Name: targeted plasma membrane delivery of a hydrophobic cargo encapsulated in a liquid crystal nanoparticle carrier
Uploaded: 2017-02-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Financiamento Base de NRL (Trabalho Unidade MA041-06-41-4943). ON é apoiado por uma Pós-Investigação Associateship National Research Council.

1. Preparação de DIO-LCNP e DIO-LCNP-PEG-Chol <ol><li> Dissolve-se diacrilato de líquido cristalino agente de reticulação (DACTP11, 45 mg), 3,3&#39;-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DiO, 2 mg), e um iniciador de radical livre (azobisisobutironitrilo, 1 mg) para a polimerização em 2 ml de clorofórmio. Adicionar esta a uma solução aquosa de tensioactivo funcionalizado com acrilato (AC10COONa, 13 mg em 7 ml). </li><li> Agita-se a mistura durante 1 hora e sonicado a 80% de amplitude, durante 5 min para pro...

<ol>
	<li>Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+actuation+of+therapeutic+nanoparticles:+an+update+on+recent+progress.">Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress.</a> Ther. Deliv. 7 (5), 335-352 (2016).</li><li>Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+low-dose+toxicity+of+the+universal+solvent+DMSO.">Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO.</a> FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).</li><li>Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+Liquid+Crystal+Nanoparticles+for+Intracellular+Fluorescent+Imaging+and+Drug+Delivery.">Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery.</a> ACS Nano. 8 (7), 6986-6997 (2014).</li><li>Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+DiO-labelled+tumour+cells+in+liver+sections+by+confocal+laser+scanning+microscopy.">Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy.</a> J. Microsc. 208 (Pt 1), 65-74 (2002).</li><li>Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+neuronal+connections+in+postmortem+human+hippocampal+complex+with+the+carbocyanine+dye+DiI.">Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI.</a> Neurobiol Aging. 11 (6), 649-653 (1990).</li><li>K&#246;bbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+concepts+in+neuroanatomical+tracing.">Current concepts in neuroanatomical tracing.</a> Prog. Neurobiol. 62 (4), 327-351 (2000).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+DiO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosci. 12 (9), 333-341 (1989).</li><li>Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+imaging+and+ultrastructural+analysis+of+individual+axon+terminals+labeled+by+iontophoretic+application+of+lipophilic+dye.">Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye.</a> J. Neurosci. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevation+of+intracellular+glucosylceramide+levels+results+in+an+increase+in+endoplasmic+reticulum+density+and+in+functional+calcium+stores+in+cultured+neurons.">Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons.</a> J. Biol. Chem. 274 (31), 21673-21678 (1999).</li><li>Garrett, R. H., Grisham, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. , (2013).</li><li>Berne, B. J., Pecora, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dynamic Light Scattering. , 41155-41159 (2000).</li><li>Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basics of FRET Microscopy. , (2016).</li><li>Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+hydrophobic+molecules+from+polymer+micelles+into+cell+membranes+revealed+by+Fo&#776;rster+resonance+energy+transfer+imaging.">Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Fo&#776;rster resonance energy transfer imaging.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).</li><li>Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+MTT+assay+for+rapid+determination+of+chemosensitivity+of+human+leukemic+blast+cells.">Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells.</a> Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).</li><li>Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+raft-mediated+membrane+tethering+and+delivery+of+hydrophobic+cargos+from+liquid+crystal-based+nanocarriers.">Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers.</a> Bioconjug. Chem. 27 (4), 982-993 (2016).</li><li>Karve, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revival+of+the+abandoned+therapeutic+wortmannin+by+nanoparticle+drug+delivery.">Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8230-8235 (2012).</li></ol>

Um objectivo permanente de NMDD é a segmentação controlada e entrega de formulações de droga para as células e tecidos, combinada com a eficácia da droga melhorada simultânea. Uma classe específica de moléculas de fármaco para o qual este tem sido um desafio significativo é agentes de drogas / imagiologia hidrófobos que têm moderação para nenhuma solubilidade em meios aquosos. Este problema tem atormentado a transição dos fármacos potentes em sistemas de cultura celular in vitro para...

Desde o advento da interface (nanomateriais materiais ≤100 nm de, pelo menos, uma dimensão) com as células vivas, um objectivo contínuo tem sido a de tirar partido das propriedades únicas dependente do tamanho das nanopartículas (NPS) para várias aplicações. Estas aplicações incluem células e tecidos rotulagem / imagiologia (tanto in vitro como in vivo), a detecção em tempo real, e a libertação controlada de drogas e de outras cargas 1. Exemplos de tais propriedades relevantes NP incluem a emissão dependente do tamanho dos nanocristais semicondutores (quantum dots, QDs); as propriedades fototérmicos de nanopartículas de ouro; a grande capacidade de carga do núcleo aquoso de lipossomas; e a condutividade balístico de formas alotrópicas de carbono, tais como os nanotubos de carbono de parede única e grafeno. Mais recentemente, tem surgido um interesse significativo na utilização de NPS para a modulação controlada de drogas e de outras cargas, tais como o contraste / imagiologia umsenhores. Aqui, a lógica é aumentar / otimizar a solubilidade global, dose administrada, o tempo de circulação, e eventual apuramento da carga de drogas por entregá-lo como uma formulação NP significativamente. Isto veio a ser conhecido como a entrega de drogas NP-mediada (NMDD), e existem actualmente sete formulações de drogas NP aprovados pela FDA para uso na clínica para tratar vários tipos de câncer e outras centenas em várias fases de ensaios clínicos. Em essência, o objectivo é o de &quot;conseguir mais com menos;&quot; isto é, para usar o NP como um andaime para fornecer mais fármaco com menos administrações de dosagem, tirando partido da grande área superficial: volume (por exemplo, partículas duras, tais como QDs e óxidos de metal) de PN ou ao seu grande volume interior para o carregamento grandes cargas de carga (por exemplo, lipossomas ou micelas). O objectivo aqui é reduzir a necessidade de múltiplos regimes de dosagem entregues sistemicamente e, ao mesmo tempo que promove a estabilidade aquosa e melhorada a circulação, em particular paracargas de drogas hidrofóbicas desafiantes que, embora altamente eficaz, são pouco solúveis em meios aquosos. Assim, o objectivo do trabalho aqui descrito foi o de determinar a viabilidade de utilização de um novo NP andaime para a entrega controlada e específica de cargas hidrofóbicas na bicamada de membrana plasmática lipofílico. A motivação para o trabalho foi a solubilidade limitada inerente e dificuldade na entrega de moléculas hidrofóbicas para as células a partir de meios aquosos. Tipicamente, o fornecimento de tais moléculas hidrofóbicas requer o uso de solventes orgânicos (por exemplo, DMSO) ou agentes tensioactivos anfifílicos (por exemplo, poloxâmeros), que pode ser celular e do tecido viabilidade tóxico e compromisso 2, ou transportadores de micelas, o qual pode ter limitados carga interna capacidades. O transportador escolhido NP aqui era um cristal líquido NP (LCNP) nova formulação desenvolvida anteriormente 3 e que tinha sido mostrado anteriormente para conseguir um ~ 40 vezes maior<html> melhoria na eficácia do fármaco anticancro doxorrubicina em células de cultura 4. No trabalho aqui descrito, a carga representativo seleccionado foi o corante membrana potenciométrica, 3,3&#39;-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO). DiO é um corante insolúvel em água que tem sido utilizado para anterógrada e rastreamento retrógrado em vida e neurônios fixos, membrana medidas de potencial, e por membrana geral rotulagem 5, 6, 7, 8, 9. Devido à sua natureza hidrofóbica, a DIO é tipicamente adicionado directamente a monocamadas de células ou tecidos numa forma cristalina 10, ou que é incubada a concentrações muito altas (~ 1-20 uM) após diluição a partir de uma solução de estoque de concentração 11, 12. conteúdo &quot;&gt; Aqui, a abordagem foi a utilização para a plataforma LCNP, um NP multifuncional cujo núcleo interior é completamente hidrofóbico e cuja superfície é simultaneamente hidrófilo e passíveis de bioconjugação, como um veículo de entrega para DiO. DiO é incorporado no núcleo LCNP durante a síntese , e a superfície de NP é então funcional izado com uma porção de colesterol PEGuilado para promover a ligação do conjunto DIO-LCNP para a membrana do plasma da membrana. Esta abordagem resultou em um sistema de entrega que particionado DIO na membrana de plasma com uma maior fidelidade e residência membrana tempo do que a forma livre do DiO libertos de solução em massa (DiO livre). Além disso, este método mostrou que o transporte mediado por LCNP de DiO substancialmente modula e dirige a taxa de partição específica do corante na bicamada da membrana do plasma lipofilico. esta é alcançados enquanto reduzindo concomitantemente a citotoxicidade do fármaco livre por ~ 40% por entregá-lo como uma formulação LCNP. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Prevê-se que a metodologia aqui descrita será uma técnica que permite poderosa para os pesquisadores, cujo trabalho envolve ou exige a entrega celular de cargas altamente hidrofóbicos que são pouco solúveis ou completamente insolúvel em solução aquosa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>E2247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4292-20MG</td>
			<td>Hazardous/ make stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride</td>
			<td>Nanocs, Inc.</td>
			<td>PG2-AMCS-2k</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess automated cell counter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C10227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>468495-100MG</td>
			<td>Hazardous/ make stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21063045</td>
			<td>Warm in 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14040182</td>
			<td>Warm in 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic light scattering instrument</td>
			<td>ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Bovine Protein, Plasma</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>33010018</td>
			<td>Make stock solution 1mg/mL using DPBS. Use 20-30 &#181;g/mL for coating MetTek dish, 2 h@ 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (16%, W/V)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>28906</td>
			<td>Hazardous, dilute to 4% using DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17)</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC&#174; CRL-11268&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell imaging solution (LCIS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Warm in 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish</td>
			<td>MatTek corporation</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21063045</td>
			<td>Warm in 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>24510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1si spectral confocal microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>T10282</td>
			<td>mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeta potential instrument</td>
			<td>ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Processor</td>
			<td>Sonics and Materials Inc</td>
			<td>GEX 600-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Cetntrifuge</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>Mini-fuge-04477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 Sephadex&#8482; G-25 Medium</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>76S/07434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA(0.25%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted plasma membrane delivery of a hydrophobic cargo encapsulated in a liquid crystal nanoparticle carrier

A entrega controlada de agentes fármaco / imagiologia de células é crucial para o desenvolvimento de agentes terapêuticos e para o estudo de processos de sinalização celular. Recentemente, nanopartículas (PN) mostraram promessa significativa no desenvolvimento de tais sistemas de distribuição. Aqui, um NP (LCNP) sistema de libertação com base na cristal líquido tem sido empregue para a libertação controlada de um corante insolúvel em água, 3,3&#39;-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO), a partir de dentro do núcleo NP para a região hidrofóbica de um plasma bicamada da membrana. Durante a síntese das NPs, o corante foi eficientemente incorporado no núcleo hidrófobo LCNP, tal como foi confirmado por análises espectroscópicas múltiplas. A conjugação de um derivado de colesterol PEGuilado para a superfície da NP (DIO-LCNP-PEG-Chol) permitiu a ligação das NPs carregadas com corante para a membrana plasmática em células HEK 293T / 17. a laser microscopia confocal e Förster transferência de energia por ressonância resolvida no tempo (FRET) imaging confirmou a passagemive efluxo de DiO a partir do núcleo LCNP e sua inserção na bicamada da membrana do plasma. Finalmente, a entrega de DiO como um LCNP-PEG-Chol atenuou a citotoxicidade de DiO; a forma NP da OID exibiu ~ 30-40% menor toxicidade em comparação com Dio livre entregues a partir de solução em massa. Esta abordagem demonstra a utilidade da plataforma LCNP como uma modalidade eficaz para a entrega específica à membrana e modulação de cargas moleculares hidrofóbicas.

LCNPs foram preparados na qual o núcleo hidrófobo da NP foi carregado com uma sonda de marcação da membrana-representativo para demonstrar a utilidade do LCNP como um veículo de entrega eficiente para cargas hidrofóbicas. Para este efeito, a carga foi escolhido o corante-marcação da membrana potenciométrica altamente insolúvel em água, DiO. LCNPs DIO-carregados (DIO-LCNPs) foram sintetizados usando uma técnica mini-emulsão de duas fases, com os componentes químicos DACTP11, AC10COONa, e DiO, como mostrado ...

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Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

Uma nanopartícula cristal líquido (LCNP) nanocarrier é utilizado como um veículo para a libertação controlada de uma carga hidrofóbico à membrana plasmática de células vivas.

Targeted Plasma Membrane entrega de um hidrofóbica Carga encapsulado em um cristal líquido nanopartículas Transportador

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Research

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