Name: qtl mapping and crispr/cas9 editing to identify a drug resistance gene in toxoplasma gondii
Uploaded: 2017-06-22T12:30:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii at JoVE.com

Vorremmo ringraziare L. David Sibley e Asis Khan per il loro contributo alla pubblicazione originale su cui si basano questi protocolli. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health AI108721.

The authors declare that they have no competing financial interests.

Questi protocolli presentano diversi metodi che quando combinati permettono l&#39;identificazione di un gene di resistenza alla droga in T. gondii . Due in particolare erano parte integrante del progetto, il metodo relativamente stagionato della mappatura QTL e il metodo recentemente sviluppato di CRISPR / Cas9 gene edit. Lander e Botstein hanno pubblicato nel 1989 la loro carta influente che dimostra la mappatura QTL che correla loci genetici con i fenotipi 36 . Più recentemente nel 2012, Dounda e Charpentier descrivono il sistema di editing CRISPR / Cas9 in Streptococcus pyogenes 22, che è stato rapidamente adattato come strumento genetico in molti modelli diversi, tra cui T. gondii 13 , 17 . Entrambi i metodi sono stati utili qui, dove il mapping QTL ha definito il locus contenente la mutazione della resistenza al farmaco che è stato ultimamente identificato utilizzando il rilevamento SNP basato su WGS e la modifica CRISPR / Cas9 mi ha fornito<html> Ans per confermare SNR1 è il gene di resistenza alla droga di sinefungin. Il cross ME49-FUDR r X VAND-SNF r è stato sviluppato originariamente per interrogare un fenotipo di virulenza 19 , ma anche i ceppi genitori avevano una differenza fenotipica aggiuntiva per la quale il gene causale non era noto, resistenza sinefungina nel genitore VAND. Ciò evidenzia un vantaggio delle croci in quanto possono essere ripristinate quando si osservano ulteriori differenze fenotipiche nei genitori. Questo è stato il caso di un&#39;altra croce di Toxoplasma , tipo 2 x tipo 3, in cui diversi geni coinvolti nella virulenza sono stati trovati mappando più fenotipi 37 , 38 , 39 , 40 . Ad oggi, quattro diverse croci T. gondii sono state descritte e utilizzate per mappare i geni responsabili dei fenotipiSs = &quot;xref&quot;&gt; 8 , 37 , 41 , 42 , che hanno il potenziale per essere riutilizzati per mappare nuovi fenotipi per i quali la base genetica è sconosciuta. Al di là di queste linee, sono stati sequenziati i genomi per 62 ceppi T. gondii che rappresentano la diversità genetica globale nota 43 . Nuove croci potrebbero essere fatte da questa piscina per ceppi che si differenziano in fenotipi interessanti. Avendo esaltato i vantaggi della mappatura QTL, bisogna dire che generare una croce non è un&#39;impresa minore. Esistono altri metodi che possono essere usati per identificare i geni causali. Una tecnica potente usa la mutagenesi chimica per creare mutanti che possono essere sottoposti a screening per fenotipi. Per trovare il gene causale, i mutanti possono essere completati con librerie cosmid 44 o metodi di resequencing del genoma possono essere utilizzati per trovare la mutazione causale 45 . Per moSu questo, vedi due articoli di JoVE di Coleman et al. E Walwyn et al. Che contraddistinguono questi approcci 46 , 47 . Molti dei passaggi che conducono all&#39;identificazione della mutazione causale SNF r (Protocolli 2 e 3) si basano su metodi computazionali condotti con software che è liberamente disponibile per uso accademico. Comandi dettagliati per ogni passaggio sono forniti e quando eseguiti con i file corretti consentiranno all&#39;utente di ricreare i set di dati necessari per trovare il SNF causale SNP. Tieni presente che alcune delle sintassi nei comandi si riferiscono a nomi di file o struttura di directory ($ PATH) che possono essere modificati alla preferenza dell&#39;utente. Sebbene i comandi qui riportati certamente non esauriscano le modalità di analisi di una croce con l&#39;analisi QTL e l&#39;identificazione SNP basata su WGS, sono abbastanza complesse per ripetere l&#39;esperimento descritto in questo articolo e permettere all&#39;utente di diventare m<html> Conoscere come questi approcci vengono utilizzati in modo passato. Sebbene la mappatura QTL e la rilevazione SNP basata sulla sequenza WGS fossero sufficienti per identificare un gene SNF r , ulteriori esperimenti sono necessari per confermare il suo ruolo nella resistenza ai farmaci. Ciò può essere dimostrato in modo convincente attraverso le tecniche di rottura o eliminazione del gene, entrambe che possono essere ottenute usando il montaggio di gene CRISPR / Cas9. I metodi dettagliati per utilizzare CRISPR / Cas9 per generare mutazioni indel o inserire i costrutti transgenici in un gene bersaglio in T. gondii sono dati. La specificità di targeting che CRISPR / Cas9 fornisce aumenta l&#39;efficienza dell&#39;editing genico rispetto ai metodi tradizionali. Inoltre, questo aumento efficacemente ha permesso di utilizzare ceppi non adattati a laboratorio per studi genetici precedentemente difficili da modificare 13 . Anche se nella sua infanzia, CRISPR / Cas9 è già stato usato per causare interruzioni genicheI geni del 17 , 18 , 48 , 49 , tag 17 , 18 , 48 , 49 e taggono i geni 16 , 19 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 in T. gondii , promettendo di essere uno strumento utile Per molti altri studi in futuro. La scoperta che l&#39; inattivazione SNR1 porta alla resistenza allo sinefungina rende il loco SNR1 un luogo promettente per l&#39;inserimento di transgene o il complementamento genetico. Per massimizzare il successo dell&#39;utilizzo di target genico mediato da CRISPR / Cas9 per dirigere l&#39;integrazione del transgene nel SNR1 , occorre considerare i seguenti aspettiRosso durante la progettazione sperimentale. Innanzitutto, è consigliabile utilizzare un marker di selezione per essere incluso nel costrutto transgenico per aumentare l&#39;efficienza della costruzione del ceppo. Se è incluso un marker di selezione, è possibile utilizzare sia la selezione positiva che negativa, con il risultato che quasi il 100% dei parassiti doppiamente selezionati è transgenico con il GOI integrato al loco SNR1 . Al contrario, se il costrutto transgenico non contiene ulteriori caratteristiche selezionabili e si basa sulla selezione negativa al SNR1 locus, l&#39;efficienza di una transgenesi riuscita dipende in larga misura dall&#39;efficienza della cotransfezione del plasmide CRISPR e del costrutto transgenico. In secondo luogo, sebbene l&#39;integrazione specifica del sito di un frammento di DNA non omologo mediata da CRISPR / Cas9 è spesso utilizzata per il complementamento e la trasgenesia, si deve notare che l&#39;orientamento dell&#39;inserzione non può essere garantito in casi come la direzione è possibile. Questo può causare problemiMs ad alcune applicazioni. Ad esempio, per completare un mutante con diversi alleli del gene, è difficile garantire che tutti gli alleli siano inseriti nello stesso orientamento e le discrepanze nell&#39;orientamento possono causare differenze di espressione. Per questo tipo di applicazione, sono consigliati i costrutti di DNA con sequenze omologhe al loco SNR1 , che guidano l&#39;orientamento adeguato dell&#39;integrazione ( Figura 6 ). In terzo luogo, durante la trasfezione, il rapporto tra il plasmide CRISPR e la molecola del DNA transgenico è fondamentale per una buona costruzione di ceppi transgenici. Questo rapporto deve essere regolato in base alle strategie di selezione. Sono consigliate le seguenti linee guida: 1) Se il costrutto transgenico contiene un marcatore resistente alla droga e il farmaco corrispondente è l&#39;unica selezione utilizzata per generare parassiti transgenici, vale a dire la sinefungina non viene utilizzata, il rapporto molare suggerito tra il trapianto transgenico e il plasma CRISPRId è 1: 5. Utilizzando più plasmide CRISPR in questo caso aumenta la probabilità che i parassiti riceventi del costrutto transgenico riceveranno anche il plasmide CRISPR, quindi i parassiti resistenti al farmaco hanno maggiori probabilità di avere il marker inserito nel sito di targeting CRISPR. Se il rapporto è invertito, la maggior parte dei parassiti che ricevono il costrutto transgenico non otterrà il plasmide CRISPR. Di conseguenza, la stragrande maggioranza dei parassiti resistenti alla droga ottengono il costrutto transgenico attraverso l&#39;integrazione casuale non associata all&#39;inserimento specifico del sito mediato da CRISPR / CAS9. 2) Se il costrutto transgenico contiene un marker resistente alla droga e il farmaco corrispondente viene utilizzato insieme a sinefungina per la selezione dei parassiti transgenici, il rapporto molare suggerito tra il trapianto transgenico e il plasmide CRISPR è 1: 1. Questa strategia fornisce la massima efficienza della costruzione di ceppi transgenici. 3) Se il costrutto transgenico non contiene un creatore selezionabile, basandosi su selezione negativaDa sinefungina da solo per ottenere parassiti transgenici, il rapporto molare suggerito tra il trapianto transgenico e il plasmide CRISPR è di 5: 1. La logica di questo progetto è la stessa che nella prima linea guida sopra riportata. Poiché sia ​​la pirimetamina sia la sinefungina sono state utilizzate per la selezione nel protocollo 5, il rapporto tra il gene DHFR * mini e il SNR1 targeting CRISPR è stato impostato come 1: 1. Considerati insieme, i metodi illustrati qui presentano un livello di dettaglio che non è stato possibile trasmettere nella pubblicazione originale che ha identificato SNR1 2 . Questi protocolli; In particolare, la sintassi della riga di comando, il layout sequenziale dei programmi utilizzati e l&#39;uso di CRISPR / Cas9 dovrebbero aiutare gli sforzi futuri per identificare nuovi geni responsabili dei fenotipi.

La gamma host determina l&#39;estensione della prevalenza dei parassiti. Alcuni parassiti hanno requisiti specifici per l&#39;host che limitano l&#39;area da cui sono trovati, altri sono generalisti. Un tale generalista è Toxoplasma gondii ( T. gondii) . Questo parassita si trova in tutto il mondo in quanto può infettare tutti i mammiferi e molti uccelli. Gli esseri umani sono anche suscettibili e si stima che circa un terzo della popolazione mondiale sia stato infettato. Fortunatamente, una solida risposta immunitaria controlla normalmente la crescita del parassita, ma in situazioni in cui il sistema immunitario è compromesso il parassita può crescere non controllato e causare malattie, spesso encefaliche. Inoltre, questo parassita può causare malattie congenite se in precedenza le donne non infette sono infettate durante la gravidanza in quanto non hanno memoria immune per limitare rapidamente la diffusione del parassita. Inoltre, c&#39;è un onere della tosoplasmosi oculare che può causare la perdita della vista 1 . Per questi reasoIl T. gondii è diventato un centro di studio e, a causa dei molti metodi molecolari sviluppati per il suo studio, un modello per i parassiti Apicomplexan. Due metodi che verranno discussi qui sono il mapping Quantitativo Trait Locus (QTL) e Ripetizioni palindromiche brevi intervallate regolarmente (CRISPR) / Cas9 gene edit. La mappatura QTL e l&#39;editing CRISPR / Cas9 sono, rispettivamente, avanti e invertire gli approcci genetici utilizzati negli studi precedenti per identificare e / o caratterizzare i geni di T. gondii virulenza. Qui, questi metodi sono combinati per identificare e confermare la funzione di una resistenza di sinefungina (SNF r ), TgME49_290860, ei suoi ortologhi (annotato come SNR1 ) 2 . Anche se T. gondii può infettare un&#39;ampia varietà di host medi, deve passare e infettare le cellule epiteliali intestinali di un felid per completare il ciclo di vita. I gatti sono gli ospiti definitivi del parassita dove i sSi producono stadi esuali e si verifica la ricombinazione genetica attraverso la meiosi. Per condurre uno studio QTL bisogna creare una croce genetica e nel caso del toxoplasma si intende passare due ceppi di parassita diversi che differiscono in un tratto fenotipico, le macchie genitali, attraverso un gatto per produrre la progenie ricombinante 3 . Prima di essere alimentato ai gatti, i ceppi genitori sono resi resistenti a farmaci separati per consentire un&#39;identificazione più efficace dei ricombinanti mediante la selezione doppia della droga della progenie 4 . A tal fine sono stati utilizzati tre farmaci in T. gondii ; Fluorodioxibosio (FUDR) per il quale la proteina dell&#39;urina fosforibosilico ( UPRT ) è il gene di resistenza 5 , adenosina arabinoside (ARA) per la quale l&#39;adenosina-chinasi ( AK ) è il gene di resistenza 6 e sinefungina (SNF) per la quale il gene di resistenza è sconosciuto 7 . Sono state diverse croci geneticheCreato per T. gondii , ma solo i 24 segmenti del cross ME49-FUDR r X VAND-SNF sono stati genotipizzati usando il sequenziamento intero del genoma (WGS) 8 . Questo ha aperto la possibilità di mappare e identificare il gene di resistenza SNF usando questa croce come il genitore VAND è stato reso resistente alla sinefungina dalla mutagenesi chimica del ceppo VAND (SNF s ) sensibile alla droga e il genoma di riferimento VAND è stato sequenziato utilizzando il VAND- SNF s che permettono l&#39;identificazione di tutti i polimorfismi tra il gene WGS e il genoma di riferimento VAND-SNF, inclusa la mutazione parentale VAND-SNF r ereditata che rese alcune delle proteine ​​del sinefungina del progenie. Per identificare il polimorfismo nucleotidico singolo causale (SNP) nelle progenie di SNF, possono essere utilizzate diverse risorse open source basate su calcolo per analizzare i dati. Per creare la mappa genetica per il ME49-FUDR r X VAND-SNF r attraversa la suite software REDHORSE 9 che utilizza l&#39;allineamento WGS dei genitori e della progenie per rilevare accuratamente le posizioni genomiche dei crossover genetici. Queste informazioni di mappatura possono essere combinate con i dati fenotipici (SNF r nella progenie) per formattare un set di dati compatibile con il pacchetto &#39;qtl&#39; 10 nel software di programmazione statistica R dove una scansione QTL può essere eseguita per rivelare significativi loci correlati con il fenotipo. Per identificare il SNP causale localizzato all&#39;interno del loco QTL, le letture WGS della progenie possono essere allineate individualmente al genoma VAND genetico sensibile allo sinefungine utilizzando il programma di allineamento Bowtie 2 11 da cui possono essere chiamati SNP utilizzando il programma di chiamata variante Variper mpileup2snp 12 . Usando questi SNP, il loco QTL può essere scansionato per i polimorfismi presenti nel SNF r, ma nonNella progenie di SNF. Con il SNP causale identificato nella regione di codifica di un gene, la modifica genetica del gene SNF r del candidato può essere eseguita in un ceppo SNF s per verificare la funzione di resistenza al farmaco. Il sistema di editing del genoma CRISPR / Cas9 è stato recentemente fondato in Toxoplasma 13 , che ha aggiunto importanti strumenti per l&#39;esplorazione della complessa biologia di questo parassita, in particolare per gli studi genetici in ceppi adattati non in laboratorio. A causa dell&#39;attività altamente attiva di adesione a non end omologo (NHEJ) nelle cellule di Toxoplasma WT, è difficile ottenere una modifica genomica mirata dal momento che il DNA introdotto esogeno è integrato casualmente nel genoma ad altissima frequenza 14 . Per aumentare il tasso di successo della modifica specifica del locus, sono stati impiegati approcci diversi per aumentare l&#39;efficienza della ricombinazione omologa e / o diminuireE Attività NHEJ 15 , 16 . Uno di questi approcci è il sistema CRISPR / Cas9. Rispetto ad altri metodi, il sistema CRISPR / Cas9 è efficiente per introdurre modifiche specifiche del sito e è facile da progettare 13 , 17 , 18 . Inoltre, può essere utilizzato in qualsiasi ceppo di Toxoplasma senza ulteriori modifiche al parassita 13 , 19 . Il sistema CRISPR / Cas9 nasce dal sistema immunitario adattativo di Streptococcus pyogenes , che lo usa per difendere l&#39;invasione di elementi genetici mobili come i fagi 20 , 21 , 22 . Questo sistema utilizza l&#39;enzima Cas9 per l&#39;endonucleasi del DNA guidato dall&#39;RNA per introdurre la rottura del DNA a doppio filamento (DSB) nel bersaglio,Iris o dal NHEJ errato per inattivare i geni bersaglio attraverso corti mutazioni indel, o da una ricombinazione diretta da omologia per alterare il locus di destinazione esattamente come progettato 23 , 24 . La specificità di bersaglio è determinata da una piccola molecola di RNA denominata singola RNA guida (gRNA), che contiene una sequenza di 20 nt progettata individualmente che ha 100% omologia al DNA di destinazione 22 . La molecola del gRNA contiene anche delle firme riconosciute da Cas9 che guidano la nuclease al sito di destinazione, che include un particolare motivo adiacente Protospacer (PAM, la sequenza è &#39;NGG&#39;) 25 , 26 . Pertanto, la molecola di gRNA e la sequenza PAM lavorano insieme per determinare il sito di scissione Cas9 nel genoma. Si può facilmente cambiare la sequenza gRNA per individuare siti diversi per la scissione. Quando il sistema CRISPR / Cas9 è stato sviluppato per la prima volta in ToxopLasma, è stato utilizzato un singolo plasmide che esprime la nuclease Cas9 e la molecola di gRNA per introdurre DSB nel punto di destinazione 13 , 17 . È stato dimostrato che il sistema CRISPR / Cas9 aumenta drasticamente l&#39;efficienza della modificazione genomica del sito, non solo mediante ricombinazione omologa, ma anche integrazione non omologa del DNA esogeno 13 . Lo fa in ceppi di wildtype che contengono attività NHEJ. Pertanto, questo sistema può essere utilizzato in sostanzialmente qualsiasi ceppo di Toxoplasma per un efficiente editing del genoma. In un esperimento tipico, il plasmide specifico target CRISPR e il frammento DNA utilizzato per modificare l&#39;obiettivo vengono co-trasfettati in parassiti. Se il frammento di DNA utilizzato per modificare il bersaglio contiene sequenze omologhe al luogo di destinazione, la ricombinazione omologa può essere utilizzata per riparare il DSB introdotto da CRISPR / Cas9 per consentire una precisa modifica del bersaglio. D&#39;altra parte, se l&#39;intFrammento di DNA generato non contiene sequenze omologhe, può ancora essere integrato nel sito di targeting CRISPR / Cas9. Questi ultimi sono spesso utilizzati per interrompere i geni mediante l&#39;inserimento di marcatori selezionabili o per completare mutanti a loci che consentono la selezione negativa 13 . Qui il loco SNR1 serve come esempio per mostrare come CRISPR / Cas9 può essere utilizzato per la rottura genica e la generazione di parassiti transgenici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1146">
	<tbody>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">T25 flasks</td>
			<td style="width:168px;">Corning</td>
			<td style="width:301px;">430639</td>
			<td style="width:439px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">HFF</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC-1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">T. gondii ME49 strain</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>50840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">T. gondii VAND strain</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PRA-344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">DMEM (No Sodium Bicarbonate)</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>12800017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Fetal Bovine Serum Premium Grade</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">L-Glutamine&#160; 200mM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Gentamicin (10 mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">Cell Scraper for Flasks</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10062-904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe 10ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Blunt needles 22g x 1&#34;</td>
			<td>BRICO Products</td>
			<td>BN2210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Nuclepore Filter 3.0 &#181;m, 25mm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>110612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Swin-Lok Filter Holder 25mm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>420200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Hemacytometer</td>
			<td>Propper MFG</td>
			<td>90001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Sinefungin</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>380-070-M001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">R&#160;</td>
			<td>The R Foundation</td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">J/qtl</td>
			<td>The Churchill Group</td>
			<td>http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bowtie2</td>
			<td>John Hopkins University</td>
			<td colspan="2">http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NCBI SRA Toolkit</td>
			<td>NCBI</td>
			<td colspan="2">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=toolkit_doc</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SAMtools</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>http://www.htslib.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VarScan</td>
			<td>Washington University, St Louis</td>
			<td>http://varscan.sourceforge.net/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MUMmer</td>
			<td>JCVI &#38; Univ Hamburg</td>
			<td>http://mummer.sourceforge.net/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #54467</td>
			<td>T. gondii CRISPR plasmid to cut the UPRT gene</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">pSAG1::CAS9-U6::sg290860-6</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #59855</td>
			<td>T. gondii CRISPR plasmid to cut the TG*_290860 SNR1 gene</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">pUPRT::DHFR-D</td>
			<td style="width:168px;">Addgene</td>
			<td style="width:301px;">Plasmid #58528</td>
			<td style="width:439px;">Template for DHFR* mini gene</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E0552S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">NanoDrop 2000</td>
			<td style="width:168px;">Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td style="width:439px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">LB Broth</td>
			<td style="width:168px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:301px;">DF0446-07-5</td>
			<td style="width:439px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>746495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">Adenosine triposhpate (ATP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">L-glutathione (GSH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:239px;">ECM 830 Electroporation System</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Electroporation Cuvette&#160; 4 mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:301px;">45-0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Crytal Violet</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td style="width:301px;">B21932-14</td>
			<td style="width:439px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">6-well TC plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:301px;">353046</td>
			<td style="width:439px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">24-well TC plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353935</td>
			<td style="width:439px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">Cover glass 12mm round</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89015-724</td>
			<td style="width:439px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">96-well TC plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Gibson Assembly Cloning Kit (Multi-fragment)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E5510S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Q5 High-Fidelity Polymerase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pyrimethamine</td>
			<td>TCI AMERICA</td>
			<td>P2037-1G</td>
			<td>Use cuation when using pyrimethamine resistant parasites - see Protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qtl mapping and crispr/cas9 editing to identify a drug resistance gene in toxoplasma gondii

La conoscenza scientifica è intrinsecamente legata alle tecnologie e ai metodi disponibili. Questo articolo presenta due metodi che consentiranno l&#39;identificazione e la verifica di un gene di resistenza al farmaco nel parassita Apicomplexan Toxoplasma gondii , il metodo del mapping quantitativo trait locus (QTL) utilizzando una mappa genetica a base di sequenza intero genoma (WGS) e il metodo Di ripetizioni palindromiche brevi regolarmente clusterizzate (CRISPR) / editing genico basato su Cas9. L&#39;approccio della mappatura QTL consente di verificare se esiste una correlazione tra una regione genomica e un fenotipo. Sono necessari due set di dati per eseguire una scansione QTL, una mappa genetica basata sulla progenie di una croce ricombinante e un fenotipo quantificabile valutato in ciascuna delle prole di quella croce. Questi set di dati vengono quindi formattati per essere compatibili con il software R / qtl che genera una scansione QTL per identificare significativi loci correlati con il fenotipo. Anche se questo può molto restringere la ricerca wIndice di possibili candidati, QTL span regioni contenenti un certo numero di geni da cui il gene causale deve essere identificato. Avere WGS della progenie era critico per identificare la mutazione causale della resistenza al farmaco a livello del gene. Una volta identificata, la mutazione del candidato può essere verificata mediante manipolazione genetica di parassiti sensibili alla droga. Il metodo più facile ed efficace per modificare geneticamente T. gondii è il sistema CRISPR / Cas9. Questo sistema è costituito da soli 2 componenti sia codificati su un singolo plasmide, un singolo RNA guida (gRNA) contenente una sequenza di 20 bp complementari al target genomico e l&#39;endonucleasi Cas9 che genera un doppio filamento DNA break (DSB) al bersaglio, La cui riparazione consente l&#39;inserimento o la cancellazione di sequenze intorno al sito di rottura. Questo articolo fornisce protocolli dettagliati per utilizzare strumenti di editing del genoma CRISPR / Cas9 per verificare il gene responsabile della resistenza sinfungina e per costruire parassiti transgenici.

Questo articolo descrive in dettaglio diversi metodi che possono essere usati in successione per identificare un gene responsabile della resistenza ai farmaci ( Figura 1 ). I 24 segmenti del cross ME49-FUDR r X VAND-SNF sono stati valutati per resistenza alla sinefungina farmacologica come descritto nel protocollo 1. Utilizzando la mappa genetica e il fenotipo SNF r della progenie, una scansione QTL è stata eseguita in R / Qtl - Protocollo 2 ( Figura 2 ). Ciò ha portato ad un picco significativo sul cromosoma IX che copre circa 1 Mbp. È in questa regione che si trova la mutazione causale. Per identificare la mutazione causale, le istruzioni WGS dalla progenie sono state allineate al genoma di riferimento di VAND-SNF utilizzando Bowtie2 - Protocollo 3.1, SNP sono stati chiamati utilizzando VarScan mpileup2snp - Protocollo 3.2 e il loco QTL nel genoma VAND è stato identificato utilizzando MUMmer - ProtoCOl 3.3. Le SNP di progenie all&#39;interno del loco QTL sono state estratte e scansionate per un modello in cui la progenie di SNF ha un SNP e le SNF s non, che è fattibile perché i SNP di progenie sono stati ottenuti in confronto al genoma di riferimento di VAND-SNF ( Figura 3 ) . Solo un SNP corrisponde a questo modello che produce un codone di arresto precoce in un gene trasportatore aminoacidico presunto denominato SNR1 . La conferma che SNR1 è il gene di resistenza SNF r è stata eseguita usando il sistema CRISPR / Cas9. È stato fatto un nuovo plasmide CRISPR / Cas9 progettato per la modifica del gene T. gondii contenente un gRNA destinato al gene SNR1 vicino alla mutazione di SNF r identificata nella progenie - Protocollo 4 ( Figura 4A ). Il SNR1 targeting CRISPR / Cas9 è stato elettroporato in un ceppo di parete WT di SNF e mutanti resistenti sono stati ottenuti quando il cultoUfficio in 0,3 μM sinefungina. Nessun parassiti SNF r sono stati ottenuti quando sono stati electroporati con il targeting UPRT CRISPR / Cas9. Diversi mutanti SNF r CRISPR sono stati clonati e la regione intorno all&#39;obiettivo SNR1 gRNA è stata sequenziata. Ogni mutante ha avuto un indel che ha interrotto la sequenza di codifica del gene SNR1 ( Figura 4B ). Questo metodo può anche essere utilizzato per inserire un costrutto di targeting nel loco SNR1 tramite NHEJ ( Figura 5), o da HR ( Figura 6 ) - Supplemento File 2 . <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig1.jpg" /> Figura 1: flusso di lavoro schema per gli esperimenti descritti nei protocolli. Le fasi principali per identificare e confermare il gene SNF r utilizzando il cross ME49-FUDR r X VAND-SNF sono mostrate con riferimento ai protocolli appropriati delineati inIl suo articolo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig2.jpg" /> Figura 2: Comandi R / qtl per eseguire la scansione QTL sul fenotipo SNF. I comandi descritti nel protocollo 2 sono stati eseguiti in R utilizzando il pacchetto qtl. Sono mostrati i comandi e la trama rappresentativi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig3.jpg" /> Figura 3: Posizione del SNP causale. Le letture WGS di progenie sono state allineate al genoma di riferimento di VAND-SNF con Bowtie 2, le SNP sono state chiamate con VarScan e il corrispondente<html> Locus VAND QTL identificato con MUMmer. I SNP situati all&#39;interno del loco QTL sono stati importati in un foglio di calcolo e il SNP causale è stato identificato. La progenie di SNF (giallo), la progenie di SNF (verde), SNF r SNP (rosso) (vedere il file di dati 3 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig4.jpg" /> Figura 4: Confermare SNR1 come SNF r Gene utilizzando CRISPR / Cas9. ( A ) CRISPR / Cas9 indotto mutazioni indel (verde) nel SNR1 locus. ( B ) Indel rappresentativi in SNR1 causati da due diversi plasmidi SNR1 specifici CRISPR (rispettivamente C5 e C6). RH è il ceppo WT e C5 e C6 sono mutanti SNF r . (B è preso dal riferimentoS = &quot;xref&quot;&gt; 2). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig5.jpg" /> Figura 5. Mutagenesi inserita utilizzando CRISPR / Cas9. ( A ) Inserimento di geni complementari o transgenici nel loco SNR1 mediante l&#39;integrazione specifica del sito mediata da CRISPR / Cas9. Due possibili orientamenti del gene DHFR * mini inserito ei primer utilizzati per l&#39;identificazione, F1 / 2 e R1 / 2 rappresentano i siti di priming di oligos utilizzati in PCR diagnostici. ( B ) PCR diagnostici di un clone snr1 :: DHFR * , RH viene utilizzato come controllo WT. PCR del GRA1p è incluso come controllo che controlla la qualità del DNA genomico come template. Gli asterischi indicano corsie con bande non specifiche (la figura 5B è presa dal riferimentoCe 2 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig6.jpg" /> Figura 6: Knockout di geni utilizzando CRISPR / Cas9. Un design classico per la sostituzione del gene homologo mediato da CRISPR / Cas9 in T. gondii . In questo caso l&#39;orientamento del transgene inserito è fisso. F1 / R1, F2 / R2 e F3 / R3 rappresentano i siti di priming di oligos utilizzati in PCR diagnostici. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> File di dati 1: ME49-FUDR r X VAND-SNF r File traccia fO utilizzare in formato R / qtl, &quot;csv&quot;. Un file .csv che può essere caricato in R / qtl con l&#39;opzione format = &quot;csv&quot;. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_1.csv" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a> File di dati 2: (testi chrid, genotype txt, markerpos.txt, mname.txt, phenonames.txt e phenos.txt). ME49-FUDR r X VAND-SNF r File Cross per l&#39;uso in formato R / qtl, &quot;gary&quot;. Sei file txt che possono essere caricati in R / qtl con l&#39;opzione format = &quot;gary&quot;. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_2.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a> File di dati 3. Foglio di calcolo con SNP di progenie su SNF r <stronG&gt; QTL Locus. Contiene un foglio di lavoro con i SNP di progenie e un secondo foglio di lavoro con i dati fenotipici dei genitori e della progenie della croce. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_3.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a> Supplementare File 1: Ulteriori dettagli del protocollo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Supplementary_File_1_-_101916.docx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a> Supplemento File 2: Protocollo 5 - Utilizzo della selezione negativa presso il SNR1 Locus per la compilazione genetica o la costruzione di tensione transgenica. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Supplementary_File_2_-_101916.docx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a></a>

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QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Sono mostrati i dettagli su come mappare QTL con una mappa genetica basata su una sequenza intero di genoma può essere utilizzata per identificare un gene di resistenza alla droga in Toxoplasma gondii e come questo può essere verificato con il sistema CRISPR / Cas9 che modifica in modo efficiente un obiettivo genomico, in questo caso il Gene di resistenza alla droga.

Mapping QTL e modifica CRISPR / Cas9 per identificare un gene di resistenza alla droga in<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

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Genetica

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