrial+decidualization+by+turning+on+the+Smad+signalling+in+stromal+cells.">Progesterone-dependent release of transforming growth factor-beta1 from epithelial cells enhances the endometrial decidualization by turning on the Smad signalling in stromal cells.</a> Mol Hum Reprod. 11 (11), 801-808 (2005).</li><li>Chen, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coculturing+human+endometrial+epithelial+cells+and+stromal+fibroblasts+alters+cell-specific+gene+expression+and+cytokine+production.">Coculturing human endometrial epithelial cells and stromal fibroblasts alters cell-specific gene expression and cytokine production.</a> Fertil Steril. 100 (4), 1132-1143 (2013).</li><li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact.">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> J Vis Exp. (113), (2016).</li><li>Arnold, J. T., Kaufman, D. G., Seppala, M., Lessey, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometrial+stromal+cells+regulate+epithelial+cell+growth+in+vitro:+a+new+co-culture+model.">Endometrial stromal cells regulate epithelial cell growth in vitro: a new co-culture model.</a> Hum Reprod. 16 (5), 836-845 (2001).</li><li>Park, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+well-defined+in+vitro+three-dimensional+culture+of+human+endometrium+and+its+applicability+to+endometrial+cancer+invasion.">A well-defined in vitro three-dimensional culture of human endometrium and its applicability to endometrial cancer invasion.</a> Cancer Lett. 195 (2), 185-192 (2003).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Decidualization является прогестерон-зависимой дифференцировки эндометриальных стромальных клеток в круглые секретирующие децидуальных клеток. У человека этот процесс происходит спонтанно в течение лютеиновой фазы менструального цикла и инициируют в стромальных клетках, окружающих клетки сосудов с образованием predecidua. Тем не менее, у грызунов, наличие бластоцисты крайне важно, чтобы побудить decidualization. Тот факт, что decidualization происходит только после контакта с эндометриальных эпителиальных клеток подразумевает, что важные факторы, которые секретируются эпителиальными клетками, чтобы вызвать decidualization в нижележащей стромой. Хотя эта разница в начале процесса decidualization следует признать тот факт, что человек decidualization становится более устойчивым при имплантации эмбриона позволяет предположить, что подобные механизмы могут быть вовлечены. В пробирке клеточных культур часто используются для изучения влияния специфических молекул в процессе decidualization.Тем не менее, наличие и количество человеческих тканей , которые могут быть собраны часто ограничено и сопровождается изменениями, например, фазы цикла, количество беременностей и наличие гинекологических заболеваний , как эндометриоз или аденомиоз. Многие из этих проблем могут быть предотвращены использованием мышиной ткани, который легко доступен и фазы цикла независимы. Другим сильным преимуществом использования мышиной ткани является возможность использовать генетически модифицированные грызуны и возможность установки большого количества экспериментов. На данный момент, множество различных протоколов изоляции, были описаны в литературе, с высокой изменчивостью в возрасте животных и период течки в фазе в момент использования. Это исследование представляет новый метод первичного эндометрия сопутствующих культур стромальных и эпителиальных клеток, в которых преимущество было принято стандартизированного эстрального цикла путем ежедневной инъекции эстрогена предварительного выделения. Кроме того, эстроген кNown индуцировать пролиферацию эпителиальных и стромальных клеток, которые дополнительно увеличивает выход за изоляцию. Протокол изолирования , описанный в этой статье , был основан на Грант и др. 7, тем не менее, были включены дополнительные шаги по оптимизации , чтобы увеличить выход, чистота и жизнеспособности различных клеточных культур. Во-первых, HBSS всегда была дополнена с антибиотиками, чтобы избежать загрязнения первичной культуры. Во время выделения MEEC, адаптация температуры было сделано (15 мин при 37 ° С), чтобы увеличить урожай эпителиальных клеток в течение первого пищеварения. Далее, дополнительный шаг был включен к отпускной ферментативную активность после того, как трипсин-переваривание добавлением среды, содержащей FBS, чтобы ингибировать его активность. Кроме того, MEECs пропускали через фильтр из которых сетка была больше, чем то, что обычно описывается (100 мкм), так как они часто приходят в кластерах и клеточных листов. Кроме того, загрязнение стромальных клеток была уменьшена путем выполнения надстройкиitional этап, на котором MEECs и MESCs были отделены друг от друга на основе гравитационного осаждения. И, наконец, MEECs высевали на коллаген покрытием покровные увеличить присоединение клеток к покровные стекла, как стало ясно, что привязанность к непокрытыми или ФАПЧ покрытием покровные стекла была недостаточной. Во время изоляции MESCs, коллагеназы (1 мг / мл), дополненной для улучшения пищеварения. Кроме того, этот шаг ферментацию проводили в двух экземплярах, чтобы избежать загрязнения оставшихся MEECs. Все эти дополнительные шаги привели в чистых и жизнеспособных культур популяций однородных клеток. Чистота популяции клеток оценивали с иммунное и QRT-ПЦР с использованием в качестве виментин стромы маркера и цитокератином как эпителиальный маркера. Очевидно, что наблюдалась противоположная картина экспрессии виментину и цитокератином в MEEC и MESC. Тем не менее, можно заметить, что относительное экспрессии мРНК виментину и цитокератином похож на MEEC культурах. SimilРезультаты А.Р. публикуются другими исследовательскими группами, в которых эпителиальные клетки в выражении виментина культуры приобретают 9. Более важным является различие в экспрессии белка между виментину и цитокератином, как наблюдалось в иммуногистологических окрашиванием различных клеточных популяций. Двойной иммунное показал, что ОЦОД были положительными для цитокератином и ESC были положительными для виментину. Использование этих маркеров в иммунное окрашивание является признанным методом и Стандартно используется для указания типов элементов 10. Хотя много исследований было выполнено на decidualization мЭСК, остается возможным, что присутствие эпителиальных клеток в этой модели может изменить результаты decidualization. Во-первых, было показано, что если MEEC растут на монослой в присутствии МЕСК-кондиционированной среды или в условиях совместного культивирования монослой имеет улучшенную эпителиальные клетки трансэпителиального электрического сопротивления (TEER), в результате чего из факторов , секретируемых MESC 7. К тому же , Пьерро и др. 11 при условии доказательства того, что эпителиальной пролиферации, под влиянием эстрадиола-17 &amp; beta ; , возможно , опосредована факторами , секретируемыми из стромальных клеток, а также в качестве альтернативы, эпителиальные клетки могут выделять факторы , которые модулируют стромы decidualization 12, 13. В целом, очевидно, что окружающая среда сокультуры эпителиально-стромальных обеспечивает более физиологическую ситуацию, которая позволяет паракринной взаимодействия и коммуникации. Способ культивирования двух различных типов клеток с использованием системы сокультивирования вставки была описана ранее 14, 15 и был адаптирован для использования мышиных первичных клеток. Путем выявления уровня мРНК пролактина как считыванием для decidualization, описанный метод имеет очень воспроизводимые считывание для decidualization доступны и позволяютS, таким образом, изучение эпителиально-стромальных взаимоотношений во время decidualization. ПАРАКРИННОЙ сигналы, опосредованные от MEEC может изменить степень decidualization в стромальных клетках. Кроме того, модель позволяет специфической модуляции эпителиальной стороне, не влияя непосредственно стромальных клеток. Поэтому, это совместное культивирование MEEC и MESC предлагает идеальный инструмент для оценки влияния гормонов, цитокинов и т.д. на эпителиальных клетках с считыванием на стромальных decidualization. Другим преимуществом этой системы сокультуры является то, что она позволяет ученым исследовать причастность конкретного белка в decidualization-процесса либо в эпителиальные или стромы отсека с использованием клеток, выделенных из трансгенных животных. Кроме того, этот метод будет очень полезным для изучения адгезии бластоцисты, чтобы оценить ли факторы паракринные секретируемые эпителиальными клетками в присутствии бластоцисты достаточны, чтобы вызвать decidualization нижележащего стромальныхклетки. Важным шагом в трофобласта вторжения коррелирует с внеклеточной деградации матрицы, которая опосредуется действием протеолитических ферментов. Предложенный метод может быть применен в качестве модели в пробирке для исследования перекрестных помех между бластоцисты, эпителиальных клеток и поддерживающей стромы. Тем не менее, на данный момент мало известно о происхождении эпителиальных клеток, которые могут быть так же, как просветная железистые. Таким образом, дальнейшая характеристика генетического и молекулярного профиля эпителиальных клеток требуется. Кроме того, описанный способ ограничен в имеющихся знаний о поляризации эпителиальных клеток. На данный момент, поляризация эпителиальных клеток не было принято во внимание. Тем не менее, различия в экспрессии мембранных белков описаны в апикальных и базальных мембран. Неуместный поляризация эпителиального слоя может оказать влияние на паракринной взаимодействия между epitheliи др клетки стромы. Тем не менее, способы получения поляризованных эпителиальных клеток было описано и могут быть включены в описанной методике 15, 16. В целом, описанный протокол предлагает технологию для успешного создания первичных культур клеток мышиного внутриматочной эпителиальные и стромальные клетки. Этот метод приводит в чистых культурах клеток, что подтверждается QRT-PCR и иммунное виментину и цитокератином. В конечном счете, эпителиальной и стромальных совместно культуры была введена, что позволяет для исследования паракриновых сигналов, опосредованных либо MEEC и / или MESC в процессе decidualization.

Человек эндометрий внутренней оболочки матки и проходит ежемесячные циклы пробоя и ремонта в качестве подготовки к возможной беременности. Он состоит из одного слоя эпителиальных клеток, выстилающих маточные люмена и основной стромы, который изменяется по толщине в зависимости от колебаний гормонов яичника эстрогена и прогестерона. Во время лютеиновой фазы, постовуляторной прогестерон всплеск будет индукции дифференцировки клеток эндометрия стромальных в более крупные, круглые децидуальных клеток, процесс , называемый decidualization 1, 2. У человека, это явление происходит спонтанно формировать predecidua, но становится более выраженным при имплантации эмбриона. Функциональная следствием decidualization является то, что матка скоротечно становится восприимчивым к имплантации эмбриона. Этот интервал обозначен как «окна имплантации». В ранний период имплантации эмбриона, тем decidualized еndometrial стромальные клетки , окружающие имплантацию эмбриона обеспечит барьер для предотвращения прохождения вредных веществ к зародышу 3. Во время беременности, это децидуальная обеспечит питательные вещества для развивающегося плода , прежде чем плацентацией произошло, и позже образуют материнскую часть плаценты 4. Этические и практические соображения ограничивают конструкцию человеческих исследований, чтобы исследовать процесс decidualization и побудили использование животных моделей. Будучи членом hemochorial плацентацией группы, эндометрий грызунов также претерпит decidualization до начала плацентацией 5. У грызунов, тем не менее, начало процесса decidualization зависит от наличия бластоцист в маточной полости, что свидетельствует о том , что дополнительный стимул необходимо вызвать децидуальной реакции 6. Это предполагает сложную связь между гое внутриматочные эпителиальные клетки, которые имеют непосредственный контакт с бластоцисты, а также лежащие в их основе стромальных клеток. Тем не менее, decidualization может быть искусственно с помощью стимулов, как механического натирания или закапывания масла в гормонально загрунтованную матки. Хотя исследования в естественных условиях с использованием искусственных моделей decidualization позволили нам улучшить наши идеи в сложном процессе сигнализации decidualization, механистической углубленных исследований, например, исследование непременном связи между эпителиальных и стромальных клеток, ограничены. Таким образом, в пробирке исследования decidualization могут быть использованы для манипулирования важных путей и изучать фундаментальные процессы. С этой целью, первичные внутриматочные культуры стромальных клеток могут быть созданы из человека или грызуна эндометрии. Использование грызунами соглашается с использованием генетически модифицированных животных с целью изучения роли конкретного интересующего белка в процессе decidualization. Тем не менее, незрелые, prepuberти мышей часто используются для того, чтобы избежать осложнений эстрального цикла, в то время как в других случаях Матки собраны из всех фаз эстрального цикла, что приводит к неоднородности в культурах. Кроме того, процесс decidualization был изучен в различных протоколах, например, по формуле (I) , дополняющих гормоны (эстроген, прогестерон или циклического аденозинмонофосфата (цАМФ)) в культуральной среде, либо (II) выделение децидуальными клеток от мышей в день 4.5 (псевдо) беременности, которые требуют дополнительной необходимости проверки зажигания и вазэктомии мужчин. Эти ограничения показывают необходимость стандартизированного метода для изучения в лабораторных условиях decidualization. В этом исследовании, физиологическая модель для изучения decidualization в пробирке , начиная с взрослого, будут представлены не являющиеся (псевдо) беременных мышей. В этом методе в день инъекции 17 &amp; beta; эстрадиола (Е2) будет индуцировать пролиферацию клеток эндометрия, что приводит к увеличению выхода гомогенной и рпопуляции клеток Юр. Кроме того, использование системы сокультивировани позволяет изучение эпителиального-стромальных перекрестных помех и способность манипулировать процесс decidualization на разных уровнях.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ThinCert Tissue culture insert for 24 well plates; 1 &#181;m pore size; transparant</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662610</td>
			<td>Inserts are also provided for other multiwell plates and/or other pore sizes. Other suppliers: Merck Millipore. 
			https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0110_0110_0090_0030/13408/&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Cell culture treated 24 well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td> http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Bromoadenosine 3&#8242;,5&#8242;-cyclic monophosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B7880</td>
			<td>Prepare a stock solution of 100 mM in Milli Q water. Store aliquots at -20 &#176;C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medroxyprogesterone 17-acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1629</td>
			<td>Prepare a stock solution of 250 &#181;M in ethanol. Store aliquots at -20 &#176;C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arachis oil</td>
			<td>Supermarket</td>
			<td></td>
			<td>Standard cooking arachis oil that can be found in every supermarket is used </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrestoBlue cell viability reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A13261</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 1x, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-046</td>
			<td>Store in fridge as long as possible. Use cold HBSS+ during the protocol. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17-&#946; Estradiol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E8875</td>
			<td>Prepare a stock solution of 1mg/ml in EtOH before diluting in arachis oil (1:1000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell medium filter Stericup, 0.22 &#181;m, polyethersulfone, 500 mL, radio-sterilized</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td> http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063&#160;&#160;&#160;&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12, phenol red, L-glutamine, HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-056</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290-018</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50mg/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-037</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5921</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB-105</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6395</td>
			<td>Dilute in Milli Q water, adjust pH to 7 with NaOH and filter before use. Store in the dark. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1882</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, glass, 18 mm &#216;</td>
			<td>Glaswarenfabrik Karl Hecht</td>
			<td>1001/18</td>
			<td> http://www.hecht-assistent.de/187/?L=1&#38;tx_rmproducts_pi1[g]=937&#38;tx_rmproducts_pi1[p]=3504&#38;tx_rmproducts_pi1[v]=20088&#38;cHash=abd12065683fe74b00eaa5e562824d06&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IA from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2674</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7409</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Warm to room temperature before use. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 40 &#181;m mesh, disposable</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td> https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 100 &#181;m mesh, disposable</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td> https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22&#160;&#181;m, polyethersulfone, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td> https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial) 100%</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.00063</td>
			<td> https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>354236</td>
			<td>From rat tail. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=&#38;productid=354236%28Lifesciences%29#&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancreatin from porcine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3292</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td> https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. analytical reagent</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821296</td>
			<td> https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal rabbit anti-human vimentin (D21H3)&#160;</td>
			<td>Cell Signalling Tech</td>
			<td>#5741</td>
			<td>use 1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal mouse anti-human pan cytokeratin&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2562</td>
			<td>use 1/1000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td> http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en&#38;region=BE&#38;gclid=Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIwBEiQAI8rq879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k8P8HAQ&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td> http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488&#38;resultPage=1&#38;resultsPerPage=15&#38;autocomplete=&#38;searchMode=keyword&#38;productTypeSelect=antibody&#38;targetTypeSelect=antibody_secondary&#38;species=ltechall&#38;keyword=488#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;;conjugates:^\%22Alexa%20Fluor&#38;reg;%20488\%22$;; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td> http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594&#38;resultPage=1&#38;resultsPerPage=15&#38;autocomplete=&#38;priorSearchTerms=&#38;searchMode=keyword&#38;productTypeSelect=antibody&#38;targetTypeSelect=antibody_secondary&#38;species=ltechall&#38;keyword=594#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Mus%20musculus\%22$;;&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td> http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, with calcium and magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040174</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133&#160; </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization

Decidualization является прогестерон-зависимый процесс дифференциации эндометрия стромальных клеток и является необходимым условием для успешной имплантации эмбриона. Хотя многие были предприняты усилия, чтобы выявить основные механизмы decidualization, точная передача сигналов между эпителиальными клетками, которые находятся в контакте с эмбрионом и нижележащих стромальных клеток еще недостаточно изучена. Поэтому, изучая decidualization таким образом, который принимает как эпителиальные и стромальные клетки во внимание могли бы улучшить наши знания о молекулярных деталях decidualization. С этой целью в естественных условиях модели искусственного decidualization являются физиологически наиболее актуальными; Тем не менее, манипулирование межклеточной коммуникации ограничено. В настоящее время в пробирке культур эндометрия стромальных клеток используются для исследования модуляции decidualization нескольких сигнальных молекул. Обычно стромальные клетки человека или мыши являются внутриматочныеиспользуемый. Тем не менее, наличие образцов человека очень часто ограничены. Кроме того, применение мышиных тканей сопровождается разнообразием в способе культивирования. Данное исследование представляет собой проверенную и стандартизированный метод для получения чистого Эндометриальный эпителиальной клетки (ЕЭС) и стромальных клеток (ESC) с использованием культуры взрослых интактных мышей, получавших эстроген в течение трех дней подряд. Протокол оптимизирован для повышения выхода, жизнеспособности и чистоты клеток и затем было продлено с целью изучения decidualization в сокультивирования ЭВП и ESC. Эта модель может быть пригодным для использования важность обоих типов клеток в decidualization и оценить вклад значащих сигнальных молекул, секретируемых ЕЭС или ESC во время межклеточной коммуникации.

Общий обзор протокола Фигура 1А иллюстрирует общий обзор протокола. Ежедневная инъекция E2 (100 нг) в течение трех последовательных дней, был использован для синхронизации животных и стандартизировать фазы эстрального цикла. Цикл течки может быть оценена с помощью вагинальных промываний и делится на проэструса течки, диэструсе и фазы metestrus. Фазовый цикл может быть определен в соответствии с соотношением десквамированных клеток в промывании, которые подвержены гормональным изменениям. Повышение уровня эстрогена заставит животных развиться до течки фазы. Эта фаза может быть легко обнаружена в присутствии исключительно ороговевших эпителиальных клеток и отсутствие лейкоцитов (рис 1б). На 4 -й день, матках животных , которые находятся в фазе течки собирают и MEEC и МЕСК изолированы (рис 1C). Decidualization грап индуцировали добавлением 0,5 мМ цАМФ и 1 мкМ MPA до 2% FBS среды в течение инкубационного периода в 5 дней. Контроль качества MEEC и MESC культур Чистота первичных клеточных культур может быть оценена с помощью разницы в выражении виментина и цитокератин. Виментин является промежуточным нить, которая выражается в мезенхимальных клеток, следовательно, в эндометриоидных стромальных клетках. Цитокератин является промежуточным нить найдено в цитоскелета эпителиальной ткани. На фиг.2А показан уровень экспрессии мРНК виментину и цитокератином в MEEC и MESC оценивали с использованием QRT-PCR. Уровни Виментин высоки в MESC и низко в MEEC (2.2x выше, р &lt;0,001), в то время как Цитокератин уровни высоки в MEEC и низко в MESC (36x выше, р &lt;0,001). Виментин / цитокератин двойное окрашивание проводили и показали, что стромальные клетки экспрессируют виментин, тогда как epithelial клетки экспрессируют цитокератин (рис 2B, C). Отсутствие первичных антител использовали в качестве отрицательного контроля для иммунным (рис 2D, Е). Эти иммуногистологические окрашивания показывают, что оба внутриматочные клеточные культуры (MEEC и МЕСК) имеет чистоту до 90%. Decidualization в MEEC / MESC совместных культурах После выделения, внутриматочные мыши и стромальные клетки были высеяны в системе сокультуры, чтобы имитировать внутриматочную среду. Клетки культивировали до тех пор, пока эпителиальные клетки образовали монослой во вставке клеточной культуры (значения Teer 800 - 1000 / лунку), и стромальные клетки достигли суб-сливающийся состояние. Decidualization индуцировали в стромальных клеток с применением 0,5 мМ цАМФ и 1 мкМ MPA. После пяти дней инкубации, пролактина уровни мРНК были оценены в стромальных клетках QRT-PCR в качестве показателя для decidualization (Фиг.3А). Уровни пролактина были высоко экспрессируется в клетках, подвергнутых гормонами и невыявляемый в клетках, инкубированных с контрольной средой (р &lt;0,01). Так как эпителиальные клетки трудно визуализировать внутри вставок клеточных культур, пробирного жизнеспособность проводили сразу после пятидневного инкубационного периода (рис 3B). Сочетание нормальной ростовой среды и реагента жизнеспособность добавляли в лунки и инкубировали в течение периода минимального 8 - 12 ч. Сдвиг цвета от синего до ярко-розового указывает на присутствие жизнеспособных клеток эпителия. Следует отметить, что изменение цвета будет происходить только тогда, когда жизнеспособные клетки присутствуют. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig1.jpg" /> Рисунок 1: Общий обзор Протокола. (А) Схема протокола изоляции , начиная с трехдней подряд эстрогена инъекций. На 3-й день, необходимые препараты должны быть приготовлены. На 4-й день, течка фаза вычисляется (обозначается звездой), выполняя промывание влагалища. MESC и MEEC выделяют с использованием различных стадий пищеварения. На 6-й день, или когда клетки сливающийся, decidualization могут быть вызваны в системе совместного культивирования путем добавления цАМФ и MPA к среде и инкубационный период в пять дней (день 6 - 11). (Б) репрезентативную картину течки фазы , характеризующейся наличием ороговевших эпителиальных клеток в вагинальных лаважа (увеличение 10х). (C) представитель картина MESC и MEEC (увеличение 20x, масштаб бар: 100 мкм). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig2.jpg" /> <stronг&gt; Рисунок 2: Иммунологическое и количественный RT-PCR для Виментин и цитокератину в MEEC и MESC. (A) уровни РНК посыльного экспрессии виментина и цитокератин указать чистоту культур. уровни РНК были относительно количественно среднего геометрического генов домашнего хозяйства ACTB и ТБФ. Данные представлены как средние значения ± SEM. Виментин / цитокератин двойное окрашивание на MESC культур (Б) и MEEC культур (C). Вставить в левой показывает вид увеличения 63X. Отрицательный контроль с первичным антителом , исключенных для MESC (D) и MEEC (E) (Масштаб бар: 50 мкм). ***: Р &lt;0,001 с двухсторонним ANOVA с коррекцией Бонферрони для множественного тестирования. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig2large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> Рисунок 3: Проверка Decidualization с помощью RT-PCR. Уровни (А) мРНК пролактина экспрессии в стромальных клетках , чтобы оценить decidualization. уровни РНК были относительно количественно среднего геометрического генов домашнего хозяйства PGK1 и ТБФ. Складка изменения в клетках, культивируемых в контроле или децидуальной среде показан в виде среднего значения ± SEM. (Б) Наглядные фотографии стромальных клеток до (вверху) и после (внизу) decidualization раздражитель. Вставка на справа показывает увеличение в более decidualized стромальной клетки. Decidualization характеризуется наличием многоядерные клетки, показано черными стрелками. (С) Типичные изображения оценки жизнеспособности клеток эпителиальной во вставке после анализа. Фотографии были сделаны сразу же после введения реагента жизнеспособности (Prestoblue) (0 ч) и Following утро (ON). **: Р &lt;0,01 с помощью теста Манна-Уитни U. ON: в течение ночи. Шкала бар: 100 мкм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization at JoVE.com

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Это исследование представляет собой стандартизацию и апробацию способ выделения и культуры первичных стромальных мыши внутриматочной и эпителиальных клеток, которые могут быть использованы в системе совместного культивирования для изучения в пробирке decidualization.

Выделение мыши Эндометриальный эпителиальных и стромальных клеток для<em&gt; In Vitro</em&gt; Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Выделение и Обогащение жировой ткани стромальных клеток для расширенной остеогенеза

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Выделение и расширения мезенхимальных стволовых / стромальные клетки, полученные из плаценты человека ткани

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Быстрое Выделение BMPR-IB + жировая стромальных клеток, полученных для использования в костный дефект модели заживления

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Выделение и характеристика мезенхимальных стромальных клеток из пуповинной и фетальной плаценты

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

В пробирке Рост Preantral фолликулов мыши под искусственной микрогравитации

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Изоляция, культура и дифференцировки клеток стромы костного мозга и остеокластов прародителей от мышей

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

Выделение и характеристика сердечной мезенхимальных стромальных клеток от эндомиокардиальная относящийся к биопсии образцы больных аритмогенная кардиомиопатия

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Изоляции человека эндометрия стромальных клеток In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

В Vitro поколения Сомит производных от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Поколение многоклеточных органов эндометрия человека

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...