Name: a fluorescence-based lymphocyte assay suitable for high-throughput screening of small molecules
Uploaded: 2017-03-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Merck Frosst Start-up middelen die door Universiteit van Montreal. We danken Drs Jean Duchaine en Dominic Salois van de High-throughput platform aan het Instituut voor Onderzoek in de Immunologie en Kanker voor hun discussie, commentaar en feedback. Moutih Rafei houdt een Fonds de la Recherche en Santé du Québec Junior 1 Award.

Alle dieren protocollen werden goedgekeurd door de Animal Care Committee van de Universiteit van Montreal. De muizen werden gedood door een geleidelijke inademing van CO 2 tot er geen vitale functies waargenomen gevolgd werden door cervicale dislocatie. De procedure werd uitgevoerd door een gecertificeerd persoon uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de dieren werden gedood op een humane manier en op basis van de aanbevelingen van de Canadese Raad over Animal Care. 1. Bereiding van spl...

<ol>
	<li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+were+new+medicines+discovered.">How were new medicines discovered.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).</li><li>Macarron, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+high-throughput+screening+in+biomedical+research.">Impact of high-throughput screening in biomedical research.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).</li><li>Lokey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+chemical+genetics:+progress+and+obstacles+on+the+path+to+a+new+pharmacopoeia.">Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia.</a> Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).</li><li>Hall, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoproteomics-driven+drug+discovery:+addressing+high+attrition+rates.">Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates.</a> Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).</li><li>Pruss, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+screening+strategies+for+neurodegenerative+diseases:+a+pathway+to+discover+novel+drug+candidates+and+potential+disease+targets+or+mechanisms.">Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms.</a> CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).</li><li>St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+chemical+genetics+in+yeast+for+discovery+of+chemical+probes+targeting+metabolism.">Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism.</a> Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).</li><li>Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O'Connell, J., Petrillo, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case+study:+impact+of+technology+investment+on+lead+discovery+at+Bristol-Myers+Squibb.">Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb.</a> Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Walters, W. P., Namchuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+screens:+how+to+make+your+hits+a+hit.">Designing screens: how to make your hits a hit.</a> Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).</li><li>Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+screens+as+a+renewed+approach+for+drug+discovery.">Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery.</a> Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).</li><li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis.">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).</li><li>Moran, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+signal+strength+in+Treg+and+iNKT+cell+development+demonstrated+by+a+novel+fluorescent+reporter+mouse.">T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse.</a> J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).</li><li>Kovacic, N., M&#252;thing, J., Marusic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistological+and+Flow+Cytometric+Analysis+of+Glycosphingolipid+Expression+in+Mouse+Lymphoid+Tissues.">Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues.</a> J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+estimation+of+DNA+and+RNA+content+in+intact+cells+stained+with+hoechst+33342+and+pyronin+Y.">Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y.</a> Cytometry. 2, 143-150 (1981).</li><li>Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening:+seeing+is+believing.">High content screening: seeing is believing.</a> Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).</li><li>An, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+assays.">Fluorescence-based assays.</a> Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).</li><li>Kishimoto, H., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+TCR+ligation+without+costimulation+causes+rapid+onset+of+Fas-dependent+apoptosis+of+naive+murine+CD4++T+cells.">Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells.</a> J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).</li><li>Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-7+mediates+the+homeostasis+of+naive+and+memory+CD8+T+cells+in+vivo.">Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo.</a> Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).</li><li>Jiang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+IL-7,+a+key+lymphotrophin.">Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).</li><li>Koenen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutually+exclusive+regulation+of+T+cell+survival+by+IL-7R+and+antigen+receptor-induced+signals.">Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals.</a> Nat Commun. 4, 1735 (2013).</li><li>Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+4+(IL-4)+or+IL-7+prevents+the+death+of+resting+T+cells:+stat6+is+probably+not+required+for+the+effect+of+IL-4.">Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4.</a> J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).</li><li>Hawkins, C. J., Vaux, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+Bcl-2+family+of+apoptosis+regulatory+proteins+in+the+immune+system.">The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system.</a> Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).</li><li>Sumantran, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+chemosensitivity+assays:+an+overview.">Cellular chemosensitivity assays: an overview.</a> Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).</li><li>Huh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+system+for+screening+hair+growth-promoting+agents.">A cell-based system for screening hair growth-promoting agents.</a> Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).</li><li>Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+signal+transduction:+opening+the+black+box.">TCR signal transduction: opening the black box.</a> J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).</li><li>Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+costimulation+prevents+cell+death+during+primary+T+cell+activation.">CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation.</a> J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).</li><li>Michels, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+selection+of+small+molecules+to+alter+allele-specific+MHC+class+II+antigen+presentation.">Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation.</a> J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).</li></ol>

Verscheidene uitlezing werkwijzen zijn gebruikt voor de ontwikkeling van gevoelige en betrouwbare HTS assays. Deze omvatten colorimetrische, lichtgevende of fluorescerende methoden. Hoewel colorimetrische methoden zijn eenvoudig te installeren, ze vereisen meerdere toevoegingen van chemicaliën die kunnen interfereren of verstoren van de cellen getest. 23 Verder zij geen dynamische beoordeling van een biologische respons mogelijk de farmacologische werking wordt gesteld op een specifiek eindpunt....

High throughput screening (HTS) is een bewezen strategie voor de identificatie van nieuwe therapeutische moleculen of herpositionering van FDA-goedgekeurde geneesmiddelen in nieuwe medische indicaties ingeburgerd. 1 nu toe, kan de bereikte HTS succes worden gemeten door de overvloed van eerder ontdekte drugs. Bijvoorbeeld de tyrosine kinase inhibitor lapatinib gebruikt voor de behandeling van borstkanker, sitagliptine; een dipeptidylpeptidase-4 (DPP-4) -remmer gebruikt als een anti-hyperglycemische drugs, en de orale Bcr-Abl tyrosine kinase inhibitor dasatinib gebruikt voor de behandeling van chronische myelogene leukemie geven enkele voorbeelden van een lange lijst van goedgekeurde geneesmiddelen oorspronkelijk ontdekt door HTS. 2 Hoewel de productiviteit van de farmaceutische industrie onlangs heeft last van een gebrek in de ontdekking van nieuwe chemische entiteiten, de kans op een succesvolle geneesmiddelen kan worden verbeterd door een toename van het aantal pre-klinische candidates weergeven van modulerende biologische / biochemische eigenschappen. Bijgevolg kan de ontwikkeling van nieuwe assays HTS aangepast voor fenotypische screening potentieel belangrijke farmacologische instrumenten verschaffen voor de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen treffers bieden. 3, 4, 5, 6 Verder kunnen HTS nu worden uitgevoerd in een sneller tempo door belangrijke technologische veranderingen in de afgelopen jaren ook op maat gemaakte flexibele robot installaties nieuwe uitlezing technologieën of omvangrijke miniaturisatie. 2, 7 Onder de factoren die bijdragen aan de groeiende belangstelling voor het gebruik van fenotypische screening (aka forward farmacologie) is de perceptie dat het focussen op de functionele gevolgen in plaats van ongenuanceerd reductionistische aannames ten aanzien van moleculaire doelwitten (target-based screening / biochemische reacties) is de kans groter naar sho<html> w klinische werkzaamheid. Zo fenotypische screening houdt de belofte om nieuwe potentiële therapeutische verbindingen en moleculaire wegen van nog onbehandelbare ziekten bloot te leggen. 2 Goed remmers of activatoren voor een gegeven doelwit of celfunctie te identificeren, is een zeer gevoelige en betrouwbare test nodig om onderscheid te maken tussen bonafide klappen en valse positieven. Dus, wat maakt een goede test? De kwaliteit van een gegeven test moet eerst worden beoordeeld door de signaal-ruisverhouding (weerspiegeld door een Z-factor). 8 Ten tweede moet het gerichte effect of het doel van het scherm duidelijk worden vastgesteld. Zo kunnen functionele celtechnieken belangrijke voordelen voor screening receptor in tegenstelling tot een assay specifiek ontworpen om ligand-receptorbinding te bepalen. De reden hiervoor is dat de laatste benadering niet kan maken tussen agonist en antagonist liganden.ss = &quot;xref&quot;&gt; 9 daarentegen een celgebaseerde aanpak waarschijnlijk effectiever receptorfunctie direct kan worden beoordeeld in een biologisch fenotype te zijn (proliferatie, stoppen van de celcyclus, apoptose en / of differentiatie). Wel moet worden opgemerkt dat biochemische assays belangrijke voordelen kan bieden via fenotypische testen zoals inbreuk maken op een specifieke intracellulaire doelwit. Een goed geoptimaliseerde biochemische assay zullen over het algemeen minder gegevens scatter dan een fenotypische screening en vereenvoudigt nadien onderzoeken die op de drug moleculaire werkingsmechanisme. De belangrijkste nadeel van doelgerichte of biochemische assays is de kans op het amplificeren van het aantal valse positieve hits die aspecifieke doelen kunnen beïnvloeden wanneer getest in een biologisch systeem (verlies van de specificiteit oorspronkelijk onderzocht in de biochemische assay). 10 Hoewel een gevestigde cut-off point tussen negatieve en positieve treffers het aantal valse positieven te minimaliseren in de primaire screening, het gebruik van een fysiologisch relevante systeem nabootsen van de natuurlijke cellulaire omgeving zoals intacte cellen, weefsels of hele hele dier blijft de kern van het testontwerp slinger. Daarom fenotypische screening maakt lead discovery met gewenste biologische / fenotypische effecten op ziekten zonder geïdentificeerde drug targets zonder voorafgaande kennis van activiteiten of wijze van optreden van de verbinding. 11 De hierin studie heeft betrekking op de ontwikkeling en het testen van een geoptimaliseerd en reproduceerbare fenotypische screening op basis van twee belangrijke componenten: een in de handel verkrijgbaar muismodel en een geclusterde sub-familie van chemische verbindingen. Wat het diermodel, de assay berust op het gebruik van lymfocyten afgeleid van een muizenstam (Nur77 GFP) herbergt een bacterieel kunstmatig chromosoom bevat een cassette waarin de expressie van groen fluorescent eiwit (GFP) wordt aangedreven door The Nur77 promotor. 12 Het kenmerk van deze stimulering is gebaseerd op het feit dat Nur77 een directe vroege gen opgereguleerd na T-celreceptor (TCR) of B-cel receptor (BCR) stimulatie. 12 Wat betreft de werkwijze het screenen zelf, is een aanpak om het vermijden van de screening van triviale analogen tegelijk de tijd die nodig is om een grote chemische library (&gt; 10 5 verbindingen) te beoordelen. Om dit te doen, een database van chemische verbindingen geselecteerd door geneesmiddelen chemici gebruik van virtuele screening instrumenten werd benut om topologisch soortgelijke verbindingen met behulp van bekende actieve zaad structuren als verwijzingen te identificeren. Deze aanpak liet ons toe om te screenen 4398 verbindingen waarmee een totaalbedrag bibliotheek van meer dan 136.000 chemische entiteiten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="725">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:211px;">Nur77GFP mice</td>
			<td style="width:157px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:135px;">Mouse strain No. 016617</td>
			<td style="width:224px;">An in house colony was established at our animal facility&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">96 wells-U culture plates, sterile</td>
			<td style="width:157px;">VWR International</td>
			<td style="width:135px;">10062-902</td>
			<td style="width:224px;">T-cell activation using the magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:211px;">70&#181;m cell strainer, sterile</td>
			<td style="width:157px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:135px;">352350</td>
			<td style="width:224px;">Generation of splenocytes cell suspension</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:211px;">5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile</td>
			<td style="width:157px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:135px;">352058</td>
			<td style="width:224px;">Generation of splenocytes cell suspension</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:211px;">50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile</td>
			<td style="width:157px;">VWR International</td>
			<td style="width:135px;">89039-656&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Generation of splenocytes cell suspension</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:211px;">10 ml syringe without needle, sterile</td>
			<td style="width:157px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:135px;">305482</td>
			<td style="width:224px;">To mash the spleen</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;">T-25 culture flask</td>
			<td style="width:157px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:135px;">690 175</td>
			<td style="width:224px;">To incudabte B cells during activation</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:211px;">5 ml cell culture dish, sterile</td>
			<td style="width:157px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:135px;">627 160</td>
			<td style="width:224px;">To mash the spleen</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">450-200-EL&#160;&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:211px;">RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">350-002-CL&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:211px;">MEM non-essential amino acids</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">321-010-EL&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">HEPES free acid 1 M</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">330-050-EL&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Sodium pyruvate solution (100mM)</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">600-110-EL&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:211px;">Fetal Bovine Serum (FBS)&#160;</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">080-910&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:224px;">Component of flow-cytometry buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">2-Mercaptoethanol (55mM)</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">21985-023</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:211px;">T- Cells isolation kit</td>
			<td style="width:157px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">19851</td>
			<td style="width:224px;">To isolate T cells</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:211px;">B- Cells isolation kit</td>
			<td style="width:157px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">19854</td>
			<td style="width:224px;">To isolate B cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">11452D</td>
			<td style="width:224px;">To activate T cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Cell isolation magnet</td>
			<td style="width:157px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">18000</td>
			<td style="width:224px;">To isolate T cells and remove the magnetic beads&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L)</td>
			<td style="width:157px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:135px;">115-006-068</td>
			<td style="width:224px;">To stimulate B cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Recombinant Murine IL-7</td>
			<td style="width:157px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">217-17&#160;</td>
			<td style="width:224px;">To support T-cell survival during activation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Recombinant CD40L</td>
			<td style="width:157px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">8230-CL/CF</td>
			<td style="width:224px;">To stimulate B cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Anti-mouse CD3 antibody</td>
			<td style="width:157px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">561799</td>
			<td style="width:224px;">To stain T cells for flow-cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Anti-mouse CD19 antibody</td>
			<td style="width:157px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">553786</td>
			<td style="width:224px;">To stain B cells for flow-cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:211px;">Biomed FXp</td>
			<td style="width:157px;">PerkinElmer Inc.</td>
			<td style="width:135px;">A31842</td>
			<td style="width:224px;">To re-suspend cells after 24 hours incubation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Opera Phenix High Content Screening System</td>
			<td style="width:157px;">PerkinElmer Inc.</td>
			<td style="width:135px;">HH14000000</td>
			<td style="width:224px;">To analyze GFP/Hoechst signal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based lymphocyte assay suitable for high-throughput screening of small molecules

High-throughput screening (HTS) is momenteel de steunpilaar voor de identificatie van chemische entiteiten kan moduleren biochemische reacties of cellulaire processen. Met de vooruitgang van biotechnologie en de hoge translationele potentieel van kleine moleculen, een aantal innovatieve benaderingen geneesmiddelen hebben ontwikkeld, waarbij de oplevende belangstelling voor het gebruik van HTS verklaart. De oncologie veld is op dit moment de meest actieve onderzoeksgebied voor drug discovery, zonder belangrijke doorbraak voor de identificatie van nieuwe immunomodulerende verbindingen targeting-transplantatie gerelateerde complicaties of auto-immune aandoeningen. Hier presenteren we een nieuwe in vitro muizen-fluorescentie gebaseerde assay lymfocyt gemakkelijk worden aangepast voor de identificatie van nieuwe immunomodulerende verbindingen. Deze test maakt gebruik van T- of B-cellen afkomstig van een transgene muis waarin het Nur77 promotor drijft GFP expressie na T- of B-celreceptor stimulatie. Aangezien de GFP intensiteit weerspiegelt deactivatie / transcriptionele activiteit van de doelcel, onze assay bepaalt een nieuw hulpmiddel om het effect van bepaalde verbinding (en) aan cellulaire / biologische reacties bestuderen. Zo werd een primaire screening uitgevoerd onder gebruikmaking 4398 verbindingen in afwezigheid van een &quot;target hypothese&quot;, die leidde tot de identificatie van mogelijke treffers 160 tonen immunomodulerende activiteiten. Zo is het gebruik van deze test is geschikt voor drug discovery programma verkennen grote chemische libraries voorafgaand aan in vitro / in vivo studies verder valideren.

Het ontwerp van de HTS assay Twee belangrijke factoren rekening gehouden bij het ontwerpen van de hierin fluorescentie. Eerst moesten we een fysiologische aandoening waarbij T- of B-celactivering een aandoening (bijvoorbeeld graft-versus-host ziekte) zou betekenen repliceren. Ten tweede moet de beoordeling van cellulaire activering worden uitgevoerd met een gevoelige en kwantitatieve methode. Fluorescentie is tegenwoordi...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules at JoVE.com

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

We presenteren in de huidige studie een nieuwe fluorescentie gebaseerde assay middels lymfocyten afkomstig van een transgene muis. Deze test is geschikt voor high-throughput screening (HTS) van kleine moleculen begiftigd met de hoedanigheid van het remmen of bevorderen van lymfocyt activering.

Een fluorescentie gebaseerde lymfocyt Assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput screening voor Breed-spectrum Chemische Remmers van RNA-virussen

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay om Phenotype<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Association, Invasion, en replicatie in macrofagen

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

High-throughput Kwantitatieve real-time RT-PCR assay voor het bepalen van expressieprofielen van de typen I en III interferon subtypen

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Oprichting van een High-throughput Setup voor het screenen van kleine moleculen die Moduleer c-di-GMP Signalering in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

-Microscopie gebaseerde testen voor high-throughput screening van Host factoren die betrokken zijn in<em&gt; Brucella</em&gt; Infectie van Hela cellen

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Cel-vrije biochemische fluorimetrische enzymatische Assay voor High-throughput meting van lipide peroxidatie in High Density lipoproteïne

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Een High-throughput Platform voor de Screening van Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Een High-throughput Shigella-specifieke bactericide Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...