Name: isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization
Uploaded: 2017-03-02T13:00:00
Duration: 8 min 37 s
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Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación de Investigación de Flandes (FWO G.0856.13N) y el Consejo de Investigación de la Universidad Católica de Lovaina (OT / 13/113). KDC es financiado por el FWO Bélgica. AH es financiado por OT / 13/113. Nos gustaría dar las gracias a la instalación Cell Imaging Core de la Universidad Católica de Lovaina (http://gbiomed.kuleuven.be/english/corefacilities/microscopy/cic/cic.htm) para el uso del microscopio confocal.

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	<li>Cummings, A. M., Yochim, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+uterus+in+preparation+for+gestation:+a+model+for+the+action+of+progesterone.">Differentiation of the uterus in preparation for gestation: a model for the action of progesterone.</a> J Theor Biol. 106 (3), 353-374 (1984).</li><li>Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+regulation+of+menstruation.">Endocrine regulation of menstruation.</a> Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).</li><li>Wang, X., Matsumoto, H., Zhao, X., Das, S. K., Paria, B. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+mouse+uterine+stromal+cells+on+epithelial+cell+transepithelial+resistance+(TER)+and+TNFalpha+and+TGFbeta+release+in+culture.">Effect of mouse uterine stromal cells on epithelial cell transepithelial resistance (TER) and TNFalpha and TGFbeta release in culture.</a> Biol Reprod. 69 (3), 1091-1098 (2003).</li><li>De Clercq, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+transient+receptor+potential+channels+in+human+endometrial+stromal+cells+during+the+luteal+phase+of+the+menstrual+cycle.">Functional expression of transient receptor potential channels in human endometrial stromal cells during the luteal phase of the menstrual cycle.</a> Hum Reprod. 30 (6), 1421-1436 (2015).</li><li>Pieper, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vimentin+expression+in+cultured+epithelial+cells.">Regulation of vimentin expression in cultured epithelial cells.</a> Eur J Biochem. 210 (2), 509-519 (1992).</li><li>Greaves, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+of+endometriosis+mimics+human+phenotype+and+reveals+insights+into+the+inflammatory+contribution+of+shed+endometrium.">A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium.</a> Am J Pathol. 184 (7), 1930-1939 (2014).</li><li>Pierro, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+interactions+modulate+estrogen+responsiveness+in+normal+human+endometrium.">Stromal-epithelial interactions modulate estrogen responsiveness in normal human endometrium.</a> Biol Reprod. 64 (3), 831-838 (2001).</li><li>Kim, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone-dependent+release+of+transforming+growth+factor-beta1+from+epithelial+cells+enhances+the+endometrial+decidualization+by+turning+on+the+Smad+signalling+in+stromal+cells.">Progesterone-dependent release of transforming growth factor-beta1 from epithelial cells enhances the endometrial decidualization by turning on the Smad signalling in stromal cells.</a> Mol Hum Reprod. 11 (11), 801-808 (2005).</li><li>Chen, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coculturing+human+endometrial+epithelial+cells+and+stromal+fibroblasts+alters+cell-specific+gene+expression+and+cytokine+production.">Coculturing human endometrial epithelial cells and stromal fibroblasts alters cell-specific gene expression and cytokine production.</a> Fertil Steril. 100 (4), 1132-1143 (2013).</li><li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact.">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> J Vis Exp. (113), (2016).</li><li>Arnold, J. T., Kaufman, D. G., Seppala, M., Lessey, B. 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Los autores no tienen nada que revelar.

Decidualization es la diferenciación de progesterona dependiente de las células del estroma endometrial a las células deciduales ronda secretoras. En humanos, este proceso se produce de forma espontánea durante la fase lútea del ciclo menstrual y se inicia en las células del estroma que rodean a las células vasculares para formar el predecidua. Sin embargo, en los roedores, la presencia de un blastocisto es imperativo para inducir decidualization. El hecho de que decidualization sólo se produce después del contacto con las células epiteliales del endometrio implica que los factores importantes son secretadas por las células epiteliales para inducir decidualization en el estroma subyacente. Aunque esta diferencia en la iniciación del proceso de decidualization debe ser reconocido, el hecho de que decidualization humano se vuelve más robusta a la implantación del embrión sugiere que mecanismos similares podrían estar involucrados. In vitro de cultivos celulares a menudo se utilizan para estudiar el efecto de moléculas específicas durante el proceso de decidualization.Sin embargo, la disponibilidad y la cantidad de tejido humano que puede ser recogida suele ser limitada y acompañadas de variaciones, por ejemplo, la fase del ciclo, número de embarazos y la presencia de enfermedades ginecológicas como la endometriosis o adenomiosis. Muchos de estos problemas pueden evitarse con el uso de tejido murino que es fácilmente accesible y la fase del ciclo independiente. Otra gran ventaja de la utilización de tejido murino es la oportunidad de utilizar los roedores modificados genéticamente y por la posibilidad de instalar un gran número de experimentos. Por el momento, muchos protocolos de aislamiento diferentes se han descrito en la literatura con alta variabilidad en la edad de los animales y el período en la fase de estro en el momento de uso. En este estudio se presenta un nuevo método para endometriales co-cultivos primarios de células estromales y epiteliales en el que se aprovechó de un ciclo estral estandarizada por una inyección diaria de estrógeno antes del aislamiento. Además, el estrógeno es known para inducir la proliferación en las células epiteliales y estromales que aumenta aún más el rendimiento por aislamiento. El protocolo de aislamiento descrito en este documento se basa en Grant et al. 7, sin embargo, se incluyeron otras medidas de optimización para aumentar el rendimiento, la pureza y la viabilidad de los diferentes cultivos celulares. En primer lugar, HBSS siempre fue suplementado con antibióticos para evitar la contaminación del cultivo primario. Durante el aislamiento de MEEC, se llevó a cabo una adaptación de la temperatura (15 min a 37 ° C) para aumentar la cosecha de las células epiteliales durante la primera digestión. A continuación, se incluye un paso adicional para moderar la actividad enzimática después de digestión con tripsina mediante la adición de medio que contiene FBS para inhibir su actividad. Además, MEECs se pasaron a través de un filtro de la cual la malla era más grande que lo que se describe comúnmente (100 micras) ya que a menudo vienen en racimos y láminas de células. Por otra parte, la contaminación por células estromales se redujo mediante la realización de un complementoitional etapa en la que MEECs y mESCs fueron separados basados ​​en la sedimentación por gravedad. Finalmente, MEECs se sembraron en cubreobjetos recubiertos con colágeno para aumentar la unión de las células a cubreobjetos de vidrio, como se puso de manifiesto que el apego a cubreobjetos de vidrio no recubiertas o-PLL era insuficiente. Durante el aislamiento de los mESCs, se complementó colagenasa (1 mg / ml) para mejorar la digestión. Además, esta etapa de digestión se realizó por duplicado para evitar la contaminación de MEECs restantes. Todos estos pasos adicionales resultaron en cultivos puros y viables de poblaciones celulares homogéneas. La pureza de la población de células se evaluó con inmunotinción y QRT-PCR usando vimentina como marcador del estroma y citoqueratina como un marcador epitelial. Claramente, se observó un patrón de expresión opuesto de vimentina y citoqueratina en MEEC y MESC. Sin embargo, se puede notar que la expresión mRNA relativa de vimentina y citoqueratina es similar en los cultivos MEEC. similar resultados son publicados por otros grupos de investigación, en el que las células epiteliales en la expresión de vimentina cultura adquieren 9. Más importante es la diferencia en la expresión de proteínas entre vimentina y citoqueratina como se observó en los inmunohistoquímico coloraciones de las diferentes poblaciones de células. inmunotinción doble mostró que EECs fueron positivas para citoqueratina y ESC fueron positivas para vimentina. El uso de estos marcadores en la inmunotinción es un método establecido y de manera estándar utiliza para indicar los tipos de células 10. Aunque una gran cantidad de investigación se ha realizado en el decidualization de MESC, sigue siendo posible que la presencia de células epiteliales en este modelo puede alterar los resultados de decidualization. En primer lugar, se ha demostrado que si MEEC crecer a una monocapa en presencia de medio MESC acondicionado o en un entorno de co-cultivo, la monocapa tiene una resistencia eléctrica transepitelial mejorada de células epiteliales (TEER), como resultado de factores secretados por MESC 7. Por otra parte, Pierro et al. 11 proporcionan evidencia de que la proliferación epitelial, influenciado por 17β-estradiol, podría estar mediado por factores secretados por las células del estroma, y de forma alternativa, las células epiteliales pueden liberar factores que modulan decidualization estroma 12, 13. En general, es evidente que el entorno de co-cultivo epitelial-estromal ofrece una situación más fisiológica que permite la interacción paracrina y la comunicación. El método de cultivo de dos tipos de células diferentes utilizando un sistema de co-cultivo inserto se ha descrito anteriormente 14, 15 y se ha adaptado para el uso de células primarias de múrido. Por la detección de los niveles de mRNA de prolactina como de salida para leer decidualization, la técnica descrita tiene un muy reproducible de lectura de salida para decidualization disponible y permitirs así el estudio de la relación epitelial-estromal durante decidualization. paracrinos señales mediadas de MEEC podrían alterar el alcance de decidualization en las células del estroma. Además, el modelo permite la modulación específica de la parte epitelial sin afectar directamente a las células del estroma. Por lo tanto, esta co-cultivo de MEEC y MESC ofrece una herramienta perfecta para evaluar el efecto de las hormonas, citoquinas, etc., en las células epiteliales con una lectura de datos en decidualization estromal. Otra ventaja de este sistema de cultivo es que permite a los investigadores estudiar la implicación de una proteína específica en el decidualization-proceso, ya sea en el epitelial o compartimiento del estroma mediante el uso de células aisladas de animales transgénicos. Además, esta técnica será muy útil para investigar la adhesión de blastocisto para evaluar si los factores paracrinos secretadas por las células epiteliales en presencia de un blastocisto son suficientes para inducir decidualization de la estroma subyacenteCélulas. Un paso importante en la invasión del trofoblasto correlacionada con degradación de la matriz extracelular, que está mediada por la acción de enzimas proteolíticas. La técnica propuesta se puede aplicar como un modelo in vitro para investigar la diafonía entre el blastocisto, las células epiteliales y del estroma de soporte. Sin embargo, por el momento se sabe poco sobre el origen de las células epiteliales que pueden ser, así como luminal glandular. Por lo tanto, se requiere una mayor caracterización del perfil genético y molecular de las células epiteliales. Además, el método descrito está limitado en el conocimiento disponible acerca de la polarización de las células epiteliales. Por el momento, la polarización de las células epiteliales no se tuvo en cuenta. Sin embargo, diferencias en la expresión de proteínas de membrana se describen en las membranas apicales y basales. la polarización inadecuado de la capa epitelial podría tener un impacto en la interacción paracrina entre epitheliAl y las células del estroma. Sin embargo, los métodos para obtener células epiteliales polarizadas se ha descrito y se podrían incluir en la técnica descrita 15, 16. En total, el protocolo descrito propone una técnica para establecer con éxito cultivos celulares primarios de ratón epitelial endometrial y células del estroma. Esta técnica resulta en cultivos de células puras como se confirma por QRT-PCR y la inmunotinción de vimentina y citoqueratina. En última instancia, se introdujo una epiteliales y del estroma de co-cultivo que permite la investigación de las señales paracrinas mediadas por cualquiera de MEEC y / o MESC en el proceso decidualization.

El endometrio humano es el revestimiento interno del útero y se somete a ciclos mensuales de descomposición y la reparación como una preparación para posibles embarazos. Se compone de una sola capa de células epiteliales que recubren el lumen uterino y el estroma subyacente que varía de espesor de acuerdo con las fluctuaciones de las hormonas ováricas estrógenos y progesterona. Durante la fase luteal, el aumento de la progesterona posovulatorio inducirá la diferenciación de las células del estroma endometrial a las células deciduales más grandes, redondas, un proceso llamado decidualization 1, 2. En humanos, este fenómeno se produce de forma espontánea para formar el predecidua, pero se hace más pronunciada después de la implantación del embrión. A consecuencia funcional de decidualization es que el útero se vuelve transitoriamente receptivo a la implantación del embrión. Este intervalo se denomina como la &quot;ventana de implantación&quot;. Durante el período inicial de la implantación del embrión, el correo decidualizedlas células del estroma que rodean ndometrial el embrión implante proporcionarán una barrera para impedir el paso de sustancias perjudiciales para el embrión 3. Durante el embarazo, este decidua proporcionará nutrientes para el desarrollo del feto antes de placentación ha tenido lugar, y más tarde formará la parte materna de la placenta 4. Consideraciones éticas y prácticas limitan el diseño de los estudios en humanos para investigar el proceso de decidualization y han impulsado el uso de modelos animales. Al ser un miembro del grupo de placentación hemochorial, el endometrio de roedores también va a sufrir decidualization antes de la placentación 5. En los roedores, sin embargo, el inicio del proceso de decidualization depende de la presencia de los blastocistos en el lumen uterino, lo que indica que un estímulo extra es necesario para activar las respuestas deciduales 6. Esto implica una compleja comunicación entre THe células endometriales epiteliales que tienen contacto directo con el blastocisto y las células del estroma subyacente. Sin embargo, decidualization puede inducirse artificialmente mediante estímulos como el rascado mecánico o la instilación de aceite en un útero preparado hormonal. Aunque los estudios in vivo utilizando modelos artificiales decidualization nos han permitido mejorar nuestros conocimientos en el proceso complejo de señalización de decidualization, mecanicistas estudios en profundidad, por ejemplo, la investigación de la comunicación indispensable entre las células epiteliales y del estroma, son limitadas. Por lo tanto, en estudios in vitro decidualization se pueden utilizar para manipular vías importantes y estudiar los procesos fundamentales. Con este fin, los cultivos de células estromales endometriales primarios se pueden configurar de endometrio humano o de roedores. El empleo de los roedores consiente el uso de animales modificados genéticamente para investigar el papel de una proteína específica de interés durante el proceso de decidualization. Sin embargo, no maduro, prepúberratones ty se utilizan a menudo con el fin de evitar complicaciones del ciclo estral, mientras que en otros casos úteros se recogen de todas las fases del ciclo estral, lo que resulta en una heterogeneidad en los cultivos. Además, el proceso de decidualization se ha estudiado en diferentes protocolos, por ejemplo, por (i) las hormonas que complementa (estrógeno, progesterona o monofosfato de adenosina cíclico (cAMP)) al medio de cultivo, o por (ii) el aislamiento de las células deciduales de los ratones en día 4,5 de la gestación (pseudo), que exigen la necesidad adicional para la comprobación de enchufe y machos vasectomizados. Estas limitaciones demuestran la necesidad de un método estandarizado para estudiar en decidualization vitro. En este estudio, un modelo fisiológico para examinar decidualization in vitro a partir de adulto, se presentarán (pseudo) ratones no embarazadas. En este método, la inyección diaria de 17β-estradiol (E2) se induce la proliferación de las células del endometrio, dando como resultado un aumento del rendimiento de homogénea y ppoblaciones de células ure. Además, el uso de un sistema de cocultivo permite el estudio de la diafonía epitelial-estromal y la capacidad de manipular el proceso de decidualization en diferentes niveles.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ThinCert Tissue culture insert for 24 well plates; 1 &#181;m pore size; transparant</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662610</td>
			<td>Inserts are also provided for other multiwell plates and/or other pore sizes. Other suppliers: Merck Millipore. 
			https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0110_0110_0090_0030/13408/&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Cell culture treated 24 well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td> http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Bromoadenosine 3&#8242;,5&#8242;-cyclic monophosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B7880</td>
			<td>Prepare a stock solution of 100 mM in Milli Q water. Store aliquots at -20 &#176;C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medroxyprogesterone 17-acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1629</td>
			<td>Prepare a stock solution of 250 &#181;M in ethanol. Store aliquots at -20 &#176;C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arachis oil</td>
			<td>Supermarket</td>
			<td></td>
			<td>Standard cooking arachis oil that can be found in every supermarket is used </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrestoBlue cell viability reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A13261</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 1x, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-046</td>
			<td>Store in fridge as long as possible. Use cold HBSS+ during the protocol. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17-&#946; Estradiol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E8875</td>
			<td>Prepare a stock solution of 1mg/ml in EtOH before diluting in arachis oil (1:1000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell medium filter Stericup, 0.22 &#181;m, polyethersulfone, 500 mL, radio-sterilized</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td> http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063&#160;&#160;&#160;&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12, phenol red, L-glutamine, HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-056</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290-018</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50mg/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-037</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5921</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB-105</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6395</td>
			<td>Dilute in Milli Q water, adjust pH to 7 with NaOH and filter before use. Store in the dark. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1882</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, glass, 18 mm &#216;</td>
			<td>Glaswarenfabrik Karl Hecht</td>
			<td>1001/18</td>
			<td> http://www.hecht-assistent.de/187/?L=1&#38;tx_rmproducts_pi1[g]=937&#38;tx_rmproducts_pi1[p]=3504&#38;tx_rmproducts_pi1[v]=20088&#38;cHash=abd12065683fe74b00eaa5e562824d06&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IA from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2674</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7409</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Warm to room temperature before use. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 40 &#181;m mesh, disposable</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td> https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 100 &#181;m mesh, disposable</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td> https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22&#160;&#181;m, polyethersulfone, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td> https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial) 100%</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.00063</td>
			<td> https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>354236</td>
			<td>From rat tail. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=&#38;productid=354236%28Lifesciences%29#&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancreatin from porcine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3292</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td> https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. analytical reagent</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821296</td>
			<td> https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal rabbit anti-human vimentin (D21H3)&#160;</td>
			<td>Cell Signalling Tech</td>
			<td>#5741</td>
			<td>use 1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal mouse anti-human pan cytokeratin&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2562</td>
			<td>use 1/1000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td> http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en&#38;region=BE&#38;gclid=Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIwBEiQAI8rq879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k8P8HAQ&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td> http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488&#38;resultPage=1&#38;resultsPerPage=15&#38;autocomplete=&#38;searchMode=keyword&#38;productTypeSelect=antibody&#38;targetTypeSelect=antibody_secondary&#38;species=ltechall&#38;keyword=488#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;;conjugates:^\%22Alexa%20Fluor&#38;reg;%20488\%22$;; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td> http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594&#38;resultPage=1&#38;resultsPerPage=15&#38;autocomplete=&#38;priorSearchTerms=&#38;searchMode=keyword&#38;productTypeSelect=antibody&#38;targetTypeSelect=antibody_secondary&#38;species=ltechall&#38;keyword=594#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Mus%20musculus\%22$;;&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td> http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, with calcium and magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040174</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133&#160; </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization

Decidualization es un proceso de diferenciación de progesterona dependiente de las células del estroma endometrial y es un requisito previo para el éxito de la implantación del embrión. Aunque se han hecho muchos esfuerzos para revelar los mecanismos subyacentes de decidualization, la señalización exacta entre las células epiteliales que están en contacto con el embrión y las células del estroma subyacente sigue siendo poco conocida. Por lo tanto, el estudio de decidualization de una manera que toma tanto el epitelio y las células del estroma en cuenta podría mejorar nuestro conocimiento sobre los detalles moleculares de decidualization. Para este propósito, en modelos in vivo de decidualization artificial son fisiológicamente más relevantes; Sin embargo, la manipulación de la comunicación intercelular es limitado. Actualmente, en cultivos in vitro de células del estroma endometrial se utilizan para investigar la modulación de decidualization por varias moléculas de señalización. Convencionalmente, las células estromales humanas o de ratón endometriales sonusado. Sin embargo, la disponibilidad de muestras humanas se limita, con frecuencia. Además, el uso de tejidos murinos se acompaña con variedad en el método de cultivo. Este estudio presenta un método validado y estandarizado para obtener pura de la célula epitelial endometrial (CEE) y las culturas del estroma celular (CES) que utilizan ratones intactos adultos tratados con estrógenos durante tres días consecutivos. El protocolo se ha optimizado para mejorar el rendimiento, la viabilidad y la pureza de las células y se amplió con el fin de estudiar decidualization en un cocultivo de CEE y ESC. Este modelo puede ser adecuado para explotar la importancia de ambos tipos de células en decidualization y evaluar la contribución de las moléculas de señalización importantes secretadas por la CEE o ESC durante la comunicación intercelular.

Descripción general de Protocolo La figura 1A ilustra una visión general del protocolo. Una inyección diaria de E2 (100 ng) durante tres días consecutivos se utiliza para sincronizar los animales y estandarizar la fase del ciclo estral. El ciclo estral se puede evaluar mediante lavados vaginales y se divide en el proestro, estro, diestro, y la fase metaestro. La fase del ciclo puede ser designado de acuerdo con la proporción de células descamadas en el lavado, que están sometidos a cambios hormonales. El aumento de los niveles de estrógeno hará que los animales evolucionan a la fase de estro. Esta fase puede ser fácilmente detectado por la presencia de células epiteliales cornificadas exclusivamente y la ausencia de leucocitos (Figura 1B). El día 4, úteros de los animales que se encuentran en fase de estro se recogen y MEEC y MESC están aislados (Figura 1C). c decidualizationun ser inducida mediante la adición de AMPc 0,5 mM y 1 M MPA al medio FBS 2% durante un período de incubación de 5 d. Control de calidad de MEEC y MESC culturas La pureza de los cultivos de células primarias se puede evaluar por la diferencia de vimentina y citoqueratina expresión. La vimentina es un filamento intermedio que se expresa en las células mesenquimales, por lo tanto, en las células del estroma endometrial. La citoqueratina es un filamento intermedio que se encuentra en el citoesqueleto de tejido epitelial. La figura 2A muestra el nivel de expresión de ARNm de vimentina y citoqueratina en MEEC y MESC evaluó mediante QRT-PCR. vimentina niveles son altos en MESC y baja en MEEC (2,2 veces más alta, p &lt;0,001), mientras que los niveles de citoqueratina son altos en MEEC y baja en MESC (36x más alta, p &lt;0,001). Un vimentina / doble tinción de citoqueratina se realizó e indicó que las células estromales expresan vimentina, mientras que Epitcélulas helial expresan citoqueratina (Figura 2B, C). La ausencia de anticuerpo primario se utilizó como control negativo para la inmunotinción (Figura 2D, E). Estos inmunohistoquímico coloraciones muestran que tanto los cultivos de células de endometrio (MEEC y MESC) tienen una pureza de hasta el 90%. Decidualization en MEEC / cocultivos MESC Después del aislamiento, las células endometriales estromales de ratón y se sembraron en un sistema de co-cultivo para imitar el entorno de endometrio. Las células se cultivaron hasta que las células epiteliales forman una monocapa en el inserto de cultivo celular (valores de TEER de 800 - 1.000 / pocillo), y las células del estroma llegado a un estado sub-confluente. Decidualization se indujo en las células del estroma con la aplicación de cAMP 0,5 mM y 1 M MPA. Después de cinco días de incubación, los niveles de mRNA de prolactina se evaluaron en las células del estroma de QRT-PCR como una indicación para DECIDualization (Figura 3A). Los niveles de prolactina fueron altamente expresado en células sometidas a las hormonas y no detectables en las células incubadas con el medio de control (p &lt;0,01). Dado que las células epiteliales son difíciles de visualizar el interior de los insertos de cultivo celular, un ensayo de viabilidad se realizó inmediatamente después del período de incubación de cinco días (Figura 3B). Se añadió una mezcla de medio de crecimiento normal y un reactivo de viabilidad a los pocillos y se incubó durante un período de un mínimo de 8 a 12 h. El cambio de color de azul a rosa brillante indicó la presencia de células epiteliales viables. Tenga en cuenta que el cambio de color sólo se producirá cuando las células viables están presentes. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig1.jpg" /> Figura 1: Descripción General del Protocolo. (A) Esquema de la protocolo de aislamiento a partir de tresdías consecutivos de inyecciones de estrógeno. El día 3, los preparativos necesarios deben estar preparados. En el día 4, se evalúa fase de estro (indicado por la estrella) mediante la realización de un lavado vaginal. MESC y MEEC se aísla a través de diferentes fases de digestión. En el día 6, o cuando las células son confluentes, decidualization puede ser inducida en el sistema de co-cultivo mediante la adición de cAMP y MPA para el medio y un periodo de incubación de cinco días (días 6-11). (B) imagen representativa de la fase de estro se caracteriza por la presencia de células epiteliales cornificadas en el lavado vaginal (magnificación 10X). (C) imagen representativa de MESC y MEEC (ampliación 20X, barra de escala: 100 micras). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2: La inmunotinción y RT-PCR cuantitativa para vimentina y citoqueratina en MEEC y MESC. (A) los niveles de ARN mensajero de vimentina y citoqueratina expresión para indicar la pureza de los cultivos. los niveles de ARN se cuantificaron relativamente a la media geométrica de los genes de limpieza ACTB y TBP. Los datos se muestran como la media ± SEM. Vimentina / doble tinción de citoqueratina en cultivos de MESC (B) y culturas MEEC (C). Insertar de la izquierda muestra una vista magnificación 63X. Control negativo con el anticuerpo primario omitido para MESC (D) y MEEC (E) (barra de escala: 50 micras). ***: P &lt;0,001 con ANOVA de dos vías con la corrección de Bonferroni para múltiples pruebas. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 3: Validación de decidualization a través de RT-PCR. Niveles (A) mRNA expresión de prolactina en las células del estroma para evaluar decidualization. los niveles de ARN se cuantificaron relativamente a la media geométrica de los genes de limpieza PGK1 y TBP. El factor de cambio en las células cultivadas en el control o medio decidual se muestra como media ± SEM. (B) imágenes ilustrativas de las células del estroma antes (arriba) y después (abajo) de estímulo decidualization. El inserto de la derecha ilustra una ampliación de una célula estromal decidualized. Decidualization se caracteriza por la presencia de células multinucleadas, indicado por flechas negras. (C) Imágenes representativas de la evaluación de la viabilidad de las células epiteliales en el inserto después del ensayo. Fotos fueron tomadas inmediatamente después de la administración del reactivo de viabilidad (Prestoblue) (0 h) y el fespués de la mañana (ON). **: P &lt;0,01 con la prueba de Mann-Whitney. ON: durante la noche. Barra de escala: 100 micras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Este estudio presenta un método estandarizado y validado para el aislamiento y cultivo de ratón primario del estroma endometrial y células epiteliales, que se puede utilizar en un sistema de cocultivo para estudiar en decidualization vitro.

Aislamiento de ratón endometrial epiteliales y células del estroma de<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualization

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