Name: qtl mapping and crispr/cas9 editing to identify a drug resistance gene in toxoplasma gondii
Uploaded: 2017-06-22T12:30:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii at JoVE.com

Bu protokollerin dayandığı orijinal yayına yaptıkları katkılarından ötürü L. David Sibley ve Asis Khan&#39;a teşekkür etmek isteriz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü AI108721 tarafından finanse edildi.

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu protokoller, kombine edildiğinde T. gondii&#39;de bir ilaç direnç geninin tanımlanmasına izin veren çeşitli yöntemler sunmaktadır. Özellikle ikisi, projeye ayrılmaz, nispeten tecrübeli QTL haritalama yöntemi ve yakın zamanda geliştirilen CRISPR / Cas9 gen düzenleme yöntemi. Lander ve Botstein 1989&#39;da genetik lokusları fenotiplerle ilişkilendiren QTL haritalamasını gösteren etkili gazetelerini yayınladılar. Daha yakın zamanda 2012&#39;de Dounda ve Charpentier, Streptococcus pyogenes 22&#39;deki CRISPR / Cas9 düzenleme sistemini, T. gondii 13 , 17 dahil olmak üzere birçok farklı modelde hızla genetik bir araç olarak uyarlanmıştı. Burada, QTL haritalamasının sonuçta WGS tabanlı SNP tespiti ile tanımlanan ilaç direnci mutasyonunu içeren lokusunu tanımladığı ve CRISPR / Cas9 düzenleme yoluyla sağlanan iki usul de faydalıydı<html> SNR1&#39;in sinefungin ilaç direnç geni olduğunu onaylamak için. ME49-FUDR r X VAND-SNF r çapraz 8 orijinal olarak bir virulans fenotipi 19&#39;u sorgulamak için geliştirildi, ancak ebeveyn suşlarının, nedensel genin bilinmediği ek fenotipik bir farka, VAND ebeveynde sininefungine direncine sahip olduğu da oldu. Bu, ebeveynlerde ek fenotipik farklılıklar görüldüğünde, yeniden melezleştirilebilmeleri için haçların bir yararı olduğunu vurgular. Virülansla ilgili birçok genin 37 , 38 , 39 , 40lu çoklu fenotipleri haritalamayla bulunduğu başka Tip Toxoplasma çapraz, tip 2 x tip 3 için durum böyledir. Bugüne kadar, dört farklı T. gondii haçı tanımlanmış ve fenotiplerden sorumlu genleri haritalamak için kullanılmıştırSs = &quot;xref&quot;&gt; 8 , 37 , 41 , 42 , bunların hepsi, genetik temel bilinmeyen yeni fenotipleri haritalamak için tekrar kullanılma potansiyeline sahiptir. Bu çizgiler boyunca, bilinen global genetik çeşitliliği temsil eden 62 T. gondii suşunun genomları sıralanmıştır 43 . İlginç fenotiplerde farklılık gösteren suşlar için bu havuzdan yeni çaprazlar yapılabilir. QTL haritalamanın avantajlarını vurguladıktan sonra, bir haç oluşturulmasının küçük bir taahhüt olmadığı söylenebilir. Nedensel genleri tanımlamak için kullanılabilecek diğer yöntemler de vardır. Güçlü bir teknik, fenotipler için taranabilen mutantlar oluşturmak için kimyasal mutajenez kullanır. Nedensel geni bulmak için, mutantlar ya kosmid kütüphaneleri 44 ile tamamlanabilir ya da nedensel mutasyonu bulmak için genom resequencing yöntemleri kullanılabilir 45 . Ay içinColeman ve arkadaşlarının yaptığı iki JoVE makalesine bakın . Ve Walwyn ve ark. Bu yaklaşımları özetleyen 46 , 47 . Nedensel SNF r mutasyonunun tanımlanmasına yol açan adımların çoğu (Protokoller 2 ve 3), akademik kullanım için serbestçe temin edilebilen yazılımlarla yapılan hesaplama yöntemlerine güvenir. Her basamak için ayrıntılı komutlar sağlanır ve uygun dosyalarla çalıştırıldığında, kullanıcının nedensel SNF r SNP&#39;yi bulmak için gerekli olan veri kümelerini yeniden oluşturmasına izin verir. Komutlardaki bazı söz dizimlerinin, kullanıcı tercihine göre değiştirilebilen dosya adlarına veya dizin yapısına ($ PATH) işaret ettiğini unutmayın. Burada verilen komutlar kesinlikle ÇTL analiz ve WGS tabanlı SNP tanımlama ile bir haç analiz yollarını tüketmemesine rağmen, bu makalede açıklanan deney tekrarlamak için yeterince kapsamlı ve kullanıcı m<html> Bu yaklaşımların adım adım bir şekilde nasıl kullanıldığını bilen cevher. QTL haritalama ve WGS dizisi tabanlı SNP bulgusu, bir aday SNF r genini tanımlamak için yeterli olmasına rağmen, ilacın direncindeki rolünü doğrulamak için ek deneylere ihtiyaç vardır. Bu, ikisi de CRISPR / Cas9 gen editörü kullanılarak elde edilebilen, gen parçalanması veya nakavt teknikleri vasıtasıyla ikna edici şekilde gösterilebilir. CRISPR / Cas9&#39;un Indel mutasyonları üretmek veya T. gondii&#39;de bir hedef genin içine transgenik yapılar yerleştirmek için ayrıntılı yöntemleri verilmiştir. CRISPR / Cas9&#39;un sunduğu hedefleme özgüllüğü, geleneksel yöntemlere kıyasla gen düzenleme verimliliğini artırır. Ayrıca, bu, verimli bir şekilde, daha önce değiştirilmesi zor olan genetik çalışmalar için laboratuarda uyarlanmamış suşların kullanılmasını mümkün kılmıştır 13 . Bebeklik döneminde, CRISPR / Cas9 zaten genin kesintiye uğraması için kullanılmıştırLass = &quot;xref&quot;&gt; 2 , 13 , 17 , 18 , 48 , 49 , genleri 17 etiketleyin ve T. gondii&#39;de 16 , 19 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 gen nakavtlerini yapın , Gelecekteki diğer birçok çalışma için. SNR1&#39;in inaktivasyonunun sinefungin direncine yol açtığının keşfi, SNR1 lokusunu, transgen takılması veya genetik tamamlama için umut verici bir yer haline getirir. Transgenin SNR1 lokusuna entegrasyonunu yönlendirmek için CRISPR / Cas9 aracılı gen hedeflemenin başarısını en üst düzeye çıkarmak için aşağıdaki hususlar dikkate alınmalıdırDeneysel tasarım sırasında kırmızı. İlk olarak, bir seçim markeri, suş yapımının etkinliğini arttırmak için transjenik yapıya dahil edilmesi önerilir. Bir seçim işareti dahil edilirse, hem pozitif hem negatif seçim kullanılabilir, böylece çiftli seçilen parazitlerin neredeyse% 100&#39;ü, SNR1 lokusunda entegre edilmiş GOI ile transgenik olur. Buna karşılık, eğer transjenik yapı ek seçilebilir özellikler içermezse ve SNR1 lokusundaki negatif seçime dayanıyorsa, başarılı transgenesisin etkinliği büyük ölçüde CRISPR plasmidinin ve transgenik yapının kotransfeksiyonunun verimliliğine bağlıdır. İkincisi, homolog olmayan bir DNA fragmanının CRISPR / Cas9 aracılı bölgeye özgü entegrasyonu sıklıkla tamamlama ve transgenez için kullanılır, ancak, bu tür durumlarda her iki yönde de olabilir, ekleme yöneliminin garanti edilemeyeceği unutulmamalıdır. Bu, probleme neden olabilirMs bazı uygulamalar için. Örneğin, farklı gen alellerine sahip bir mutantı tamamlamak için, tüm alellerin aynı yönde yerleştirildiğinden ve oryantasyonda tutarsızlıkların ekspresyon farklılıklarına neden olabileceğinden emin olmak zordur. Bu tür uygulama için, uygun entegrasyon yönelimini sürdürecek SNR1 lokusuna homolog diziler içeren DNA yapıları önerilir ( Şekil 6 ). Üçüncü olarak, transfeksiyon sırasında, CRISPR plasmid ile transgenik DNA molekülü arasındaki oran, başarılı bir transgenik suş yapımı için kritik önem taşır. Bu oran seçim stratejilerine göre ayarlanmalıdır. Aşağıdaki yönergeler önerilir: 1) Transgenik yapı bir ilaca dirençli işaretleyici içeriyorsa ve ilgili ilaç transgenik parazitleri üretmek için kullanılan tek seçimse, yani sinefungin kullanılmazsa, transjenik yapı ile CRISPR plazması arasındaki önerilen molar oranKimlik 1: 5. Bu durumda daha fazla CRISPR plazmidinin kullanılması, transgenik yapı kazanan parazitlerin CRISPR plazmidini de alması olasılığını artırır, bu nedenle ilaca dirençli parazitlerin, CRISPR hedefleme alanına eklenen işaretleyiciye sahip olma olasılığı daha yüksektir. Oran ters çevrilirse, transgenik yapı kazanan parazitlerin çoğunda CRISPR plasmid bulunmaz. Sonuç olarak, uyuşturucuya dirençli parazitlerin büyük çoğunluğu, CRISPR / CAS9 aracılı bölgeye özgü eklemeyle ilişkili olmayan rasgele entegrasyon vasıtasıyla transjenik yapı elde eder. 2) Transjenik yapı bir ilaca dirençli işaretleyici içeriyorsa ve karşılık gelen ilaç transjenik parazitleri seçmek için sinefungin ile birlikte kullanılıyorsa, transgenik yapı ile CRISPR plazmid arasındaki önerilen molar oran 1: 1&#39;dir. Bu strateji, transjenik suş yapımının en yüksek etkinliğini sağlar. 3) Transgenik yapı, negatif seçime bağlı olarak seçilebilir bir yapıcı içermiyorsaTransgenik parazitlerin elde edilmesi için sinefungin tarafından tek başına, transjenik yapı ile CRISPR plasmid arasındaki önerilen molar oran 5: 1&#39;dir. Bu tasarımın mantığı yukarıdaki ilk kılavuzdaki ile aynıdır. Protokol 5&#39;teki hem pirimetamin hem de sinefungin seçildiğinden, DHFR * mini geni ve CRISPR plasmidini hedefleyen SNR1 arasındaki oran 1: 1 olarak ayarlandı. Birlikte ele alındığında, burada özetlenen yöntemler, SNR1 2&#39;yi tanımlayan orijinal yayında anlatılamayacak bir ayrıntı seviyesine sahiptir. Bu protokoller; Özellikle, komut satırı sözdizimi, kullanılan programların ardışık düzenleri ve CRISPR / Cas9&#39;un kullanılması, fenotiplerden sorumlu yeni genleri belirlemek için gelecekteki çalışmalara yardımcı olmalıdır.

Ev sahibi aralığı, bir parazit prevalansının kapsamını belirler. Bazı parazitlerin buluntularını sınırlayan çok spesifik ev sahibi gereksinimleri vardır, diğerleri genelcilerdir. Böyle bir genelci Toxoplasma gondii ( T. gondii) &#39;dir . Bu parazit, tüm memelilere ve birçok kuşa bulaşabildiği için dünya çapında bulunur. İnsanlar da duyarlıdır ve tahminen küresel nüfusun yaklaşık 1 / 3&#39;ünün enfekte olduğu tahmin edilmektedir. Neyse ki, sağlam bir bağışıklık tepkisi normalde parazitin büyümesini kontrol eder, ancak bağışıklık sisteminin tehlikeye atıldığı durumlarda parazite kontrol edilemeyecek şekilde büyür ve genellikle ensefalik hastalıklara neden olabilir. Ayrıca, bu parazit, önceden enfekte olmamış kadınlara, parazit yayılımını hızla sınırlamak için bağışıklık sisteminden yoksun oldukları için, enfekte olmuşlarsa, doğumsal hastalıklara neden olabilir. Buna ek olarak, görme kaybına neden olabilecek oküler toksoplazmoz yükü vardır 1 . Bu reaso içinNs T. gondii , çalışma odağı haline geldi ve çalışması için geliştirilen birçok moleküler yöntemden dolayı Apicomplexan parazitleri için bir model oluşturdu. Burada tartışılacak iki yöntem Quantitative Trait Locus (QTL) haritalama ve Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR) / Cas9 gen editörüdür. QTL haritalama ve CRISPR / Cas9 düzenleme, sırasıyla, T. gondii virulans genlerini belirlemek ve / veya karakterize etmek için önceki çalışmalarda kullanılan ileri ve geri genetik yaklaşımlardır. Burada, bu yöntemler bir sinüs fınnın direnci (SNF r ) geni, TgME49_290860 ve onun ortologları ( SNR1 olarak açıklanmıştır) 2&#39;nin işlevini tanımlamak ve doğrulamak için birleştirilmiştir. T. gondii çok çeşitli ara konaklara bulaşmasına rağmen, yaşam döngüsünü tamamlamak için zararlıların bağırsak epitel hücrelerini geçmesi ve bulaştırması gerekir. Kediler, parazitin barındırdığı kesin ev sahipliği yaparlar.Ekspresyon aşamaları üretilir ve mayozla genetik rekombinasyon oluşur. Bir QTL çalışması yapmak için bir genetik çapraz oluşturmalı ve Toksoplazma durumunda bu, fenotipik bir özellik olan ebeveyn lekelerinde farklı olan iki farklı parazit türü geçirerek, bir kedi vasıtasıyla rekombinant nesli üretmektir 3 . Kedilere beslenmeden önce, ebeveyn suşları, dölün çift ilaç seçimi ile rekombinantların daha verimli tanımlanabilmesini sağlamak için ayrı ilaçlara dirençlidir. Bu amaçla T. gondii&#39;de üç ilaç kullanılmıştır; Direnç geni 5 olduğu ürasil fosforibosil transferaz ( FUDR ), direnç geni 6 olan Adenosin Kinaz ( AK ) ve sinefungin (SNF) olan adenozin arabinosid (ARA) 7 dir . Birkaç genetik haç varT. gondii için yaratıldı fakat sadece ME49-FUDR r X VAND-SNF r çaprazının 24 nesli, bütün genom sıralama (WGS) 8 kullanılarak genotiplendi. Bu, VAND ebeveyni, ilaca duyarlı VAND (VAND-SNFs) suşunun kimyasal mutajeneziyle sinefungine dirençli hale getirildiğinde, bu çapraz kullanılarak SNF direnç geninin haritalanması ve tanımlanması imkânını açtı ve VAND referans genomu, VAND- SNF s soyundan ötürü, soyu soyunun sinefungini dirençli hale getiren kalıtsal ebeveyn VAND-SNF r mutasyonu da dahil olmak üzere, soy WGS ve VAND-SNF referans genomu arasındaki tüm polimorfizmlerin tanımlanmasına izin verilir. SNF r soyındaki nedensel tek nükleotid polimorfizmini (SNP) tanımlamak için, verileri analiz etmek için çeşitli hesaplama tabanlı açık kaynak kaynakları kullanılabilir. ME49-genetik harita oluşturmak için,FUDR r X VAND-SNF r Çapraz REDHORSE yazılım paketi 9 , genetik geçişlerin genomik konumlarını doğru bir şekilde saptamak için anne ve babanın WGS hizalamalarını kullanmaktadır. Bu haritalama bilgisi daha sonra, Q istatistik programlama yazılımındaki &#39;qtl&#39; ​​paketi 10 ile uyumlu bir veri kümesi biçimlendirmek için fenotipik verilerle (yavrudaki SNF r ) birleştirilebilir ve burada QTL taraması ile ilişkili önemli lokusları ortaya çıkarabilir fenotip. QTL lokusunda yer alan nedensel SNP&#39;yi tanımlamak için, neslin WGS okumaları, SNP&#39;lerin VarScan mpileup2snp varyant arayan programı 12 kullanılarak çağrılabilir Bowtie 2 uyum programı 11&#39;i kullanarak sinüs fungus hassas VAND genomuna ayrı ayrı hizalanabilir. Bu SNP&#39;leri kullanarak, QTL lokusundan sonra SNF r&#39;de var olan polimorfizmler taranabilir ancak taranamazSNF&#39;nin soyunda. Bir genin kodlama bölgesinde tanımlanan nedensel SNP ile, SNF s geninin genetik modifikasyonu, ilaç direnci fonksiyonunu doğrulamak için bir SNF s soyunda gerçekleştirilebilir. CRISPR / Cas9 genom düzenleme sistemi kısa süre önce Toxoplasma 13&#39;te kuruldu ve bu parazitin karmaşık biyolojisinin araştırılması, özellikle laboratuar dışı uyarılmış suşlardaki genetik çalışmalar için önemli araçlar eklendi. WT Toxoplasma hücrelerinde yüksek derecede aktif Homolog Olmayan Sona Katlanma (NHEJ) aktivitesi nedeniyle, hedeflenen genom modifikasyonunun gerçekleştirilmesi zordur çünkü eksojen olarak girilen DNA son derece yüksek frekansta 14 genoma rasgele entegre edilmiştir. Lokusa spesifik modifikasyonun başarı oranını arttırmak için, homolog rekombinasyonun verimliliğini arttırmak ve / veyaE NHEJ etkinliği 15 , 16 . Bu yaklaşımlardan bir tanesi CRISPR / Cas9 sistemi. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, CRISPR / Cas9 sistemi, bölgeye özgü değişiklikleri uygulamada etkin ve tasarım için kolay 13 , 17 , 18 . Buna ek olarak, parazite 13 , 19 ekstra bir değişiklik yapmadan herhangi bir Toxoplasma suşunda kullanılabilir. CRISPR / Cas9 sistemi, 20 , 21 ve 22 fajları gibi mobil genetik elementlerin istilasını savunmak için kullanan Streptococcus pyogenes&#39;in uyarlanabilir bağışıklık sisteminden kaynaklanmaktadır. Bu sistem, RNA-kılavuzlu DNA endonukleaz enzimi Cas9&#39;u, hedefe çift sarmallı DNA kopması (DSB) sokmak için kullanır; bu, daha sonra repa olurHata endeksli NHEJ tarafından kısa indel mutasyonları vasıtasıyla hedef genlerin inaktive edilmesi veya hedef lokusunu tam olarak tasarlanan 23,24 ile değiştirmek için homolog yönlendirmeli rekombinasyon yoluyla tahliye edilir. Hedef spesifıklık, hedef DNA 22&#39;ye % 100 homologluk gösteren ayrı ayrı tasarlanan 20 nt diziyi içeren tek kılavuz RNA (gRNA) adlı küçük bir RNA molekülü tarafından belirlenir. GRNA molekülü ayrıca Cas9 tarafından tanımlanan, nükleazı hedef bölgeye yönlendiren ve Protospacer Bitişik Motifi (PAM, sıra &#39;NGG&#39;) olan 25 , 26 içeren imzalar içerir. Bu nedenle, gRNA molekülü ve PAM dizisi birlikte çalışarak genomda Cas9 bölünme yerini belirler. Biri, bölünme için farklı siteleri hedeflemek için kolayca gRNA dizisini değiştirebilir. CRISPR / Cas9 sistemi ilk kez Toxop&#39;da geliştirildiğindeLazanya, Cas9 nükleazını ve gRNA molekülünü ifade eden tek bir plasmid, hedefleme bölgesinde 13 , 17 DSB&#39;yi tanıtmak için kullanıldı. CRISPR / Cas9 sistemi, sadece homolog rekombinasyonla değil aynı zamanda ekzojen DNA 13&#39;ün homolog olmayan entegrasyonu ile alana spesifik genom modifikasyonunun verimliliğini büyük ölçüde arttırdığı gösterilmiştir 13 . NHEJ aktivitesi içeren vahşi türlerde bunu yapar. Bu nedenle, bu sistem esasen etkin genom düzenlemesi için herhangi bir Toxoplasma suşunda kullanılabilir. Tipik bir deneyde, hedefe spesifik CRISPR plazmiti ve hedefi değiştirmek için kullanılan DNA parçası, parazitlere birlikte transfekte edilir. Hedefi modifiye etmek için kullanılan DNA parçası, hedef lokus için homolog diziler içeriyorsa, homolog rekombinasyon, hedefin hassas şekilde değiştirilmesine izin vermek için CRISPR / Cas9 tarafından tanıtılan DSB&#39;yi onarmak için kullanılabilir. Öte yandan, eğer intRoduced DNA fragmanı homolog sekans içermez, yine de CRISPR / Cas9 hedefleme sitesinde entegre edilebilir. Sonuncusu genellikle seçilebilir işaretlerin eklenmesi veya negatif seçim 13&#39;e izin veren lokuslarda mutantların tamamlanması ile genlerin bozulması için kullanılır. Burada, SNR1 lokusu, CRISPR / Cas9&#39;un gen parçalanması ve transjenik parazitlerin üretimi için nasıl kullanılabileceğini göstermek için bir örnek oluşturmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1146">
	<tbody>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">T25 flasks</td>
			<td style="width:168px;">Corning</td>
			<td style="width:301px;">430639</td>
			<td style="width:439px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">HFF</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC-1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">T. gondii ME49 strain</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>50840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">T. gondii VAND strain</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PRA-344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">DMEM (No Sodium Bicarbonate)</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>12800017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Fetal Bovine Serum Premium Grade</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">L-Glutamine&#160; 200mM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Gentamicin (10 mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">Cell Scraper for Flasks</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10062-904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe 10ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Blunt needles 22g x 1&#34;</td>
			<td>BRICO Products</td>
			<td>BN2210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Nuclepore Filter 3.0 &#181;m, 25mm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>110612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Swin-Lok Filter Holder 25mm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>420200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Hemacytometer</td>
			<td>Propper MFG</td>
			<td>90001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Sinefungin</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>380-070-M001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">R&#160;</td>
			<td>The R Foundation</td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">J/qtl</td>
			<td>The Churchill Group</td>
			<td>http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bowtie2</td>
			<td>John Hopkins University</td>
			<td colspan="2">http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NCBI SRA Toolkit</td>
			<td>NCBI</td>
			<td colspan="2">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=toolkit_doc</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SAMtools</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>http://www.htslib.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VarScan</td>
			<td>Washington University, St Louis</td>
			<td>http://varscan.sourceforge.net/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MUMmer</td>
			<td>JCVI &#38; Univ Hamburg</td>
			<td>http://mummer.sourceforge.net/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #54467</td>
			<td>T. gondii CRISPR plasmid to cut the UPRT gene</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">pSAG1::CAS9-U6::sg290860-6</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #59855</td>
			<td>T. gondii CRISPR plasmid to cut the TG*_290860 SNR1 gene</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">pUPRT::DHFR-D</td>
			<td style="width:168px;">Addgene</td>
			<td style="width:301px;">Plasmid #58528</td>
			<td style="width:439px;">Template for DHFR* mini gene</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E0552S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">NanoDrop 2000</td>
			<td style="width:168px;">Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td style="width:439px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">LB Broth</td>
			<td style="width:168px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:301px;">DF0446-07-5</td>
			<td style="width:439px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>746495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">Adenosine triposhpate (ATP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">L-glutathione (GSH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:239px;">ECM 830 Electroporation System</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Electroporation Cuvette&#160; 4 mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:301px;">45-0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Crytal Violet</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td style="width:301px;">B21932-14</td>
			<td style="width:439px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">6-well TC plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:301px;">353046</td>
			<td style="width:439px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">24-well TC plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353935</td>
			<td style="width:439px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">Cover glass 12mm round</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89015-724</td>
			<td style="width:439px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:239px;">96-well TC plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Gibson Assembly Cloning Kit (Multi-fragment)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E5510S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Q5 High-Fidelity Polymerase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pyrimethamine</td>
			<td>TCI AMERICA</td>
			<td>P2037-1G</td>
			<td>Use cuation when using pyrimethamine resistant parasites - see Protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qtl mapping and crispr/cas9 editing to identify a drug resistance gene in toxoplasma gondii

Bilimsel bilgi, özünde mevcut teknolojilere ve yöntemlere bağlıdır. Bu makale, Apicomplexan parazit Toxoplasma gondii&#39;de bir ilaç direnci geninin tanımlanması ve doğrulanmasına izin veren iki yöntem, bir Whole Genome Sequence (WGS) tabanlı genetik harita kullanan Nicel Trait Locus (QTL) haritalama yöntemi ve yöntem Kümelenmiş Regularly Arası Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR) / Cas9 tabanlı gen düzenleme. QTL haritalama yaklaşımı, bir genomik bölge (ler) ve bir fenotip arasında bir korelasyon olup olmadığını test etmeyi sağlar. Bir QTL taramasını çalıştırmak için iki veri seti, bir rekombinant çaprazın soyuna dayalı bir genetik harita ve bu çaprazın her bir nesli içinde değerlendirilen nicelenebilir bir fenotip gerekir. Bu veri kümeleri daha sonra, fenotip ile ilişkili önemli yerleri tanımlamak için bir QTL taraması üreten R / qtl yazılımı ile uyumlu olacak şekilde biçimlendirilir. Bu arama işlemini büyük ölçüde daraltabilirse deOlası adayları indekslemek için QTL&#39;ler nedensel genin tanımlanması gereken bir takım genleri içeren bölgelere yayılır. Soyun WGS&#39;sine sahip olmak, gen düzeyinde nedensel ilaç direnci mutasyonunu tanımlamak için kritik önem taşıyordu. Tanımlandıktan sonra, aday mutasyon uyuşturucuya duyarlı parazitlerin genetik manipülasyonu ile doğrulanabilir. Genetik olarak T. gondii&#39;yi modifiye etmek için en kolay ve etkili yöntem CRISPR / Cas9 sistemidir. Bu sistem, hem tek bir plasmidde hem de genomik hedefi tamamlayıcı 20 bp dizisini içeren tek bir kılavuz RNA (gRNA) ve hedefe bir çift sarmal DNA kopması (DSB) üreten Cas9 endonükleazı kodlayan sadece 2 bileşenden oluşur; Onarımı, kırılma bölgesi çevresindeki dizilerin eklenmesine veya silinmesine izin verir. Bu makale sinefungin direncinden sorumlu geni doğrulamak ve transgenik parazitler oluşturmak için CRISPR / Cas9 tabanlı genom düzenleme araçlarını kullanmak için ayrıntılı protokoller sağlar.

Bu makale, ilaç direncinden sorumlu bir genin tanımlanması için art arda kullanılabilen çeşitli yöntemleri ayrıntılı olarak özetlemektedir ( Şekil 1 ). ME49-FUDR r X VAND-SNF r çaprazının 24 nesli, Protokol 1&#39;de tarif edildiği gibi ilaç sinefunjinine direnç açısından değerlendirildi. Genetik haritayı ve soyun SNF r fenotipini kullanarak bir QTL taraması R / Qtl - Protokol 2 ( Şekil 2 ). Bu, yaklaşık 1 Mbp&#39;yi kapsayan IX kromozomunda bir belirgin zirveye neden oldu. Bu bölgede nedensel mutasyon bulunduğu gerçeğidir. Nedensel mutasyonu belirlemek için, WGS&#39;nin yavrularından gelen okumalar, Bowtie2 - Protokol 3.1 kullanılarak VAND-SNF&#39;nin referans genomu ile uyumlu hale getirildi, SNP&#39;ler VarScan mpileup2snp - Protokol 3.2 kullanılarak çağrıldı ve VAND genomundaki QTL loküsü MUMmer - ProtocOl 3.3. QTL lokusundaki döl SNP&#39;leri çıkarıldı ve SNF r nesli bir SNP&#39;ye sahipken SNF s yok bir desen için çıkarıldı ve tarandı, bu da döl SNP&#39;leri VAND-SNF&#39;nin referans genomuyla karşılaştırıldığında elde edildiği için mümkün oldu ( Şekil 3 ) . Yalnızca bir SNP, SNR1 olarak adlandırılan bir varsayılan amino asit taşıyıcı geninde bir erken durdurma kodonuyla sonuçlanan bu modeli eşleştirdi. SNR1&#39;in SNF r direnç geni olduğu teyidi, CRISPR / Cas9 sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. T. gondii geni düzenlenmesi için tasarlanmış yeni bir CRISPR / Cas9 plazmiti, dölgede tanımlanan SNF r mutasyonunun yakınında SNR1 genini hedefleyen bir gRNA içeren yapılmıştır - Protokol 4 ( Şekil 4A ). CRISPR / Cas9 plazmidini hedefleyen SNR1 , bir SNF s WT parazit suşuna elektroporasyona tabi tutuldu ve kült sırasında dirençli mutantlar elde edildi.0.3 uM sinefungin içerisinde üretildi. CRISPR / Cas9 plasmidini hedefleyen UPRT ile elektroporasyon yapıldığında SNF r parazitleri elde edilememiştir. Birkaç SNF r CRISPR mutantı klonlandı ve SNR1 gRNA hedefinin etrafındaki bölge dizildi. Her mutant, SNR1 geninin kodlama dizisini bozan bir indel içeriyordu ( Şekil 4B ). Bu yöntem, NHEJ ( Şekil 5) veya HR ( Şekil 6 ) - Ek Dosya 2 yoluyla SNR1 lokusuna bir hedefleme yapısı eklemek için de kullanılabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig1.jpg" /> Şekil 1: Protokollerde Açıklanan Denemeler İçin Şematik İş Akışı. ME49-FUDR r X VAND-SNF r çaprazını kullanarak SNF r geninin belirlenmesinde ve teyit edilmesinde ana adımlar, t&#39;de belirtilen uygun Protokollere atıfta bulunularak gösterilmiştir.Onun makalesi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig2.jpg" /> Şekil 2: R / qtl SNF r Fenotipinde QTL Taramasını çalıştırmak için kullanılan komutlar. Protokol 2&#39;de özetlenen komutlar, qtl paketini kullanarak R&#39;de çalıştırılmıştır. Temsilci komutlar ve çizimler gösterilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig3.jpg" /> Şekil 3: Nazik SNP&#39;nin Konumu. Döl WGS okumaları, Bowtie 2 ile birlikte VAND-SNF&#39;nin referans genomu ile uyumlu hale getirildi, SNP&#39;ler VarScan ile çağrıldı ve karşılık gelen<html> Ing VAND QTL lokusu MUMmer ile tanımlandı. QTL loküsünde yer alan SNP&#39;ler bir elektronik tabloya alındı ​​ve nedensel SNP tespit edildi. SNF r nesli (sarı), SNF sinsisi (yeşil), SNF r SNP (kırmızı) (bkz. Veri Dosyası 3 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig4.jpg" /> Şekil 4: SNR1&#39;in SNF r Geni olarak CRISPR / Cas9 kullanılarak onaylanması. ( A ) SNR1 lokusunda CRISPR / Cas9 indel mutasyonları (yeşil) indükledi. ( B ) SNR1&#39;deki temsilci, iki farklı SNR1 spesifik CRISPR plasmidinden (sırasıyla C5 ve C6) kaynaklanıyor. RH, WT suşudur ve C5 ve C6, SNF r mutantlarıdır. (B referans olarak alınmıştırS = &quot;xref&quot;&gt; 2). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig5.jpg" /> Şekil 5. CRISPR / Cas9 kullanılarak yerleştirme mutajenezi. ( A ) CRISPR / Cas9 aracılı bölgeye özgü entegrasyon ile SNR1 lokusuna tamamlayıcı veya transgenik genlerin eklenmesi. Eklenen DHFR * mini geninin olası iki oryantasyonu ve tanımlama için kullanılan primerler, F1 / 2 ve R1 / 2, tanısal PCR&#39;lerde kullanılan oligoların başlatma yerlerini temsil eder. ( B ) Bir snr1 :: DHFR * klonunun diagnostik PCR&#39;leri , RH bir WT kontrolü olarak kullanılır. GRA1p PCR, genomik DNA&#39;nın kalitesini şablon olarak kontrol eden bir kontrol olarak dahil edilmiştir. Yıldız işaretleri, spesifik olmayan bantlara sahip şeritleri gösterir (Şekil 5B referansen alınmıştırCe 2 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig6.jpg" /> Şekil 6: CRISPR / Cas9 kullanılarak gen nakavt. T. gondii&#39;de CRISPR / Cas9 aracılı homolog gen değişimi için klasik bir tasarım. Bu durumda yerleştirilen transgenin yönü sabittir. F1 / R1, F2 / R2 ve F3 / R3, tanı PCR&#39;lerinde kullanılan oligoların priming alanlarını temsil eder. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Veri Dosyası 1: ME49-FUDR r X VAND-SNF r Çapraz Dosya fVeya R / qtl, &quot;csv&quot; Formatında kullanın. R / qtl format = &quot;csv&quot; seçeneğiyle yüklenebilen bir .csv dosyası. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_1.csv" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a> Veri Dosyası 2: (chrid txt, genotype txt, markerpos.txt, mname.txt, fenonames.txt ve fenos.txt). ME49-FUDR r X VAND-SNF r Çapraz Dosyalar R / qtl &quot;gary&quot; Formatında kullanılır. Format = &quot;gary&quot; seçeneği ile R / qtl&#39;ye yüklenebilen altı .txt dosyası. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_2.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a> Veri Dosyası 3. SNF r&#39;de Progeny SNP&#39;li e-tablo r <stronG&gt; QTL Locus. Soy SNP&#39;leri içeren bir çalışma sayfası ve ebeveynlerin ve çarmıhın soyları ile fenotipik verileri içeren ikinci bir çalışma sayfası içerir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_3.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a> Ek Dosya 1: Ek Protokol Ayrıntıları. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Supplementary_File_1_-_101916.docx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a> Ek Dosya 2: Protokol 5 - Negatif Seçimin SNR1 Lokusunda Genetik Tamamlama veya Transgenik Suş Oluşturma Kullanımı. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Supplementary_File_2_-_101916.docx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a></a>

Watch this Scientific Journal Video about QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii at JoVE.com

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Detaylar, Toxoplasma gondii&#39;de bir ilaca direnç genini tanımlamak için bütün genom dizisi tabanlı bir genetik harita ile QTL haritalamasının nasıl kullanılacağı ve bunun, bir genomik hedefi verimli bir şekilde düzenleyen CRISPR / Cas9 sistemi ile nasıl doğrulanabileceği üzerine sunulmaktadır; bu durumda Ilaç direnci geni.

QTL Haritalama ve CRISPR / Cas9 Düzenlemesi, bir İlaç Direnç Geninin Belirlenmesi için<emToksoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

CRISPR/Cas9 Protein gen düzenleme için mikroenjeksiyon kanal yayın balığı, Ictalurus yılan, embriyo içine

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Verimli üretim ve Model sistem Danio rerio kimlik CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan Gene altını gizleme

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen düzenleme yapmak koşullu mutantlar, insan sıtma parazit P. falciparum için

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-boru Elektroporasyon tarafından aracılı hassas gen düzenleme

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak Trypanosoma cruzi 'Nin Amastigote aşamasına doğrudan bir gene Knockout tanıtımı

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Akut Miyeloid Lösemi Hücrelerinde CRISPR/Cas9 Ribonükleoprotein ile RUNX1 Intronic Susturucunun Transkripsiyonel Rolünün İncelendirin

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

Filamentöz Ascomycete Huntiella omanensis'te CRISPR-Cas9 Aracılı Genom Düzenleme

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...